השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Summary

השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.

Abstract

תא דינמי הדמיה לחיות מאפשר ראיה ישירה בזמן אמת אינטראקציות בין תאים של המערכת החיסונית ^{1, 2,} עם זאת, חוסר שליטה במרחב ובזמן בין תא חיידק phagocytic ויש שניתנו ממוקד תצפיות לתוך אינטראקציות התגובה הראשונית של המארח פתוגנים קשה. מבחינה היסטורית, אירועים לפנות אינטר כגון phagocytosis ³ כבר צילמו על ידי ערבוב של שני סוגי התאים, ולאחר מכן ברציפות סריקת השדה של נוף למצוא קשר אינטר סרנדיפי בשלב המתאים של אינטראקציה. אופי סטוכסטיים של אירועים אלה הופך את התהליך מייגע, וקשה לצפות באירועים מוקדם או חולף על קשר תאים תאים על ידי גישה זו. שיטה זו מחייבת מציאת זוגות סלולריים, כי הם על סף מגע, והתבוננות לפנות אותם עד שהם המושלם שלהם, או לא. כדי לענות על המגבלות האלה, אנו משתמשים השמנה אופטי כשיטה, לא פולשנית ולא הרסנית, אבל מהיר ויעיל למצב התאים בתרבית.

מלכודות אופטי, או פינצטה אופטית, מנוצלים ויותר המחקר הביולוגי כדי ללכוד פיסית לתפעל תאים אחרים מיקרון חלקיקים בגודל בשלושה ממדים ^4. לחץ קרינה נצפתה הראשון ליישם מערכות פינצטה אופטית ב -1970 ^{5, 6,} ושימש הראשון לשלוט דגימות ביולוגיות בשנת 1987 ^7. מאז, פינצטה אופטית הבשילו לתוך הטכנולוגיה כדי לבחון מגוון של תופעות ביולוגיות ^8-13.

אנו מתארים שיטה ¹⁴ כי ההתקדמות לחיות הדמיה התא על ידי שילוב של מלכודת אופטי עם דיסק מסתובב מיקרוסקופיה confocal עם בקרת טמפרטורה ולחות כדי לספק שליטה במרחב ובזמן מעולה של אורגניזמים פתוגניים בסביבה פיזיולוגיים כדי להקל על אינטראקציות עם תאים המארח, כפי שנקבע על ידי המפעיל. Live, אורגניזמים פתוגניים כמו קנדידה אלביקנס, אספרגילוס fumigatus, אשר יכול לגרום פוטנציאל קטלני, זיהומים פולשניים בקרב אנשים immunocompromised ^{15, 16} (למשל איידס, כימותרפיה, השתלת איברים לחולים), היו לכודים אופטית באמצעות שאינו הרסני בעוצמות לייזר ועבר סמוך מקרופאגים, אשר יכול phagocytose את הפתוגן. רזולוציה גבוהה, המשודר בסרטים אור פלואורסצנטי מבוססי הקים את היכולת להתבונן באירועים הראשונים של phagocytosis בתאים חיים. כדי להדגים את תחולתם רחבה באימונולוגיה, העיקרי מתאי T נלכדו גם מניפולציות כדי ליצור סינפסות עם אנטי CD3 microspheres מצופה in vivo, וגם זמן לשגות הדמיה של היווצרות הסינפסה הושג גם. על ידי מתן שיטה להפעיל שליטה מרחבית קנס של פתוגנים לחיות ביחס תאים חיסוניים, אינטראקציות הסלולר יכול להיות שנתפסו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הפרעה מינימלית תאים יכולה להניב תובנה עוצמה לתוך התגובות המוקדמות של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות.

Protocol

1. תרבות תנאים של פתוגנים עבור השמנה אופטי

1. לגדול א fumigatus (B-5233/RGD12-8) על חצי מוצק מדיה אגר המכיל SBD (Sabouraud דקסטרוז) בשעה 30 ° C במשך 3 ימים.
2. לגדול C. אלביקנס (SC5314) ב YPD (שמרים, Peptone דקסטרוז) תרבות נוזל המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין לילה חממה שייקר ב 30 ° C.

2. הכנה של פתוגנים תיוג פלורסנט

1. קציר כמות רצויה של פתוגנים להעביר צינור 1.5 תגובה מ"ל.
2. הוספת 300 μL של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) אל צינור התגובה.
3. Sonicate התערובת למשך 30 שניות.
4. צנטריפוגה בסל"ד 4000 למשך 1 דקה.
5. לשאוב supernatant, עוזב גלולה באין מפריע.
6. חזור על (2.4) ו (2.5) עוד פעמיים.
7. Resuspend ב 500μL של PBS.

