ביסוס מודל מחלת אלצהיימר במוח של דגי זברה באמצעות הזרקת פפטיד עמילואיד

תקציר

Bhattarai, P., et al. מידול עמילואיד-β42 רעילות וניוון עצבי במוח של דגי זברה בוגרים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את ההליך של הזרקת פפטידים עמילואידים מונומריים למוחם הקדמי של דגי זברה בוגרים כדי ליצור רעילות עמילואידית, המחקה את הנזק העצבי שנראה במחלת אלצהיימר

פרוטוקול

1. הכנת פפטיד Aβ42

1. סנתז פפטידים (ראה טבלה 1) באמצעות כימיה סטנדרטית של 9-fluorenyl methoxycarbonyl (Fmoc) עם 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) כמגיב צימוד בסינתיסייזר פפטיד אוטומטי בשלב מוצק. קנה המידה של הסינתזה היה 100 μmol.
2. טען את סינתיסייזר הפפטיד האוטומטי עם 500 מ"ג של שרף מוגן Fmoc כשלב מוצק (קיבולת טעינה של 0.2 mmol / g). טען את חומצות האמינו המומסות המוגנות ב- FMOC בריכוז של 0.5 M בנפח הדרוש וכפי שחושב עבור הסינתיסייזר המתאים.
   הערה: החישובים נעשים כדי לאפשר צימוד של כל חומצת אמינו מוגנת FMOC פעמיים עם עודף של פי 5 מכל אבן בניין לשרף.
3. להמיס את הריאגנטים הדרושים לסינתזה פפטידית בדימתילפורממיד (DMF). לדוגמה, הכינו את האקטיבטור, HBTU, בריכוז של 0.48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (הבסיס), ו-5% v/v אנהידריד אצטי (תערובת הלכידה) כדי לכסות את קבוצות האמינו שאינן מגיבות.
4. נתקו את כל הפפטידים מהשרף על ידי ערבוב רציף של התמיכה המוצקה באמצעות תסיסה בתערובת מחשוף טרייה שהוכנה המורכבת מחומצה טריפלואורואצטית (TFA): טריאיזופרופילסילן (TIS): מים: דיתיותרייטול (DTT) ב 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v) במשך 4 שעות. השתמש 10 מ"ל עבור סולם סינתזה של 100 μmol.
5. מזרזים את המוצר הקרוע על ידי הוספת תערובת המחשוף לאתר דיאתיל קר כקרח של 100 מ"ל. עברו דרך יחידת סינון המכילה מסנן פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) בגודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר ושטפו עם אתר דיאתיל קר כקרח בנפח 20 מ"ל.
6. לאסוף את הפפטיד המסונן מנייר הסינון ולהמיס 100 מ"ג של פפטיד מואץ ב 5 מ"ל מים מזוקקים deionized: acetonitrile ב 1: 1.
7. טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) בשלב ההפוך על HPLC מוכן למחצה המצויד בעמוד פוליסטירן דיווינילבנזן נקבובי בגודל חרוז של 10 מיקרומטר.
   1. חממו מראש את העמוד ותחזקו אותו בטמפרטורה של 50°C באמצעות מכשיר חימום עמודים. אסוף את כל השברים העיקריים באמצעות אספן שברים אוטומטי על ידי החלת שיפוע מ- 5% ל- 100% ממס B במשך 25 דקות ב- 4 מ"ל/דקה<בר/> הערה: ממס A הוא 0.1% TFA במים, וממס B הוא 0.1% TFA באצטוניטריל.
   2. עקוב אחר הכרומטוגרמה ב 220 ננומטר, לאסוף את הפסגות המתאימות, ולנתח באמצעות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית מסה (LC-MS).
8. אשר את הטוהר על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אנליטית בלחץ אולטרה גבוה (UPLC) בשלב ההפוך ב 220 ננומטר, ניטור עם גלאי אולטרה סגול (UV) תוך העברת הדגימה דרך עמודת C18 אנליטית (גודל חרוז 1.7 מיקרומטר). אשר את מוצר הפפטיד על ידי ספקטרומטריית מסות.
   הערה: ה-UPLC מחובר לספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרוספריי (ESI-MS) וגלאי טנדם קוואדרופול.
9. ליופיליזציה של השברים הנכונים של הפפטיד הרצוי בבקבוק בעל תחתית עגולה על ידי מריחת ואקום של 0.052 mbar על אבקה רכה. חברו את משאבת הוואקום ליחידת הקפאה הנשמרת בטמפרטורה של -78°C. אחסנו בטמפרטורה של -80°C ללא הגבלת זמן.
10. השתמש בפפטיד lyophilized כדי להכין תמיסת מלאי של 1 mM בתערובת של acetonitrile, DMF, ומים ברמה אנליטית ב 1: 1: 1 עבור הניסויים. פתרון זה יכול להיות מאוחסן לפחות 6 חודשים, כמו פפטידים לא מצטברים בו.

