כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת פרוסות אורגנוטיפיות בהיפוקמפוס ותרבות
הערה: פרוטוקול זה מאפשר ייצור של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. באופן אידיאלי, לא יותר משלושה בעלי חיים צריכים להיות מומתים ומנותחים בפגישה אחת כדי להבטיח שכל שלב נעשה במהירות וכדי למנוע פגיעה באיכות הפרוסות. השתמש בטכניקה אספטית לאורך כל הדרך.
- ודא שננקטו השלבים הבאים לפני הפעלת פרוטוקול הנתיחה.
- הכינו וסננו לעקר את כל התמיסות מראש באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- שמרו על התמיסות בטמפרטורה של 4°C במהלך האחסון ולאורך כל נתיחת המוח והכנת פרוסות ההיפוקמפוס על ידי שמירה על מיכלי האחסון וצלחות הפטרי על גוף קירור מתכתי היושב על קרח רטוב בכל עת.
- Autoclave כל מכשירי מתכת, טבעות, ורקמות נייר.
- ודא שכל המכשירים והחומרים שישמשו לכל שלב בפרוטוקול מוכנים לשימוש, ערוכים מראש ומרוססים באתנול 70%. לאחר מכן, אפשרו להם להתקרר ולהתייבש.
- הרדימו גור עכבר C57BL/6N בן 5-7 ימים על ידי נקע צוואר הרחם ונגבו לזמן קצר את כל פני העור ברקמת נייר סטרילית ספוגה באתנול 70%. ייבשו את העור בטפיחות קלות וערפו את ראשו של הגור באמצעות מספריים של מאיו.
- חותכים את עור הקרקפת עם מספריים הקשתית לאורך קו האמצע של הראש, החל באזור העורפי וכלה ליד החוטם, ולמשוך אותו לרוחב.
- הכנס את קצה מספריים Vannas לתוך מגנום foramen ובצע שני חתכים רוחביים קטנים על העצם לאורך הסינוסים הרוחביים, ולאחר מכן לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע עד פקעת הריח ולבצע שני חתכים קטנים בניצב לקו האמצע באזור זה.
- בעזרת מלקחיים מעוקלים דקים, משכו את דשי העצם לרוחב מקו האמצע. הוציאו בזהירות את המוח בעזרת מרית קטנה והעבירו אותו לצלחת פטרי מצופה אלסטומר סיליקון בקוטר 90 מ"מ המכילה "מדיום דיסקציה"
הערה: מדיום הדיסקציה הוא תמיסת המלח המאוזנת של גיי (5 מ"ג/מ"ל D-גלוקוז, 1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית, 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין, 10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ו-25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B).
- הסר את המוח הקטן והפרד את חצאי המוח לאורך קו האמצע באמצעות סכין גילוח. השתמשו במרית כדי להעביר את חצאי המוח לצלחת פטרי חדשה מצופה אלסטומר סיליקון בקוטר 90 מ"מ מלאה בתווך דיסקציה טרי וקר כקרח. אם יש להשתמש ביותר מבעל חיים אחד בהפעלה אחת, חזור על שלבים 1.2-1.6.
- תחת סטריאומיקרוסקופ, חתכו את פקעת הריח ואת קצה קליפת המוח הקדמית עם סכין גילוח והפרידו את קליפת המוח משאר רקמת המוח באמצעות מלקחיים עדינים. שלב זה משאיר את ההיפוקמפוס חשוף על פני השטח המדיאלי של רקמת קליפת המוח. משלב זה ואילך, השתמש במכסה מנוע תרבית רקמת זרימה למינרית (אולטרה סגול מעוקר ומנוקה בתמיסת אתנול 70%).
- יש למרוח מדיום דיסקציה קר כקרח על דיסק חיתוך פלסטיק שטוח, ובעזרת מרית, למקם את רקמת המוח על הדיסק כך שהמשטח המדיאלי של קליפת המוח פונה כלפי מעלה וציר ההיפוקמפוס ניצב לציר להב החיתוך.
