הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים

13.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3124

⸱

8 בספטמבר 2011

 ,  , 
1Biology Department, Arcadia University, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center, Temple University School of Medicine, 3Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology, Temple University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים נהלים לניהול חוזרות ונשנות של מעכבי איתות muscarinic כדי longus levator auris (LAL) השרירים של עכברים בוגרים צעירים עבור immunostaining הבאות של צמתים neuromuscular שלה (NMJs) ב wholemounts. השריר LAL יש יתרונות ייחודיים עבור חושף In vivo השפעות פרמקולוגיות על NMJs.

תקציר

שרירי הגפיים האחוריות של מכרסמים, כגון הגסטרוקנמיוס ו tibialis הקדמי, משמשים לעתים קרובות במחקרים פרמקולוגיים vivo של אותות חיוני ליצירת ותחזוקה של NMJs יונקים. עם זאת, חדירת התרופה לתוך השרירים הללו לאחר תת עורית או תוך שרירית הממשל היא לעתים קרובות לא שלם או אחיד NMJs רבים יכולים נותרות בעינן. אמנם הממשל מערכתית עם מכשירים כגון מיני משאבות יכולים לשפר את ההשפעות spatiotemporal, אופי פולשני של גישה זו עלולה לגרום תגובות דלקתיות בלבול ו / או נזק לשרירים ישיר. יתר על כן, ניתוח מלא של NMJs בשריר הגפיים האחוריות הוא מאתגר, מכיוון שהיא דורשת זמן רב חתך סדרתי immunostaining נרחב.

LAL העכבר הוא סדין דק, שטוח של שריר הממוקם על שטחי dorsum של הצוואר. הוא עווית שריר מהיר שמתפקד להעביר את פינה. הוא מכיל חלקים מקורי ואת הזנב שמקורם קו האמצע של הגולגולת ולהרחיב רוחבית לחלק סחוסי של כל פינה. השריר מסופק על ידי ענף של עצב הפנים כי פרויקטים caudally מיד עם יציאתו foramen stylomastoid. אנו ואחרים מצאו LAL להיות הכנה נוח כי יתרונות לחקירת הן קצרות וארוכות טווח vivo השפעות של תרופות על NMJs והשרירים. ראשית, המיקום שלה שטחית מקלה יישומים מקומיים רבים של תרופות תחת הרדמה קלה. שנית, הרזון שלה (2-3 שכבות של סיבי שריר) היתרי להדמיה וניתוח של כמעט כל NMJs בתוך השריר. שלישית, את קלות לנתח את זה עם שלם העצב שלה יחד עם דפוס של העצבוב שלו מאפשר ניתוח משלים אלקטרו במבחנה 9,5. לאחרונה, ואולי הכי חשוב, נפח להחיל קטן (~ 50μl) בקלות מכסה את פני השטח כולו שרירים, ומספק חשיפה אחידה וממושכת של כל NMJs שלה לתרופה מבטלת את הצורך בגישה מערכתית 1,8.