3. תיוג של פתוגנים עם צבע פלואורסצנטי

1. ממיסים 1 מ"ג של צבע של עניין (למשל אלקסה פלואוריד 488, Alexa פלואוריד 647) ב dimethylformamide 100 μL (DMF) (בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל).
2. הוסף 3 μL תערובת של צבען צינורות התגובה המכיל פתוגנים שטף.
3. סיבוב או להתנער מדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
4. לשטוף עם מדגם PBS 3X ידי centrifuging בסל"ד 4000 למשך 1 דקה.
5. Resuspend ב 300 μL של PBS.

4. מסיק T-תאים מהדם כולו

1. השג דם שלם (טרי).
2. דם חם, PBS + 2% עוברית שור בסרום (FBS), ו histopaque לטמפרטורת החדר.
3. הוסף CD4 + RosetteSep האדם העשרה T קוקטייל נייד ב μL 50 / מ"ל ​​של דם מלא.
4. סובב מדגם דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
5. מדולל מדגם עם נפח שווה של PBS + 2% FBS ומערבבים בעדינות.
6. שכבה מדוללת מדגם על גבי histopaque, מזעור ערבוב
7. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 1200 XG בטמפרטורת החדר עם הבלם משם.
8. הסרת תאים מועשר.
9. לשטוף את התאים מועשר 2x עם פתרון PBS + FBS 2%.
10. Lyse כדוריות דם אדומות למשך 2 דקות עם תא דם אדום חיץ lysing
11. הוסף 10 מ"ל של PBS + 2% FBS ו lysed צנטריפוגות אדום דם תאים בסל"ד 1500 למשך 5 דקות
12. לשאוב supernatant, נזהר לא להפריע גלולה
13. Resuspend בתקשורת IMDM המכיל 10% בסרום שור העובר

5. הכנת 264.7 מקרופאגים הגלם לתוך שקופיות קאמרית

1. הכן DMEM (מדיום שונה Dulbecco של הנשרים) להכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 1% L-גלוטמין.
2. מדיה חמים, טריפסין, ו pbs באמבט חם 37 ° C.
3. לשטוף 2x צלחת עם PBS
4. לשאוב PBS בין לשטוף כל אחד.
5. הוסף 5 מ"ל טריפסין לצלחת כדי לכסות את פני השטח (עבור צלחת 10 ס"מ תרבות רקמות).
6. דגירה של 5 דק 'ב 37 ° C.
7. לדפוק בעדינות לצד הצלחת לנתק את התאים מפני השטח צלחת. היזהר לא להתיז טריפסין מחוץ לצלחת.
8. הוסף 5 מ"ל או כמות זהה של התקשורת טריפסין.
9. לשאוב תערובת לתוך צינור התגובה.
10. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות.
11. לשאוב התקשורת, נזהר לא להפריע גלולה.
12. Resuspend ב 10 מ"ל של התקשורת.
13. הוספת 400 μL של התקשורת לתא אחד של השקופית קאמרית.
14. הוסף 5 μL ההשעיה תא לתא אחד.
15. לגדול בין לילה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.

6. תוספת של פתוגנים לדגום

1. Pipet μL 5-10 של פתוגנים שכותרתו עניין (מ צעדים 1-3) אל תוך החדר.
2. מערבבים היטב על ידי pipeting למעלה ולמטה, נזהר שלא לגעת בקרקעית של החדר להפריע מקרופאגים דבק.

7. טוען מדגם על ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal (וידאו, סריקה באמצעות רכיבים)

1. הפעל את כל הרכיבים על ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal.
2. יישר מיקרוסקופ הדמיה DIC.
3. הסר שקופיות קאמרית מן החממה.
4. הוסף שקף קאמרית לשלב מיוחדים.
5. הסרת החלק העליון של השקופית קאמרית (הכרחי הדמיה DIC).

8. הכנה השמנה אופטי (וידאו, סריקה באמצעות רכיבים איך זה להשתלב מיקרוסקופ)

1. הפעל את תריס עבור מלכודת אופטית.
2. הפעלת IR לייזר.
3. תריס פתוח (על הלייזר) מלכודת אופטית.
4. אשר תריס מול IR לייזר סגור על ידי סימון עם כרטיס IR.

9. בחירה מניפולציה של הפתוגן עם מלכודת אופטית

1. פוקוס על מקרופאגים בשקופית דבק.
2. מצא פתוגנים תנודות בחופשיות פתרון הסמוכים מקרופאגים.
3. העבר בשלב כזה הפתוגן הוא בקרבת המלכודת.
4. פתיחת תריס להעסיק את מלכודת.
5. העבר מדגם להביא מקרופאגים במגע עם המלכודת נייחped הפתוגן.
6. תמונה עם דיסק מסתובב מיקרוסקופ confocal, לא DIC, הקרינה, או שילוב של שניהם. בדרך כלל, השמנה נעשית DIC, בזמן אמת הדמיה נעשה עם פלואורסצנטי.