2. הכנת תערובת ההזרקה

1. הכן מלח חוצץ פוספט (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4) לדילול הפפטידים הליופיליים.
2. ממיסים את הפפטיד לריכוז סופי של 20 מיקרומטר ב-PBS. הכינו פתרון זה טרי. מערבבים היטב ומאחסנים על קרח עד להזרקה. אין לחרוג מ-30 דקות כדי למנוע הצטברות בתמיסה.

3. הרדמה

1. הכינו את תמיסת המלאי של חומרי ההרדמה, 0.1% אתיל-m-אמינובנזואט מתאן-סולפונט (MESAB), במי דגים רגילים ממערכת המחזור. הכינו את תמיסת ההרדמה לריכוז סופי של 0.0025% (v/v).
2. הסר את המספר הרצוי של דגים מן המיכלים שלהם לתוך מיכל הובלה עם 5 L של מי המערכת.
3. חצי למלא צלחת פטרי פלסטיק (90 מ"מ) עם 40 מ"ל הרדמה. השתמש במנה זו לזריקות.
4. דוגרים על הדגים בחומרי ההרדמה עד להפסקת תנועת הניתוח.

4. מיקרו-הזרקה מוחית

1. הכנת מנגנון הזרקה
   1. הכינו את נימי הזרקת הזכוכית באמצעות מושך מחטים עם הפרמטרים הבאים: מחזור חימום, 537; מחזור משיכה, 250; מהירות, 1.5 שניות; זמן, 80 מילישניות.
   2. הבא את הגדרת הלחץ על מקור הלחץ ל- 25 psi.
   3. הגדר את פרמטרי המיקרו-מזרק ל- 20 psi להחזקה ו- 10 psi להוצאה, 2.5 לנקודה ו- 100 ms לגידור.
   4. טען את נימי הזכוכית בתמיסת ההזרקה. הכנס את נימי הזכוכית למחזיק המיקרו-הזרקה. כוונן את זווית ההזרקה ל-45°.
2. הכניסו דג אחד לצלחת פטרי חדשה מלאה בתמיסת הרדמה.
3. החזיקו את הדג עם המלקחיים והתכוונו להזרקה.
4. צור חריץ באמצעות קצה של מחט 30 G בגולגולת מעל טקטום אופטי שבו שני לוחות לרוחב נפגשים. אין להכניס את הקצה לרקמת המוח, הדבר יגרום לדימום ולנזק.
5. הכניסו את נימי הזכוכית לחריץ.
   1. השתמש רק בקצה המחט ולא לחדור יותר מ 1 מ"מ דרך הגולגולת. המשיכו להחזיק את הדג והכניסו את קצה נימי הזכוכית דרך אתר החתך.
   2. כוונו את קצה נימי הזכוכית לכיוון הטלנספלון בזווית של 45°. להזריק 1 μL של התמיסה. הנוזל מתפזר מיד לאחר ההזרקה.

5. החלמה

1. מחזירים את הדג למיכל הובלה עד שהוא מתאושש. חבר את המיכל למי הדגים המסתובבים באופן קבוע כדי להבטיח איכות מים אופטימלית.
   הערה: ההתאוששות אמורה להימשך בדרך כלל דקה. אם זה לוקח יותר זמן, הדג חייב להישמר בהרדמה לזמן קצר יותר (הנסיין צריך לייעל את זה).

תוצאות

טבלה 1: רצפי פפטידים Aβ42 ו-TR-Aβ42.

<...