פרוטוקול

1. תת עורי מתן muscarinic קולטן האצטילכולין (mAChR) היריבים

  1. הכן בתנאים aseptic את המינון המתאים של אנטגוניסט mAChR, (ראה לוח) על ידי המסת התרופה מלח פיזיולוגית סטרילית בצינור התגובה 1.5mL. היריבים הבאים שימשו: אטרופין, Methoctramine, 4 לח, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
  2. צייר 50μl של פתרון לתוך מזרק אינסולין a1cc ולהשתמש מזרק נפרד עבור כל עכבר. כמו כן להכין מזרקים המכילים מלח פיזיולוגיים רק עכבר אחד בקבוצת הביקורת. תחזיקי את המזרקים על הקרח עד מוכנים להזריק.
  3. הרדימי עכברים עם קוקטייל קטמין-xylazine (120 מ"ג / ק"ג קטמין, 8 מ"ג / ק"ג xylazine) בדיקת עומק ההרדמה המתאים ידי התבוננות חוסר התגובה הבוהן קמצוץ.
  4. לאחר סדציה נאותה, לגלח את השיער שכיסה את האזור מקורי של הראש לאזור הזנב של הצוואר, נגב שאר השיער משם עם אתנול 70%.
  5. המקום העכבר תחת stereomicroscope, והכנס במקביל מחט לשריר LAL תוך משיכת בקלילות על מחט של מזרק (איור 1 א ', ב). הדבר מבטיח כי המחט מוחדרת לתוך רקמת החיבור המכסה ואינו ישירות הנזק לשריר LAL עצמו. הכנס את המחט כך קצה מכסה את ההיבט הזנב של שריר LAL.
  6. לאט לאט מתחילים להזריק פתרון מעל השריר LAL הנכון תוך הוצאת מזרק; הזמן הזרקה הכולל צריך להיות כ 1 דקה. אם מזריקים כראוי, הפתרון צריך להקים "כיפה", כלומר בערך 1 ס"מ קוטר, בעור שמעל שיישארו לפחות שעה אחת. פתרון מוזרק אחיד יכסה את האזורים מקורי ואת הזנב כולו של השריר LAL הנכון.
  7. חזור על התהליך כל 12 שעות 1 עד 7 ימים. עבור studies1 אחרים, השתמשנו באותו פרוטוקול להזריק גורמי גדילה כל 12 שעות למשך עד 21 ימים. התגובות לא נורמלי נצפו מעכברים מנוהל עם 2x הרדמה ביום למשך עד 21 ימים.

2. Dissection של השרירים LAL

  1. להרדים עכברים עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital (390 מ"ג / ק"ג). המוות הוא מובטח על ידי הערכת חוסר דופק לאחר פתיחת בית החזה מתבצע.
  2. להצמיד את העכבר בצלחת לנתיחה, צד הגב עם פין 1 בכף כל פין 1 דרך האף.
  3. הפוך את החתך הראשון דרך העור בלבד, בעזרת מספריים קטנים באביב לחתוך לאורך LAL שמאל מאזור הפרוקסימלי רק לאוזן לאזור סביב השכמה השמאלית.
  4. מוציאים בזהירות את העור באזור זה, אך להימנע חיתוך קרוב מדי לאוזן ימין כמו זו אחת הנקודות ההתקשרות עבור השריר LAL הנכון.
  5. אתר רקמת השומן ממוקם במרכז רצועת השומנים לאורך קו האמצע, על פני השטח השטחיים של הראש, שם את השרירים LAL ימין ועל שמאל להיפגש. בעזרת מספריים באביב קטן, לחתוך 1cm בצד ימין של רקמת שומן (לכיוון האוזן השמאלית) מן הקצה הפרוקסימלי של שריר LAL שמאל והגיע עד הכתף (איור 1C).
  6. לאחר החתך הוא עשה, לקלף את השריר האחורי LAL ימין עם מלקחיים קטנות כדי לחשוף את הצד הגחוני של השריר. חתוך את רקמת החיבור fascia תוך הקפדה על משיכת שריר LAL ימין עם מלקחיים (איור 1C).
  7. חותכים בסביבות סוף הזנב של LAL את הזכות בבסיס האוזן. המשך חיתוך, נע לקראת סוף מקורי של האוזן הימנית, תוך שמירה על LAL ימין והתהפך (איור 1C).. עדיף לכלול רקמה יותר בשלב זה מאשר הסיכון לפגיעה LAL עצמו. אם השריר מתחיל להתייבש, פיפטה 1X PBS מעל השריר.
  8. המקום גזור LAL זכות בצלחת 30mm תרבות Sylgard המכיל 1X PBS, בצד הגבי למעלה. הצמד מטה ארבע פינות של שריר עם סיכות חרקים קטנים.
  9. בעזרת מלקחיים קטנים מספריים האביב, רקמת חיבור נקי ממשטחי הגבי ו הגחון של שריר LAL הנכון. הפעל מחדש את השריר פינים כדי לנקות את השטח הגחון. 2-3 השרירים יוטלו בצלחת 30mm אותו.