10. נציג תוצאות:

כדי להפעיל שליטה במרחב ובזמן מלא של פתוגנים וחרוזים ב in vivo ו בסביבה חוץ גופית, עיצבנו מנגנון שהותקן השמנה משולב על גבי מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal (סכמטי באיור. 1). במלוא העוצמה, לייזר סיפק 350 מגוואט של חשמל לאחר צימוד האור עם רכיבים אופטיים שונים במנגנון מלכודת אופטית, ~ 80 mW של כוח על המטרה TIRF, כפי שנמדד עם מד כוח, שימש בצורת מלכודת בחדר.

על מנת עמדה חפץ בחדר יחסי האובייקט לכודים, בשלב הועבר תוך כדי החזקת חפץ נייח עם לכודים לייזר השמנה. בשלב הועבר במהירויות די איטי, כך כוח הגרר על החלקיקים הלכודים לא יעלה על כוח השמנה מקסימלית.

אוכלוסיות נפרדות של C. albicans (גודל טיפוסי - ~ 5 מיקרומטר) תויגו עם כל אחד משלושת הצבעים (AF488, AF568, ו AF647, המתאים ירוק, כחול, אדום באיור, בהתאמה) כדי להמחיש הדמיה עם ערוצי הקרינה מרובים ובמקביל אופטית השמנה הפתוגן. יחיד ג אלביקנס נלכד ועבר בדפוס מרובע באמצעות מקבץ של שמרים אחרים, כפי שעולה חצי אפור, הוכחת את היכולת ללכוד ולתפעל את המיקום הספציפי של הפתוגן יחיד שנבחר על ידי המפעיל גם בסביבה צפופה (איור 2 א) .

כדי להמחיש עוד יותר את הגמישות של מערכת זו כדי ללכוד את הצורה מורפולוגיות שונות הוצגו על ידי אורגניזמים פתוגניים, פינצטה אופטית גם היה מסוגל להחזיק למקם ג אלביקנס חלקיק עם pseudohyphae. ג אלביקנס שכותרתו עם AF647 (אדום) היה נע לאורך מסלול כפי שתואר על ידי החץ הלבן והניח ליד התאים GFP-LC3-RAW ניאון (איור 2B). החלק שמרים של C. אלביקנס נלכד כמו pseudohyphae השתרך.

אנו ממוקמים גם אספרגילוס fumigatus ליד תא עכבר RAW macrophage על מנת לנתח את מסגרת הזמן המוחלט של phagocytosis עם הקו הזה תא הפתוגן מסוים (איור 3A). לאחר הפתוגן יוצר קשר עם התא, המלכודת כבוי, ואת זמן לשגות הדמיה מועסק לצפות אירועים הסלולר עוקבות (איור 3B). מלכודת אופטי שימש גם כדי ללכוד העיקרי T-תאים מבודדים מהדם וביים הסמוכים חרוזים מצופים נוגדני אנטי CD3 על מנת תא-T כדי ליצור הסינפסה האימונולוגית עם חרוז (איור 4), המופע נוספים צדדיות ישירות מלכודת מניפולציה בתאי מערכת החיסון.

באיור 1. סקירה כללית סכימטי של מלכודת אופטי משולב ספינינג דיסק ההתקנה confocal מיקרוסקופ. כלי הפריסה מראה את הקורה השמנה (סגול), דרך תאורה עבור brightfield הדמיה (כתום), קרן עירור פלואורסצנטי (אדום), פליטת הקרינה (ירוק), תשלום מצמידים התקן (CCD) המצלמה, אלקטרונים הכפלת מכשיר תשלום מצמידים (EM- CCD) המצלמה, מראות dichroic (D1 ו-D2), מראות (M1 ו M2), ועדשות (L1, L2, L3, L4). כל הרכיבים האחרים של המערכת confocal מלכודת מיקרוסקופ מסומנים בתרשים.

איור 2. (א) תמונות של הקרינה לכודים מניפולציות ג אלביקנס. לכודים fluorescently שכותרתו (אלקסה פלואוריד 488 (AF488), כחול) האורגניזם בשטח של כ fluorescently שכותרתו אחרים אלביקנס (AF568, ירוק AF647, אדום). הבמה נע סביב החלקיקים הלכודים, CA כחול כפי שצוין על ידי החצים אפור. (ב) לכודים פסאודו hyphal צורה של C. אלביקנס ליד תא GFP LC3-RAW. טופס psuedohyphal שכותרתו fluorescently של CA (אדום, AF647) לכודים אופטית ועבר סמוך GFP-LC3 הביע מקרופאגים RAW. האורגניזם CA הוא נע לאורך מסלול כפי שצוין על ידי החץ הלבן.

