השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי
במאמר זה
סיכום
תקציר
תא דינמי הדמיה לחיות מאפשר ראיה ישירה בזמן אמת אינטראקציות בין תאים של המערכת החיסונית 1, 2, עם זאת, חוסר שליטה במרחב ובזמן בין תא חיידק phagocytic ויש שניתנו ממוקד תצפיות לתוך אינטראקציות התגובה הראשונית של המארח פתוגנים קשה. מבחינה היסטורית, אירועים לפנות אינטר כגון phagocytosis 3 כבר צילמו על ידי ערבוב של שני סוגי התאים, ולאחר מכן ברציפות סריקת השדה של נוף למצוא קשר אינטר סרנדיפי בשלב המתאים של אינטראקציה. אופי סטוכסטיים של אירועים אלה הופך את התהליך מייגע, וקשה לצפות באירועים מוקדם או חולף על קשר תאים תאים על ידי גישה זו. שיטה זו מחייבת מציאת זוגות סלולריים, כי הם על סף מגע, והתבוננות לפנות אותם עד שהם המושלם שלהם, או לא. כדי לענות על המגבלות האלה, אנו משתמשים השמנה אופטי כשיטה, לא פולשנית ולא הרסנית, אבל מהיר ויעיל למצב התאים בתרבית.
מלכודות אופטי, או פינצטה אופטית, מנוצלים ויותר המחקר הביולוגי כדי ללכוד פיסית לתפעל תאים אחרים מיקרון חלקיקים בגודל בשלושה ממדים 4. לחץ קרינה נצפתה הראשון ליישם מערכות פינצטה אופטית ב -1970 5, 6, ושימש הראשון לשלוט דגימות ביולוגיות בשנת 1987 7. מאז, פינצטה אופטית הבשילו לתוך הטכנולוגיה כדי לבחון מגוון של תופעות ביולוגיות 8-13.
אנו מתארים שיטה 14 כי ההתקדמות לחיות הדמיה התא על ידי שילוב של מלכודת אופטי עם דיסק מסתובב מיקרוסקופיה confocal עם בקרת טמפרטורה ולחות כדי לספק שליטה במרחב ובזמן מעולה של אורגניזמים פתוגניים בסביבה פיזיולוגיים כדי להקל על אינטראקציות עם תאים המארח, כפי שנקבע על ידי המפעיל. Live, אורגניזמים פתוגניים כמו קנדידה אלביקנס, אספרגילוס fumigatus, אשר יכול לגרום פוטנציאל קטלני, זיהומים פולשניים בקרב אנשים immunocompromised 15, 16 (למשל איידס, כימותרפיה, השתלת איברים לחולים), היו לכודים אופטית באמצעות שאינו הרסני בעוצמות לייזר ועבר סמוך מקרופאגים, אשר יכול phagocytose את הפתוגן. רזולוציה גבוהה, המשודר בסרטים אור פלואורסצנטי מבוססי הקים את היכולת להתבונן באירועים הראשונים של phagocytosis בתאים חיים. כדי להדגים את תחולתם רחבה באימונולוגיה, העיקרי מתאי T נלכדו גם מניפולציות כדי ליצור סינפסות עם אנטי CD3 microspheres מצופה in vivo, וגם זמן לשגות הדמיה של היווצרות הסינפסה הושג גם. על ידי מתן שיטה להפעיל שליטה מרחבית קנס של פתוגנים לחיות ביחס תאים חיסוניים, אינטראקציות הסלולר יכול להיות שנתפסו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הפרעה מינימלית תאים יכולה להניב תובנה עוצמה לתוך התגובות המוקדמות של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות.
פרוטוקול
1. תרבות תנאים של פתוגנים עבור השמנה אופטי
- לגדול א fumigatus (B-5233/RGD12-8) על חצי מוצק מדיה אגר המכיל SBD (Sabouraud דקסטרוז) בשעה 30 ° C במשך 3 ימים.
