Microfabricated פוסט מערך גלאים (mPADs): גישה לבודד כוחות מכניים

סיכום

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד לפברק ולנצל microfabricated גלאי מערך פוסט (mPADs) כדי להעריך מודולציות של contractility הסלולר.

תקציר

בסרטון הזה, אנו מציגים את הגישה שלנו למדוד כוחות המתיחה הסלולר באמצעות מערך microfabricated של ההודעות. כוחות גרירה נוצרות באמצעות שרירן-אקטין אינטראקציות לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגיה שלנו. במהלך הפיתוח, הם מאפשרים לתאי לנוע ממקום אחד למשנהו כדי ליצור את המבנים הראשונים של רקמות. כוחות גרירה לעזור בתהליכי הריפוי. הם נחוצים סגר תקין של הפצעים או הגירה זוחלת של לויקוציטים דרך הגוף שלנו. אלה אותם כוחות יכול להיות מזיק לבריאות שלנו במקרה של גרורות סרטן או צמיחה של כלי הדם אל הגידול. השיטה הנפוצה ביותר שבאמצעותה ללמוד תאים במבחנה כבר להשתמש בכוס או בצלחת קלקר. עם זאת, נוקשות של מצעים עושה את זה בלתי אפשרי מבחינה פיזית למדוד כוחות המתיחה התא, ויש שיטות מעטים יחסית ללמוד כוחות המתיחה. המעבדה שלנו פיתחה טכניקה כדי להתגבר על המגבלות האלה. השיטה מבוססת על מערך אנכי של cantilevers גמישה, את הנוקשות ואת קנה המידה של גודל אשר כזה תאים בודדים המפוזרים על פני cantilevers רבים להטות אותם בתהליך. העמודים אנו משתמשים הן 3 מיקרומטר בקוטר 10 מיקרומטר גבוה, והם מוגדרים במערך רגיל עם ריווח 9 מרכז אל מרכז מיקרומטר. אבל המימדים הללו פיזית יכולים להיות מגוונים בקלות כדי להתאים מגוון של מחקרים. אנחנו מתחילים עם מאסטר סיליקון, אבל את ההודעות הסופי עשויים גומי סיליקון שנקרא פולי (דימתיל siloxane), או PDMS. אנחנו יכולים למדוד את deflections תחת מיקרוסקופ ו לחשב את הגודל ואת הכיוון של כוחות המתיחה הנדרש כדי להפיק את deflections ציין. אנו קוראים מצעים אלה microfabricated שלאחר מערך גלאים, או mPADs. כאן, אנו יראה לכם כיצד אנו לפברק ולהשתמש mPADs להעריך מודולציות של contractility הסלולר.

פרוטוקול

הסיליקון יחידת ייצור עובש

ליתוגרפיה

חומרים:

• 75 פרוסות הסיליקון מ"מ
• SU-8 2 photoresist שלילית (Microchem, בוסטון, MA)
• N2

שיטה:

1. מייבשים רקיק סי ב 120 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
2. UV האוזון לטיפול פני השטח במשך 7 דקות כדי להסיר חומרים אורגניים.
3. משטח N2 מכה להסיר חלקיקים.
4. החל SU-8 2 לכסות 70% משטח (~ 10 מ"ל עבור רקיק 75 מ"מ).
5. ספין בסל"ד 2000 למשך 20 שניות עם האצת סל"ד / s 300.
6. מניחים את פרוסות על פלטה חמה ו הרמפה מ בטמפרטורת החדר עד 95 ° C.
7. Softbake photoresist במשך 15 דקות על 95 ° C.
8. המבול לחשוף רקיק עבור 20-25 mJ/cm2 מנה ב 365 ננומטר (I-line) כדי ליצור את השכבה התחתונה.
9. החל SU-8 2 עבור שכבת photoresist השני.
10. ספין בסל"ד 550 למשך 20 שניות עם האצת סל"ד / s 300 עבור הסרט כ 11 מיקרומטר עובי.
11. מניחים את פרוסות על פלטה חמה ו הרמפה מ בטמפרטורת החדר עד 65 ° C.
12. Softbake רקיק על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
13. הרמפה פלטה חשמלית מ 65 ° C עד 95 ° C.
14. Softbake רקיק במשך 55 דקות ב 95 ° C.
15. רקיק מצננים לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
16. יישור מסכה mPAD על פרוסות סיליקון עבור ולחשוף 95-100 mJ/cm2 מנה ב 365 ננומטר (I-line).
17. מניחים את פרוסות על פלטה חמה ו הרמפה מ בטמפרטורת החדר עד 95 ° C.
18. לאחר חשיפה לאפות את photoresist במשך 25 דקות על 95 ° C.