- מוציאים את מדיום הדיסקציה מדיסק החיתוך ככל האפשר בעזרת פיפטה עדינה של פסטר.
- חתכו את המוח לפרוסות של 400 מיקרומטר באמצעות מסוק רקמות במהירות חיתוך ובכוח של 50%.
הערה: שלב זה חייב להסתיים מהר ככל האפשר, שכן רקמת המוח אינה שקועה במדיום הדיסקציה.
- החליפו את מדיום הדיסקציה בצלחת פטרי מצופה אלסטומר סיליקון בתווך טרי קר כקרח.
- לאחר סיום מסוק הרקמות, השקיעו בזהירות את רקמת המוח בתווך דיסקציה טרי והעבירו את הרקמה החתוכה בחזרה לצלחת פטרי מצופה אלסטומר סיליקון בקוטר 90 מ"מ באמצעות אזמל בעל להב ישר.
- תחת סטריאומיקרוסקופ, הפרידו בזהירות את פרוסות קליפת המוח באמצעות מלקחיים עדינים. עבור כל פרוסה, בדוק את ההיפוקמפוס עבור מורפולוגיה ונזק פוטנציאלי לרקמות כתוצאה מהדיסקציה או החיתוך.
- הפרידו את ההיפוקמפוס מקליפת המוח האנטורינלית ומהפימבריה באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים קטנים של Vannas. בדרך כלל, סביב 6 עד 8 פרוסות היפוקמפוס נוצרות לכל חצי כדור.
- מעבירים עד 6 פרוסות היפוקמפוס לתרבית רקמה בעזרת פיפטה חתוכה של פסטר ומניחים אותה בתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. ודאו שהפרוסות מפוזרות במרחק של כמה מילימטרים זו מזו (כך ניתן יהיה לצלם כל פרוסה בנפרד).
- הוסיפו מיד "מדיום צמיחה" קר כקרח לתחתית כל צלחת פטרי, מתחת לתוספת תרבית הרקמה, ממש מתחת לחלק העליון של שפת תוספת תרבית הרקמה.
הערה: מדיום הגידול מכיל 50% נשר בינוני חיוני מינימלי, 25% תמיסת מלח מאוזנת של הנקס, 25% סרום סוסים, 5 מ"ג/מ"ל D-גלוקוז, 2 mmol / L L-גלוטמין, 1% תמיסה אנטיביוטית-אנטימיקוטית ו 10 mmol / L HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה), titrated pH 7.2 עם hydroxide נתרן.
- שנה את מדיום הצמיחה יום לאחר הדיסקציה וכל 2 עד 3 ימים לאחר מכן (השתמש במדיום צמיחה ב 37 מעלות צלזיוס). ודא כי מדיום הגידול הוא הוסיף מספיק אבל לא עד כדי כך שהוא עולה על גדותיו על קרום החדרת תרבית הרקמה, אשר עלול לסכן את הכדאיות של פרוסות הרקמה.
- לפני השימוש בניסויים, שמור את פרוסות הרקמה באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% פחמן דו חמצני באוויר במשך 12 עד 14 ימים.
2. הכנת פרוסות אורגנוטיפיות של ההיפוקמפוס לפרוטוקול TBI של פיצוץ ניסיוני
הערה: שלבי סעיף זה, למעט הדמיה, מתרחשים במכסה מנוע של תרבית רקמת זרימה למינרית.
- הכנס את טבעות הנירוסטה בהתאמה אישית לצלחת בת 6 בארות (אחת לכל באר).
הערות: לטבעות יש שפה עם חריץ (שאמור לשבת במצב השעה 12) ומתאימות היטב בתוך הבארות, בעוד שתרבית הרקמה נכנסת בקלות לשפה זו. יש לוודא שהטבעות נשטפות בחומר חיטוי קוטל חיידקים, נשטפות היטב במים מטוהרים, עוברות אוטוקלאבינג ומאפשרות להן להתקרר מראש.
- מלאו את הבאר של צלחת 6 בארות עם "מדיום ניסיוני" שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) ללא סרום עם יודיד פרופידיום.