3. Immunostaining טריפל של NMJs LAL: יום 1

  1. לפני תחילת immunostaining, להכין את כל ריאגנטים הצורך. 1X PBS, 2% שור BSA אלבומין) / PBS, 0.1M גליצין ב 2% BSA / PBS, טריטון X100 0.2% ב 2% BSA / PBS, ו paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1X PBS יהיה צורך. טרום מגניב מתנול במקפיא -20 ° C.
  2. השאירו השרירים LAL הצמיד בצד הגבי צלחת מעלה במהלך תהליך זה. בטל פתרון 1X PBS ולהוסיף מספיק 4% (PFA) כדי לכסות את השריר. מניחים על צלחת שייקר להגדיר במהירות 2 או 3 למשך 20 דקות. אלא אם נאמר אחרת, המנה צריך להיות ממוקם על שייקר את השלבים הבאים.
  3. בטל PFA 4% ולשטוף את השריר עם 1X PBS 3 פעמים, 10 'כל אחד.
  4. מחק האחרון 1X PBS לשטוף ולהוסיף 0.1M גליצין ב 2% BSA / PBS פתרון 30 ".
  5. בטל פתרון 0.1M גליציןד להוסיף 1X PBS המכיל מצומדות rhodamine α-bungarotoxin בריכוז של 1:200 עבור 15 ".
  6. בטל α-bungarotoxin פתרון ולשטוף שריר 1X PBS, 3 פעמים 10 'כל אחד.
  7. Permeabilize באמצעות הוספת רקמה טרום מקורר מתנול במקום צלחת במקפיא ° C ל -20 בדיוק 5 דקות, לא רועד הצורך.
  8. הסר מתנול לשטוף 3 פעמים 10 "כל אחד עם 1X PBS. בטל לשטוף האחרון רקמות לחסום עם 0.2% Triton X-100 ב 2% BSA / PBS שעה 1. הצעדים כביסה חסימת מבוצעות בטמפרטורת החדר.
  9. דגירה שרירי הלילה, טלטולים, ב 4 מעלות צלזיוס קוקטייל של נוגדנים העיקרי מדולל הפתרון חוסם (ראה לוח).

4. Immunostaining טריפל של NMJs LAL: יום 2

  1. לשטוף השרירים 1X PBS 3 פעמים, 10 "כל בטמפרטורת החדר.
  2. הוסף קוקטייל של נוגדנים משני חסימת פתרון 1 שעה בטמפרטורת החדר (ראה לוח). השרירים חייבים להיות מוגנים מפני אור ואילך צעד זה כדי למנוע צילום של הלבנת פלואורסצנציה 647-Alexa פלואוריד.
  3. לשטוף השרירים 1X PBS 3 פעמים, 10 'כל אחד.
  4. נקו את כל רקמת החיבור שנותרו 1X PBS, לחתוך את הגבולות לרוחב של שרירי לאל הר בשקופיות בצד הגב למעלה, באמצעות זכוכית כיסוי מחליק התקשורת גובר. השתמש ברור לק כדי להבטיח כיסוי להחליק במקום.
  5. הגן שקופיות אור ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לניתוח.