איור 3. השמנה ומיצוב של א ' fumigatus ליד תא RAW phagocytic. (א) brightfield תמונות של א 'לכוד fumigatus, כפי שצוין על ידי החץ הלבן, עברה ואת מיקומו לאורך השביל כפי שצוין על ידי החץ האדום. הפתוגן לכודים מעט מחוץ לפוקוס בגלל המלכודת דוחפים את האורגניזם מעט מעל המטוס מוקד א. fumigatus מועבר עד ממוקמת סמוך לתא הגלם המבוקש. (ב) שפעתהדמיה של orescence phagocytosis א fumigatus על ידי תא RAW. לאחר הפתוגן לכודים ממוקם ליד תא הגלם, תהליך phagocytosis מופעל. בשעה 30 s, הממברנה של התא RAW מתחיל לשנות צורה כוס סביב החלקיקים. בשעה 60 s, כוס נוצר במלואו. מ -90 ל 150s, א ' fumigatus נבלע, ועל ידי 180 s, החלקיק מופנם במלואו

איור 4. השמנה העיקרי T-cell כדי ליצור סינפסה עם אנטי CD3 חרוזים מצופים. DIC תמונות של ראשוני T-cell עבר על ידי מלכודת אופטית למיקום ליד מצופה חרוז עם נוגדן אנטי CD3. לאחר מכן התא מהווה סינפסה החיסונית, אשר לא ניתן להבחין בקלות את התמונות.

Discussion

בעבודה זו אנו משתמשים מלכודת אופטי ללכוד פתוגנים עם ממדים בין 3 מיקרומטר - 5 מיקרומטר. אמנם פתוגנים עניין במעבדה שלנו בדרך כלל יש ממדים אלה, מערכת פינצטה אופטית המתוארת כאן היא גמישה ללכוד מגוון רחב של גדלים. ואכן מלכודות אופטיות שימשו כדי ללכוד חלקיקים הנעים בין אטומים בודדים לתאי כ 10 מיקרומטר קוטר. בנוסף, מערכת זו השמנה אופטי הצליח ללכוד חלקיקים של צורות שונות: כדוריים, אליפטיים, חלקיקים מאורכים מאוד, וזה שימושי כאשר עובדים עם פתוגנים ביולוגיים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
א fumigatus			זן אלבינו, B-5233/RGD12-8, מתנה KJ Kwon-Chung, NIH
C. albicans			SSY50-B מוטציה, מתנה אלפתריוס Mylonakis, MGH; SC5314 זן, מתנה ג'רלד פינק, וייטהד במכון
אלקסה פלואוריד 488	Invitrogen	A20000
אלקסה פלואוריד 647	Invitrogen	A20006
dimethylformamide	סיגמא	D4551
דם טרי			מתנה RJW הית, MGH, HMS
Nikon הפוכה מיקרוסקופ	ניקון		דגם TI-E
לייזר השמנה, ChromaLase	מחקר Blue Sky	CLAS-106-02-STF02
עירור פלואורסצנטי לייזר	קוהירנט		דגם Innova 70C
Breadboards עבור רכיבים השמנה	Thorlabs	MB1224, MB1218
שולחן אופטי אוויר	טכני ייצור Corporation
תריס שליטה אלקטרונית עם דוושת	Uniblitz		שנרכשו וינסנט Associates, רוצ'סטר, ניו יורק
Singlemode סיב אופטי	עוז אופטיקה	PMJ-3S3S-1064-6
סיבים positioner	Thorlabs	PAF-X-5-C
סיבים collimator	עוז אופטיקה	HPUCO-23-1064-P-25AC
עדשות עבור טלסקופ	Thorlabs	AC254-150-B	אורך מוקד של 150 מ"מ
תרגום שלבים (x, y, z)	ניופורט	M-461-XYZ
IR dichroic במראה	Chroma	ET750-SP-2p8
המטרה העדשה (100x)	ניקון		NA = 1.49, טבילה שמן, המטרה TIRF
Confocal ראש	Yokogawa	CSU-XI
מקטב	ניקון	MEN51941
וולאסטון פריזמה	ניקון	MBH76190
EM-CCD המצלמה	Hamamatsu	C9100-13
מצלמת CCD (ORCA ER)	Hamamatsu	C4742-80-12AG
סנן גלגל	Ludl	99A353
סנן גלגל	סאטר	LB10-NWE
החדרים coverglass	Lab-Tek/Nunc	155409
Dynabeads	Invitrogen	111-51D	מצופה עם אנטי CD3
שונה Dulbecco הנשר של המדיום (DMEM)	Invitrogen / Gibco	10313
פניצילין / סטרפטומיצין	Invitrogen / Gibco	15140-122
L-גלוטמין	Invitrogen / Gibco	25030-081
עוברית שור סרום (HyClone)	ThermoScientific	SH30071.03