- לגדול C. אלביקנס (SC5314) ב YPD (שמרים, Peptone דקסטרוז) תרבות נוזל המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין לילה חממה שייקר ב 30 ° C.
2. הכנה של פתוגנים תיוג פלורסנט
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעבודה זו אנו משתמשים מלכודת אופטי ללכוד פתוגנים עם ממדים בין 3 מיקרומטר - 5 מיקרומטר. אמנם פתוגנים עניין במעבדה שלנו בדרך כלל יש ממדים אלה, מערכת פינצטה אופטית המתוארת כאן היא גמישה ללכוד מגוון רחב של גדלים. ואכן מלכודות אופטיות שימשו כדי ללכוד חלקיקים הנעים בין אטומים בודדים לתאי כ 10 מיקרומטר קוטר. בנוסף, מערכת זו השמנה אופטי הצליח ללכוד חלקיקים של צורות שונות: כדוריים, אליפטיים, חלקיקים מאורכים מאוד, וזה שימושי כאשר עובדים עם פתוגנים ביולוגיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי החולים הכללי במסצ'וסטס מחלקת קופות לרפואה פנימית (JMT, MKM, MLC, JMV), המכון הלאומי הדמיה ביו Bioengineering מענק T32EB006348 (CEC), המרכז הכללי של מסצ'וסטס של החולים לקרן חישובית אינטגרטיבית פיתוח ביולוגיה AI062773 ( RJH), מענקים AI062773, DK83756 ו DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), ואת המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של המכון הלאומי לבריאות (NIH) AI057999 (JMV ). אנו מודים ניקולס C. Yoder לדיונים מועיל, צ'רלס פלטס (RPI, Inc) לקבלת סיוע טכני.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| א fumigatus | זן אלבינו, B-5233/RGD12-8, מתנה KJ Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B מוטציה, מתנה אלפתריוס Mylonakis, MGH; SC5314 זן, מתנה ג'רלד פינק, וייטהד במכון | ||
| אלקסה פלואוריד 488 | Invitrogen | A20000 | |
| אלקסה פלואוריד 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | סיגמא | D4551 | |
| דם טרי | מתנה RJW הית, MGH, HMS | ||
| Nikon הפוכה מיקרוסקופ | ניקון | דגם TI-E | |
| לייזר השמנה, ChromaLase | מחקר Blue Sky | CLAS-106-02-STF02 | |
| עירור פלואורסצנטי לייזר | קוהירנט | דגם Innova 70C | |
| Breadboards עבור רכיבים השמנה | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| שולחן אופטי אוויר | טכני ייצור Corporation | ||
| תריס שליטה אלקטרונית עם דוושת | Uniblitz | שנרכשו וינסנט Associates, רוצ'סטר, ניו יורק | |
| Singlemode סיב אופטי | עוז אופטיקה | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| סיבים positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| סיבים collimator | עוז אופטיקה | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| עדשות עבור טלסקופ | Thorlabs | AC254-150-B | אורך מוקד של 150 מ"מ |
| תרגום שלבים (x, y, z) | ניופורט | M-461-XYZ | |
| IR dichroic במראה | Chroma | ET750-SP-2p8 | |
| המטרה העדשה (100x) | ניקון | NA = 1.49, טבילה שמן, המטרה TIRF | |
| Confocal ראש | Yokogawa | CSU-XI | |
| מקטב | ניקון | MEN51941 | |
| וולאסטון פריזמה | ניקון | MBH76190 | |
| EM-CCD המצלמה | Hamamatsu | C9100-13 | |
| מצלמת CCD (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| סנן גלגל | Ludl | 99A353 | |
| סנן גלגל | סאטר | LB10-NWE | |
| החדרים coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | מצופה עם אנטי CD3 |
| שונה Dulbecco הנשר של המדיום (DMEM) | Invitrogen / Gibco | 10313 | |
| פניצילין / סטרפטומיצין | Invitrogen / Gibco | 15140-122 | |
| L-גלוטמין | Invitrogen / Gibco | 25030-081 | |
| עוברית שור סרום (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
מקורות
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