5. הדמיה של Confocal NMJs LAL

  1. תמונות ברזולוציה גבוהה confocal מתקבלים עם מטרה Apo לייקה תכנית שמן 63X (1.4NA) על מיקרוסקופ TCS 4D לייקה confocal.
  2. והעמסת ו אלקסה 647 אותות נסרקו בו זמנית עם קווי לייזר 488 ננומטר (ארגון, 488 ננומטר, 20 mW) ו - 633 ננומטר (HeNe, 633 ננומטר, 10 mW), בהתאמה. ברצף, אות Rhodamine נסרק אז עם קו לייזר 561 ננומטר (DPSS, 561, 20 mW). סעיפים אופטי נאספו 0.3 מיקרומטר במרווחים, ומספר תמונות מטוס-z המגוון 60-80. חריר מותאם Airy 1 (107.97 אממ). פורמט תמונה 1024 x 1024 (X, Y), עם מקדם הגדלה של 1, על תוצאות מהירות 400Hz בגודל תמונה של 234.32 x 234.32 מיקרומטר מיקרומטר ו גודל פיקסל של 229.05 x 229.05 ננומטר ננומטר.
  3. לייקה TCS-NT תוכנה רכישת מכן נעשה שימוש כדי לשחזר Z-סדרת תמונות לתוך תחזיות בעוצמה מקסימלית.
  4. תמונות Multipanel מותאמים הבהירות והניגודיות באמצעות Adobe Photoshop.
  5. עבור שריר LAL טיפוסי, אחד צריך להיות מסוגל לנתח כ 75-100 NMJs en פנים. יציבות Synaptic נקבעת על ידי תכונות כגון יישור המרחבי של טרום, פרי ו postsynaptic אלמנטים (כלומר, עצב, תאים שוואן שרירים), מדידות של שטח סינפטי (כלומר, גודל סינפסה).

נציג התוצאות:

בשלב NMJ של יונקים בוגרים, האקסון יחיד מנוע מרחיב סניפים בסדר כי טופס מאוד סוכות הבדיל מסוף העצב (איור 2; הירוק) על סיב שריר בודד, apposed בדיוק אשכולות postsynaptic של AChRs ניקוטינית (איור 2; האדום) . Perisynaptically, מסוף בתאי שוואן בחוזקה לכסות את כל הסניפים של מסופי העצב presynaptic (איור 2; כחול). שלמות מבניים ותפקודיים של הארגון הזה היא משולשת קשות מוטרד היישום היומיומי של תת סוג ספציפי מעכבי mAChR. בדוגמה המוצגת כאן (איור 3), 4 לח, אנטגוניסט mAChR בזיקה גבוהה עבור M1, M3, M4 ו M5 תת mAChR, מעורר חיסול סלקטיבי של מסופי עצב NMJs רבים ברחבי השטח שריר (איור 3B, ג). בנוסף, בתאי שוואן הם מסוף שקט באופן חריג 8 כפי שמעידים תיוג S100 בהיר ללא הארכת תהליך (איור 3B ", 3C"). Postsynaptically, סיבי שריר תקינים ואין אובדן nAChRs (איור 3 ב ', 3C').

איור 1
באיור 1. למיקום ארגון אנטומיים של שריר LAL. מיקום מקורי (rLAL), הזנב (כלל), ואת העצב LAL (LALn) להקות endplate המקביל מוצגות (A, הבלעה). המיקום והכיוון של המחט ביחס לשריר LAL מוצג עבור ההליך הזרקה (B). נקודות החתך מוצגים עבור ההליך דיסקציה (C).

איור 2
איור 2. ארגון המשולשת של NMJ. הגדלה גבוהה צפיות confocal של NMJ העכבר. האקסון יחיד מרחיב סניפים מסוף מצוין (A), מכוסה היטב על ידי תא שוואן הטרמינל התהליכים שלהם (א ', כוכביות הצבע גופים מסוף שוואן תאים). Postsynaptically סיב שריר, מקבץ של AChRs ניאציניות הוא apposed בדיוק ענפי עצב terminals מסוף בתאי שוואן.