הערה: מדיום ניסיוני עם פרופידיום יודיד הוא 75% מינימום חיוני בינוני איגל, 25% תמיסת מלח מאוזנת של הנקס, 5 מ"ג/מ"ל D-גלוקוז, 2 mmol / L L-גלוטמין, 1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית, 10 mmol / L HEPES ו 4.5 μmol / L propidium iodide, titrated pH עד 7.2 עם hydroxide נתרן.
- ודא שהרמה הבינונית אינה מגיעה מעל לחריץ הטבעת. מעבירים את צלחת 6 הבארות עם הטבעות בחזרה לאינקובטור למשך שעה אחת כדי להבטיח שהתווך נמצא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מיד לפני העברת תוספות תרבית הרקמה.
- מעבירים את תוספות תרבית הרקמה עם הפרוסות האורגנוטיפיות מצלחות פטרי 35 מ"מ לצלחת 6 בארות עם הטבעות ואת המדיום הניסיוני עם מלקחיים.
- צור נקודה על שפת ההוספה במצב השעה 3 עם עט סמן קבוע.
הערה: התוספות יוסרו מלוח 6 הקידוחים במהלך הניסוי. שלב זה מקל על החזרת העלון למקומו המקורי לאחר החשיפה לגלי ההלם ועוקב בקלות אחר כל פרוסה לאורך כל הפרוטוקול.
- תייגו כל צלחת בת 6 בארות בשם ותאריך ייחודיים והכינו מפה של הבארות של כל לוחית, תוך מתן שמות לכל באר (למשל, A, B, C וכו') ולכל פרוסה בכל באר (למשל, 1, 2, 3 וכו'), כך שלכל פרוסה יהיה מזהה ייחודי (למשל, A1, A2, A3 וכו').
- העבירו את צלחת 6 הבארות לאינקובטור למשך שעה אחת מיד לפני ההדמיה כדי להבטיח שהפרוסות יהיו בטמפרטורה של 37°C.
הערה: הימנעו מבועות מדיום או אוויר שעלו על גדותיהם מתחת לקרום החדרת תרבית הרקמה, מה שעלול לסכן את יכולת הקיום של הפרוסות.
- 1 שעות לאחר המעבר למדיום הניסויי, צלם כל פרוסה בנפרד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (2X objective, NA 0.06) המצויד במסנן עירור מתאים (BP 535/50 ננומטר) ופליטה (LP 610 ננומטר) כדי להעריך את בריאות הפרוסה לפני ביצוע פרוטוקול הפציעה.
הערות: יש להתייחס לפרוסות המציגות אזורים של כתמים אדומים צפופים בשלב זה כמציגות כדאיות נפגעת ויש להוציא אותן מניתוח נוסף (אלה מייצגות בדרך כלל פחות מ -10% מכלל הפרוסות שנוצרו). ודא כי ההדמיה מתבצעת ברצף ובמהירות האפשרית כדי למזער את הזמן שהפרוסות נמצאות מחוץ לאינקובטור (בדרך כלל 6 בארות צריכות לקחת קצת פחות מ -30 דקות כדי לצלם).
- יש להשאיר את מכסה צלחת 6 הבארות דולק בכל עת. עיבוי מסוים עלול להצטבר בחלק הפנימי של המכסה. אם זה קורה, השתמשו בקצרה במייבש שיער על ההגדרה הנמוכה.
- ודא שכל תנאי ההדמיה זהים בימים שונים ובין ניסויים.
הערה: מטרת ההדמיה היא לכמת את פלואורסצנטיות הרקמה; לפיכך, שלב זה חשוב כדי להבטיח את יכולת השחזור של התוצאות ולאפשר להשוות את הנתונים.
3. טבילה והובלה של תרבית הרקמה תוספות עם פרוסות אורגנוטיפיות בהיפוקמפוס
- מיד לאחר ההדמיה, במכסה מנוע זרימה למינרית, מוציאים תרבית רקמה אחת מהצלחת בעלת 6 הקידוחים באמצעות מלקחיים.