פפטיד	רצף פפטיד	MW (גר'/מול)
צרפת	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	5919.8

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצות אמינו המוגנות באמצעות FMOC	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)		חומצות אמינו מבוססות FMOC לסינתזה של פפטיד בשלב מוצק (SPPS)
N,N,N′,N′-TETRAMETHYL-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)	RL-1030	מפעיל
אוקסימה	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)	RL-1180	מדכא הגזע
N,N-Diisopropylethylamine	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)	SOL-003	בסיס
דימתילפורממיד	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)	SOL-004	הממס
N-מתילמורפולין	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, גרמניה	A12158	בסיס
1-הידרוקסיבנזוטריזול הידרט (HOBT)	Sigma-Aldrich ושות' LLC. (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)	157260 אולדריץ'	מפעיל
פיפרידין	MERCK KGaA (דרמשטאדט, גרמניה)	822299	מגיב הגנה מפני Fmoc
דיכלורמתאן (DCM)	MERCK KGaA (דרמשטאדט, גרמניה)	106050	הממס
חומצה פורמית (FA)	MERCK KGaA (דרמשטאדט, גרמניה)	100264	רכיב חיץ עבור HPLC
חומצה טריפלואורואצטית (TFA)	MERCK KGaA (דרמשטאדט, גרמניה)	808260	מגיב תערובת Clevage
Triisopropylsilane(TIS)	MERCK KGaA (דרמשטאדט, גרמניה)	233781 אולדריץ'	מגיב תערובת Clevage
אצטוניטריל (עבור UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	הממס
אצטוניטריל (עבור HPLC)	VWR אינטרנשיונל בע"מ, אנגליה	83639.32	הממס
דיאתילתר	VWR אינטרנשיונל בע"מ, אנגליה	23811.326	ממס למשקעים פפטידים
דיתיוטריטול (DTT)	VWR אינטרנשיונל בע"מ, אנגליה	0281-25G	מגיב תערובת Clevage
TentaGel S RAM Fmoc rink amide שרף	Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, גרמניה)	S30023	שלב מוצק עבור SPPS
סינתזת פפטיד מזרקים 5 מ"ל עם מסננים כלולים	Intavis AG (קלן, גרמניה)	34.274	צינור תגובה עבור SPPS ועבור clevage מהשלב המוצק
מסנן Polytetrafluoroethylene (PTFE)	Sartorius Stedtim (Aubagne, צרפת)	11806-50-N	סינון של פפטידים מואצים
מסנן מזרק פוליווינילידנפלואוריד (PVDF)	קרל רוט GmbH + ושות' KG קרלסרוהה	KC78.1	סינון מראש עבור HPLC
סינתיסייזר פפטיד	Intavis, Cologne, גרמניה	ResPep SL	סינתיסייזר פפטידי אוטומטי בשלב מוצק
ברית המים HPLC	ווטרס, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"ב	ווטרס 2998, ווטרס e2695	כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה חצי מכינה לאחור (HPLC)
PolymerX, גודל חרוז 10μm, 250x10 מ"מ	פנומנקס בע"מ גרמניה	00G-4328-N0	פוליסטירן נקבובי divinylbenzene עמוד HPLC
Milli-Q Advantage A10, עם מסנן Milli-Q	EMD Millipore Corporation, בילריקה, מסצ'וסטס, ארה"ב (ארצות הברית)	LCPAK0001	מערכת טיהור מים
יחידת סינון	Sartorius Stedtim (Aubagne, צרפת)	16307	יחידת סינון למשקעים פפטידים
UPLC Aquity עם גלאי UV	ווטרס, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"ב	M09UPA 664M	אולטרה HPLC שלב הפוך אנליטי עבור LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, גודל חרוז 1.7 מיקרומטר, 50x2.1 מ"מ	ווטרס, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"ב	186002350	עמודת C18 אנליטית
גלאי TQ ACQUITY	ווטרס, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"ב	QBB908	ספקטרומטריית מסות יינון אלקטרוספריי (ESI-MS)
ישו אלפא 2-4 LD פלוס + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, גרמניה	16706, 101542	ליופיליזר עם משאבת vaccum
קורא לוחות פרדיגמה	בקמן קולטר
MESAB (אתיל-m-אמינובנזואט מתאן-סולפונט)	סיגמא-אולדריץ'	A5040
צלחות פטרי	זארשטדט	821.472
מלח חוצץ פוספט	לייף טכנולוגיות, GIBCO	10010-056
מחט	בקטון-דיקינסון	305178
מיקרוסקופ מנתח	אולימפוס, לייקה, זיס	משתנה בהתאם ליצרן
פינצטה Dumont	מכשירים מדויקים בעולם	501985
גיליס מנתח מלקחיים	מכשירים מדויקים בעולם	501265
נימי הזרקת זכוכית	מכשירים מדויקים בעולם	TWF10
פיקונופייה	מכשירים מדויקים בעולם	5430-12
משאבת פיקו פנאומטית	מכשירים מדויקים בעולם	SYS-PV820
מאיר טבעת; מדריך אור טבעת	פארקלנד סיינטיפיק	ILL-RLG