איור 3
איור 3. LAL השרירים שטופלו 4-ולח, אנטגוניסט mAChR. צפיות confocal נמוכה הגדלה גבוהה של השרירים LAL שטופלו רכב או 4-לחה. בניגוד שריר רכב שטופלו (A-NMJs'''), רבים 4-לחות שטופלו חוסר שריר מסופי העצב (B-B''', C-C'''). אזור התאגרף באיור 2B הוא zoomed באיור 2C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המוצגת כאן היתרי חקירה של תפקידים מוכרים בעבר של mAChR-תת ספציפיים איתות ביציבות ותחזוקה של NMJs יונקים. שיטה זו תהיה גם שימושית כדי לבדוק את ההשפעות של גורמים neurotrophic וסוכני תרופתי. לדוגמה, המעבדה שלנו מצאו כי פקטור neurotrophic ריסי (CNTF) שהושרו מבצבצות כמעט כל מסופי LAL העצב בעכברים בוגרים 1 . תוצאה זו בניגוד מחקרים קודמים של CNTF שטופלו שרירי הגפיים האחוריות, אשר דיווחו מתונה הנבטה ב CA. 13-33% של הישבן ועל 9% לרוחב הגסטרוקנמיוס junctions 3. אנו מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי ניוון שרירים האגודה, NIH (NS062320).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
קטמין Hospira NDC0409-2051-05 מנה: 120mg/kg
xylazine לויד מעבדות LA33806 מנה: 8mg/kg
אטרופין סיגמא אולדריץ A0132 (> טוהר 98%); מנה: 0.2mg/kg - 20mg/kg
אטרופין וויגט גלובל הפצה AT105 התרופות כיתה
Methoctramine סיגמא אולדריץ M105 מנה: 100 - 400M
4 לח סיגמא אולדריץ D142 מנה: 2.5mg/kg
AFDX-116 Bioscience Tocris 1105 250
AFDX-384 Bioscience Tocris 1345 50 - -500
MT 7 פפטידים הבינלאומי PMT-4340-s 0.1M - 1M
פוספט 1X שנאגרו pH מלוחים, 7.4 Invitrogen 10010049
Paraformaldehyde דיג T353-500 הפוך את הפתרון של 10% לראשונה על ידי המסת מים 10g/100mL דה מיונן מזוקקים; לעשות 4% עם 1X PBS, כדי להתאים את ה-pH 7.4
Pentobarbitol נתרן Virbac לבריאות בעלי חיים NDC-051311-050-01 מנה: 390mg/kg
Sylgard Dow Corning חלק # 184 עקוב אחר ההוראות המצורפות בערכה, ניתן להשתמש תרבות מרובים צלחת בגודל (30 מ"מ, 60 מ"מ, 100 מ"מ), בהתאם לצרכים
0.1M גליצין סיגמא אולדריץ G-7126 הוסף 0.185g כדי 25mL של 2% BSA / PBS
2% שור בסרום אלבומין (BSA 2%) סיגמא אולדריץ A3059-100 ממיסים 2g BSA לתוך 100 מ"ל של 1X PBS
טריטון X100 0.2% ב 2% BSA / PBS (Buffer חסימה) סיגמא אולדריץ T9284-100 מ"ל ממיסים 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 שימוש בריכוז של 1:200
SMI-312 Sternberger Monoclonals SMI312 שימוש בריכוז של 1:1000
SV2 התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק SV2-Supernatant שימוש בריכוז של 1:10
S100 Dako Z0311 שימוש בריכוז של 1:400
FITC-עיזים אנטי עכבר IgG1 רוש 03117731001 שימוש בריכוז של 1:200, אבל אם הרקע הוא גבוה, לנסות 1:400
אלקסה, פלואוריד 647 עיזים מצומדות נגד ארנב Invitrogen A21244 שימוש בריכוז של 1:200
Vectashield פלורסנט הרכבה התקשורת וקטור מעבדות H-1000 זה לא קשה להגדיר התקשורת, תצטרך להבטיח את פליטת לכסות עם לק ברור.
האביב מספריים קטנים המדע כלים פיין 15002-08
Dissection מלקחיים המדע כלים פיין 11295-51

מקורות

  1. Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
  2. Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
  3. Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
  4. Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
  5. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
  6. Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
  7. Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
  8. Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
  9. Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
  11. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
  12. Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
  13. Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.