- העבירו בזהירות את העלון לשקית פוליאתילן סטרילית (3" x 5") מלאה מראש ב-20 מ"ל של מדיום ניסיוני חם (37°C) מבעבע טרי עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני.
הערה: יש לוודא שהתווך הניסיוני המועשר בחמצן ובפחמן דו-חמצני בעבע במשך 40 דקות לפחות עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני באמצעות בועת זכוכית משופשפת בתוך בקבוק דרשל והועבר לשקיות הפוליאתילן הסטריליות בתוך מכסה מנוע של תרבית רקמת זרימה למינרית באמצעות מזרק 20 מ"ל עם מסנן חיידקי וצינור מילוי סטרילי (127 מ"מ) מחובר. אטמו את השקיות מיד והעבירו אותן לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות לפני העברת תרבית הרקמה.
- ודא שכל שקית סטרילית מסומנת כראוי (עם הצלחת וזיהוי היטב). חזור על שלב זה עבור כל תוספת של תרבית רקמה. יש להוציא בזהירות את בועות האוויר עם איטום השקיות הסטריליות (נעשה היטב על ידי סיבוב החלק העליון של השקיות ומריחת מהדק פלסטיק).
- החזירו את השקיות הסטריליות עם תוספות תרבית הרקמה ואת צלחות 6 הבארות עם המדיום הניסיוני לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר שעה, ארוז בזהירות את השקיות הסטריליות עם תוספות תרבית הרקמה בקופסאות פלסטיק בתוך קופסה מווסתת תרמית מלאה במים דה-מיוננים ב -37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על הפרוסות האורגנוטיפיות בטמפרטורה פיזיולוגית לאורך כל פרוטוקול החשיפה לגלי הלם.
4. הכנת צינור ההלם וחשיפת גלי הלם אורגנוטיפית בהיפוקמפוס
- יש ללבוש מגפי מגן מפלדה, מעיל מעבדה וכפפות בעת הכנת צינור ההלם וחשיפת גל ההלם.
- הבריחו את מסגרת מחזיק השקית הסטרילית לאוגן הדיסטלי של צינור ההלם, וודאו שהחור המרכזי מיושר עם יציאת צינור ההלם (באמצעות מוט כיסוי).
- הרכיבו שני מתמרי לחץ באופן רדיאלי: חיישן 1 בחלק האמצעי של החלק המונע וחיישן 2 באוגן הדיסטלי של צינור ההלם (איור 1A). חבר את מתמרי הלחץ לאוסילוסקופ באמצעות יחידת כוח של מקור זרם.
- ודא שכל שסתומי שחרור צינור הזעזועים ובקרות הזרימה סגורים.
- פתח את קו האוויר הדחוס החיצוני וטען את שסתום הסולנואיד ל -2.5 בר.
- פתח את שסתום הבטיחות של גליל האוויר הדחוס ופתח לאט את וסת הלחץ כדי להגביר את הלחץ לכ- 5 bar.
הערה: הלחץ שנקבע עבור וסת זה צריך להיות מעט מעל לחץ התפוצצות הסרעפת הגבוה ביותר.
- מכינים את הסרעפת על ידי חיתוך יריעות פוליאסטר בעובי 23 מיקרומטר לריבועים בגודל 10X10 סמ"ר. הכינו את הידיות באמצעות סרט הדבקה אוטומטי והדביקו אותן לחלק העליון והתחתון של כל דיאפרגמה.
- מקמו דיאפרגמה אחת (חריץ יחיד של העכוז הכפול - תצורת דיאפרגמה יחידה) או שתי דיאפרגמות (שניהם חריצים של העכוז הכפול - תצורת הסרעפת הכפולה) בעכוז (איור 1B).
- מרכז את הסרעפות ומהדק אותן באמצעות ארבעה ברגים ואומים M24, מהדק אותם ברצף בצורה סימטרית אלכסונית ומוודא שהסרעפות נטולות קמטים.