לפתח

חומרים:

• צלחות זכוכית 100mm (5)
• פרופילן גליקול מתיל אתר אצטט (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

שיטה:

1. במנדף כימי, למלא five מנות עם PGMEA (2), IPA, הקסאן ו (2).
2. החזק רקיק ב 1 PGMEA למשך 10 שניות
3. להתסיס רקיק עבור 50 שניות
4. העברת רקיק PGMEA 2 עם המניסקוס של PGMEA.
5. להתסיס למשך 5 שניות.
6. העברת רקיק IPA עם המניסקוס של PGMEA.
7. להתסיס למשך 20 שניות.
8. העברת רקיק IPA 1.
9. להתסיס למשך 5 שניות.
10. העברת רקיק IPA 2.
11. להתסיס למשך 5 שניות.
12. להסיר במהירות רקיק מ IPA 2 עם המניסקוס של IPA ויבש עם N2
13. בדיקת דפוס.
14. Hardbake רקיק ב 120 מעלות צלזיוס למשך 14-20 שעות כדי לחצות הקישור SU-8.
15. חותכים את פרוסות עם חותך יהלומים
16. הר רקיק בשקופית זכוכית באמצעות אפוקסי
17. Fluorosilanize רקיק (ראה ההוראות דפוס שכפול)

דפוס של שכפול mPADS

שלילי עובש

חומרים:

• אלומיניום חד פעמי במשקל הסירה
• Polydimethylsiloxane (PDMS) בסיס & ריפוי סוכן (דאו, Midland, MI)
• גילוח
• Silane: (tridecafluoro-1-,1,2,2 tetrahyrooctyl)-1-trichlorosilane
• זכוכית שקופית
• זכוכית פיפטה פסטר

שיטה:

1. מערבבים PDMS 10:01 על ידי משקל דגה תחת ואקום שעה 1 כדי להסיר בועות.
2. סיליקון מקום מאסטר עובש בסירה אלומיניום.
3. יוצקים 50-60 גרם של PDMS על עובש שני סירה אלומיניום.
4. דגה תחת ואקום במשך 30 דקות כדי להסיר בועות.
5. מכה מעל פני השטח, בועות אוויר שנלכדו בתוך PDMS עם הפיצוץ מהירה של N2.
6. סירה מקום בתנור הסעה ב 110 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עד PDMS איתנה.
7. גזור משם סירה אלומיניום.
8. עם סכיני הגילוח, לחתוך PDMS מתחת סיליקון מאסטר.
9. פיל PDMS הרחק מאסטר סיליקון לאט בתנועה מתמדת בכיוון אחד כדי למנוע הריסת האב.
10. בדוק מאסטר סיליקון עבור נזק.
11. גזור עובש שלילי ל 4 חתיכות.
12. חזור על שלבים 1-10 עבור קבוצה גדולה של תבניות שליליות.
13. פלזמה חמצן לטיפול עובש שלילית עבור 1.5 דקות כדי להפעיל את פני השטח, או
14. האוזון לטיפול עובש שלילי במשך 10 דקות כדי להפעיל את השטח.
15. המקום תבניות שלילי dessicator עם תכונות mPAD חשוף.
16. מורחים 250-500 μL של silane בשקופית זכוכית במרכז של dessicator
17. זכוכית מקום מרעה פיפטה עם μL 150-200 של silane בקצה בתוך dessicator.
18. תא אבק להתאדות תבניות שליליות silane ומעיל עבור> 14 שעות.

mPADS

חומרים:

• Polydimethylsiloxane (PDMS) בסיס & ריפוי סוכן (דאו, Midland, MI)
• הפה רחב להעביר pipettes הפנויה
• 2 "x 3" זכוכית שקופיות
• זכוכית הסופר
• N2

שיטה:

1. מערבבים PDMS 10:01 על ידי משקל דגה תחת ואקום שעה 1 כדי להסיר בועות.
2. תחרה תבניות שליליות silanized לתוך "לחצות"
3. פיפטה PDMS לתוך תבניות שליליות, כך התכונות מכוסים באופן מלא בעובי 1 מ"מ.
4. חכה 30 דקות עבור כל בועות האוויר ב PDMS לעלות אל פני השטח.
5. ב השבתה '30, אבק 22x22mm (מס' 2) זכוכית coverslips עם זרם של N2.
6. פלזמה חמצן לטיפול שקופיות הזכוכית חצאים במשך 1.5 דקות לנקות ולהפעיל את הכוס
7. מכה מעל פני השטח, בועות אוויר שנלכדו בתוך PDMS עם הפיצוץ מהירה של N2.
8. להניח בעדינות את קצה של כוס coverslip על PDMS עם הצד פלזמה לנקות מול PDMS. לאט לאט להוריד את השקופית זכוכית כך מלא PDMS המגעים משטח זכוכית כולו ולמנוע בועות אוויר שנלכדו מתחת מקבל שקופיות הזכוכית.
9. המקום כינס תבניות בתנור הסעה ב 110 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות כדי לרפא לחלוטין.
10. הסר תבניות מהתנור ולתת להם מגניב RT.
11. החזק שקופיות הזכוכית ביד אחת על גבי ולאט לקלף ממנו את התבנית שלילי שלילי מלמטה כדי לשחרר את mPAD.
12. בדוק את mPAD תחת מיקרוסקופ עבור הודעות התמוטט.
13. Re-silanize עובש באמצעות פלזמה silane כל ארבע יציקות. החיים עובש שלילית עבור שכפול טובה הוא כ 6-20 מטיל.

תאים מתזמן על mPADS

ביול

חומרים:

• PDMS בולים UCP (ראה טיין, J & חן, CS, בשיטות של הנדסת רקמות, 2001, עמ '113-120).
• אתנול (100% ו - 70%)
• מים Deionized מעוקר
• 50 UG / פיברונקטין האדם מ"ל מים סטריליים deionized (BD Biosciences)
• 5 UG / ml פתרון DiI מסונן עם קרום 0.2 מיקרומטר (D-3886, בדיקות מולקולריות, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, הר הזיתים, NJ)
• מאגר 1X פוספט פתרון.
• 100 מ"מ x 25 מ"מ צלחת פטרי (4)
• 150 מ"מ x 25 מ"מ צלחת פטרי (2)
• רדיד אלומיניום
• N2
• מלקטת
• סטרילי הוד

שיטה:

1. PDMS עודף חתוך מ mPADs
2. אם את חותמת PDMS כבר השתמשו בעבר, sonicate בולים אתנול 100% במשך 5 דקות לקרצף ממנו חלבונים מזהם.
3. בשכונה סטרילי, החזק בולים על צדם עם פינצטה ויבש עם N2 לאחר טבילה בולים אתנול 100% טרי מים סטריליים
4. מניחים בצלחת פטרי 150 מ"מ עם עובד כלפי מעלה.
5. Aliquot טיפות של תמיסת פיברונקטין חותמת על כל אחד. התחל עם פינות על כל אחד הבולים, אז את הקצוות, ולבסוף באזורים הפנימיים. בתחילה PDMS את פני השטח של הבול הוא הידרופובי, אבל הופך הידרופילי כמו חלבון adsorbed. עבודה "מבפנים החוצה" משנה את זווית המגע של PDMS כך עוצמת קול נמוכה יותר של פתרון פיברונקטין הוא צריך מעיל מלא את החותמת.
6. בואו לשבת במשך שעה 1 בשכונה של חלבון ספיחה.
7. לשטוף עם מים בולים DI ע"י שפיכת צלחת ולתת את מפלס המים לעלות על הבולים.
8. לשטוף בולים בצלחת פטרי 100 מ"מ מלא במים DI.
9. הסר ויבש עם N2.
10. לטפל mPADS אוזון במשך 7 דקות כדי להפעיל את השטח עבור ביול.
11. מתחת למכסה המנוע, חותמת mPADS ידי הצבת קצה חותמת על mPAD בעדינות הורדת ליצור קשר מלא. קלות הברז העליון של הבול עם פינצטה כדי להבטיח התחומים יש קשר טוב אבל להיזהר לא לקרוס את ההודעות.
12. מוציאים בזהירות בולים עם פינצטה.
13. לצלול mPADS בצלחת פטרי 100 מ"מ עם אתנול 100% ~ 15 שניות. שמור microneedles מ dewetting במהלך ההעברה על ידי העברת במהירות בין הכלים.
14. לצלול mPADS בצלחת פטרי 100 מ"מ עם אתנול 70% ~ 15 שניות.
15. לצלול mPADS בצלחת פטרי 100 מ"מ עם מים עבור DI ~ 15 שניות.
16. לצלול mPADS ב המנה השנייה פטרי 100 מ"מ עם מים עבור DI ~ 15 שניות.
17. לצלול mPADS בצלחת פטרי 150 מ"מ עם מים די.
18. לצלול mPADS בצלחת פטרי 150 מ"מ עם 100 מ"ל של תמיסת DiI.
19. מכסים ברדיד אלומיניום ומשרים למשך שעה 1.
20. לצלול mPADS בצלחת פטרי 100 מ"מ עם מים עבור DI ~ 15 שניות.
21. לצלול mPADS בצלחת פטרי 150 מ"מ עם 10 מ"ל של Pluronics 2% 90 מ"ל של PBS על ריכוז כולל של Pluronics 0.2%.
22. מכסים ומשרים למשך שעה 1.
23. לצלול mPADS בצלחת פטרי 100 מ"מ עם מים עבור DI ~ 15 שניות.
24. לצלול mPADS ב המנה השנייה פטרי 100 מ"מ עם מים עבור DI ~ 15 שניות.
25. לצלול mPADS בצלחת פטרי third 100 מ"מ עם PBS עבור ~ 15 שניות.