- הדקו כל שקית סטרילית בנפרד במצב אנכי על מסגרת המחזיק, וודאו שפני השטח של תרבית הרקמה עם פרוסות ההיפוקמפוס האורגנוטיפיות פונים ליציאת צינור ההלם ושתוספת תרבית הרקמה ממורכזת בתוך השקית הסטרילית (איור 1C). ודא שהשקית הסטרילית מהודקת היטב מסביב כדי להבטיח יציבות ואפילו השתקה.
- יש להרכיב מגיני אוזניים ומשקפי בטיחות בעת לחיצה על צינור ההלם. הפעל את יחידת הכוח והאוסצילוסקופ של המקור הנוכחי כדי לקבל את נתוני גלי ההלם (קצב רכישה של 50 מגה דגימות לשנייה, אורך שיא 20 אלפיות השנייה, מיליון נקודות) וסגור את שסתום הסולנואיד.
- באמצעות ידית בקרת הזרימה בלוח הבקרה של צינור ההלם, לחץ באיטיות על מקטע נפח ההתקן של צינור ההלם עבור תצורת דיאפרגמה יחידה או הן את מקטע נפח ההתקן והן את מקטע העכוז הכפול של צינור ההלם לתצורת דיאפרגמה כפולה.
הערה: עבור תצורת דיאפרגמה בודדת, לחץ הפיצוץ יהיה תלוי רק בחומר הסרעפת ובעוביו, והסרעפת תיקרע באופן ספונטני ברגע שתגיע ללחץ המתפרץ של החומר. עבור תצורת דיאפרגמה כפולה, לחץ ההתפוצצות יהיה תלוי גם בהפרש לחץ הגז הן בתא הנהג והן בתאי העכוז הכפולים, וכדי שהסרעפת תתפוצץ בצורה מבוקרת, שסתום הבטיחות של העכוז הכפול נפתח ידנית ברגע שמגיעים ללחצי המטרה.
- ברגע שהסרעפת נקרעת (ומייצרת רעש חזק), סגור במהירות את זרימת האוויר הדחוס באמצעות ידית הזרימה ופתח את שסתום הסולנואיד.
הערה: ניתן לשנות את הנפח הכולל של קטע הנהג על ידי הכנסת קטעי ריק, מה שמאפשר טווח רחב יותר של לחץ יתר של שיא גל הלם ומשכי זמן. השילוב האידיאלי של פרמטרים של גלי הלם אמור להספיק כדי לגרום לפגיעה ברקמות, אך לא גבוה עד כדי כך שהוא יגרום להחדרת תרבית רקמה או לעיוות או לקרע סטרילי של השקית.
- חשוף כל שקית סטרילית בתרבית רקמה, הכנס אותה לגל צינור הלם יחיד, והחזיר אותה מיד לקופסה המווסתת בחום לפני ששקית סטרילית חדשה נלקחת מהקופסה ומהודקת על מסגרת המחזיק. ודא ששלבים 4.10-4.14 מבוצעים בצורה חלקה ומהירה ככל האפשר (תוך מספר דקות) כדי למנוע מהמדיום הניסיוני להתקרר, מכיוון שטמפרטורות מתחת ל-37°C עלולות להפריע להתפתחות הפציעה.
- לאחר שכל תוספות תרבית הרקמה נחשפו לגל הלם (או פרוטוקול דמה), יש להחזיר אותן לצלחת המקורית בעלת 6 הקידוחים ולבאר המתאימה להן (בתוך מכסה מנוע של תרבית רקמת זרימה למינרית) ולחזור לאינקובטור.
- שמור את צלחת 6 בארות באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני באוויר ב 37 ° C עד הדמיה חדשה.
- כלול בקרות דמה עבור כל ניסוי ואת החשיפה לגלי ההלם של פרוסה.
הערה: פרוסות שומה מטופלות באופן זהה לפרוסות החשופות לגל הלם (אטומות בשקיות הסטריליות עם תווך ניסיוני, מועברות למעבדת צינור ההלם באותה קופסה מווסתת חום, ומוותלות על מסגרת המתכת לפרק זמן מקביל), אך צינור ההלם אינו מופעל.