זרוע

חומרים:

• התא הנבחר קו
• טריפסין-EDTA (0.25% טריפסין עם EDTA • 4Na, חתול Gibco. מספר 25200-056)
• צמיחה בינונית
• מאגר 1X פוספט פתרון.

שיטה:

1. בשכונה סטרילי, mPADS מקום בצלחת פטרי 100 מ"מ ולמלא עם המדיום 17 מ"ל.
2. מניחים צלחת פטרי באינקובטור לחמם עד 37 ° C
3. להשעות תאים באמצעות טריפסין
4. לשאוב שוב ושוב לשבור את צבירי תאים.
5. תא Pipet ההשעיה לתוך צלחת פטרי עם mPADS. הוסף תאים כאלה הם יישארו תאים בודדים (ללא תאים תאים אנשי קשר) בזמן הניתוח. הסכום המדויק של תאים להוסיף הוא תא מסוג מסויםתלוי באזור תא להתפשט בקצב הצמיחה.
6. בעדינות לפיזור תאים בצלחת פטרי עם pippetting איטי.
7. מקום חממה עבור 2 שעות על מנת לאפשר לתאים להתיישב ולפעול על microneedles.
8. בדוק mPADS כדי לראות אם התאים להתפשט. התאים ייראה שטוח תוחלת שישה או יותר הודעות.
9. אם התאים מפוזרים, העברת mPADS על צלחת פטרי חדש 100 מ"מ עם 21 מ"ל של מדיום חדש.
10. MPADS מוכנים עבור הניסוי שלך.

מכתים ואת הרכבה mPADS

תיקון

חומרים:

• Deionized מים
• Paraformeldahyde (16%) בקבוקון
• פוספט 10X הצפת פתרון.
• מאגר 1X פוספט פתרון.

שיטה:

1. בתוך שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה, להוסיף 30 מ"ל של DI, 10 מ"ל של paraformeldahyde (בקבוקון שלם), ו 4.5 מ"ל של PBS 10X לפתרון ותיקון.
2. הוסף ~ 25 מ"ל של תיקון הפתרון צלחת פטרי 100 מ"מ.
3. לצלול בעדינות mPAD עם תאים לתוך צלחת לתקן ולתת דגירה במשך 20 דקות.
4. לצלול mPADS בצלחת 100 מ"מ עם 1X PBS שלוש פעמים.
5. מוכן immunostaining ועל הרכבה.

ניתוח כוחות נייד על mPADS

Confocal הדמיה

חומרים:

• Confocal מיקרוסקופ
• 63X המטרה
• קוביות סינון נוגדנים משני
• גרין לסנן קוביה (Rhodamine) עבור DiI הדמיה של microneedles.

שיטה:

1. MPADs מקום על הבמה למצוא תאים בודדים עם חשיפה ms 300, לא binning.
2. תמונה צמרות microneedles עבור TOP IMAGE.
3. שימוש ב Z-לשלוט readout, לכידת תמונה של microneedles עבור תמונה למטה.
4. תמונה כל הערוצים האחרים יש לך כתמים ב (Hoechst, phalloidin וכו ')

ניתוח תמונה

חומרים:

• MATLAB עם עיבוד תמונה ארגז כלים

שיטה:

1. סובב ולהירשם תמונות העליון והתחתון
2. מדוד centroids של התחתון (עשוי בלא חת) העליון (מוסח) עמדות
3. חישוב עקירה
4. שימוש באביב קבוע עבור הודעות (ידוע, תלוי בגיאומטריה פוסט), לחשב את וקטור הכוח במוצב כל
5. ניתוח שגיאה מבוסס על היכולת לפתור כוחות, תלוי ברזולוציה התמונה ברזולוציה זיהוי centroid
6. מסדרים את הנתונים בהתאם לצרכים אישית שלך - למשל, הבהירויות כוח ו / או כיוון, כמו כמובן זמן, מדידות רבות ברחבי תנאים שונים וכו '