עירוי מוחי סטריאוטקסי ישיר של חלבוני עמילואיד-בטא עבור מודל מחלת אלצהיימר

תקציר

מקור: Jean, Y. Y. et al., עירוי סטריאוטקסי של עמילואיד-בטא אוליגומרי לתוך היפוקמפוס העכבר. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את העירוי הסטריאוטקסי המדויק של עמילואיד-בטא לתוך הפיתול המשונן כדי לבסס מודל עכברי של מחלת אלצהיימר. קביעת קואורדינטות מדויקת והעברה מבוקרת של חלבוני עמילואיד-בטא גורמים לפירוק עצבי, משבשים את עיבוד הזיכרון ותורמים להתפתחות מחלת אלצהיימר.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת כלי ניתוח ופתרונות לניתוח

1. Autoclave כל כלי ניתוח נירוסטה.
2. הכינו אתנול 70% על ידי דילול אתנול מוחלט 200 הוכחות עם מים מזוקקים סטריליים באיכות מולקולרית.
3. חבר את מחט 29 G למזרק המילטון. נקו את פנים מזרק ומחט המילטון על ידי משיכה ופליטה של מים ננו-טהורים שוב ושוב למשך דקה אחת. חזור על הליך זה עם אתנול 70%.
   1. הסר את הבוכנה והמחט ממזרק המילטון. אוויר לייבש את החלקים במכסה מנוע זרימה למינרית O/N.
   2. יש להקרין את המחט והמזרק באור אולטרה סגול למשך 30 דקות לפני השימוש.
4. הכינו תמיסת מלח על ידי המסת נתרן כלורי (NaCl) במים מולקולריים לריכוז סופי של 0.9% ממשקל לנפח. יש לעקר את התמיסה על ידי סינונה דרך מסנן נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר.

2. הכנת עמילואיד-בטא אוליגומרי (Aβ1-42)

1. מונומריזציה והשעיה מחדש של Aβ1-42 אנושי רקומביננטי בדימתיל-סולפוקסיד (DMSO) ל-5 מילימטר בדיוק כפי שמתואר בפרסום של פא' ואחרים.
2. יש לדלל 5 mM Aβ1-42 במי מלח סטריליים (1x) חוצצי פוספט (PBS) ל-100 מיקרומטר ביום שלפני הניתוח.
3. מערבבים היטב את התמיסה על ידי טריטורציה.
4. יש לדגור על תמיסת Aβ1-42 למשך 12 שעות בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: פתרונות בקרה כגון דילול DMSO ב- PBS או פפטיד Aβ1-42 מקושקש/הפוך צריכים להיות מוכנים באותו אופן כמו Aβ1-42.

3. קביעת קואורדינטות הזרקה

1. השתמש באטלס המוח של העכבר הבוגר כדי לקבוע את הקואורדינטות המדויקות של הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות (AP), המדיאליות-צדדיות (ML) והגבית-גחונית (DV) עבור אזור המוח המעניין.
   הערה: כדי להמחיש את הטכניקה בחרנו את הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס כמטרה עם הקואורדינטות הבאות מהברגמה: AP, -2.00 מ"מ; ML, ±1.3 מ"מ; DV, -2.2 מ"מ. הסימן השלילי הקודם לערך AP מציין שהוא נמצא 2.00 מ"מ אחורי של הברגמה. סימן ± הקודם לערך ML מציין כיוון שמאל וימין מהמרכז. לבסוף, הסימן השלילי שקדם ל- DV מציין שהוא נע באופן ונטרלי מפני השטח של המוח.

4. הגדרת מסגרת סטריאוטקסית

1. יש ללבוש מסכת פנים כירורגית, מעיל מעבדה נקי וכפפות כירורגיות סטריליות.
2. נגבו את המכשיר הסטריאוטקסי ואת מתאם העכבר עם 70% אתנול.
3. הניחו וילון כירורגי סטרילי על הדלפק.
4. הניחו את המכשיר הסטריאוטקסי עם מתאם עכבר על גבי הרפש הכירורגי הסטרילי.
5. נגבו את כרית החימום של העכבר באתנול 70%. מקמו את כרית החימום מעל מיטת המסגרת הסטריאוטקסית. השתמש בסרט תיוג מעבדה לשימוש כללי כדי להדביק את כרית החימום מעל מיטת מתאם העכבר.
   1. חברו את כרית החימום למשאבת מחזור המים החמים בהתאם להוראות היצרן.
   2. הפעל את משאבת מחזור המים החמים, הגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס והמתן עד שהיא תגיע לטמפרטורה זו.
6. הצמידו את מזרק המילטון 50 μl עם מחט 29 G למסגרת הסטריאוטקסית על ידי הברגתו למוט ההזרקה האנכי הממונע בהתאם להוראות היצרן.
7. הפעל את מעקר החרוזים והמתן עד שיגיע לטמפרטורה שנקבעה מראש של היצרן.
   הערה: זה משמש לחיטוי מכשירי נירוסטה בין בעלי חיים. זה לוקח מכשירים 20 שניות של מגע עם החרוזים לעיקור.
8. הפעילו את הפלטה החשמלית, כוונו אותה ל-42°C והניחו עליה כלוב ריק ונקי.
9. בעוד מזרק המילטון קבוע על המסגרת הסטריאוטקסית, השתמש במזרק הסטריאוטקסי הממונע כדי לשרטט את פתרון Aβ1-42.
   הערה: צייר יותר מ 4 μl של התמיסה לתוך המזרק ולאחר מכן להשתמש מזרק stereotaxic כדי להגדיר את נפח ההזרקה. הפעל את המזרק בהתאם להוראות היצרן.

5. הכנת בעלי חיים

1. קבע את משקל העכבר באמצעות סולם השקילה.
2. מרדימים עכבר עם קוקטייל קטמין/קסילזין במינון של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין על ידי הזרקה תוך צפקית (IP). עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי אובדן רפלקס צביטת הבוהן.
3. לאחר הרגעת העכבר, קחו את קוצץ השיער וגלחו את ראשו כדי לחשוף את העור מעל הגולגולת.
4. הניחו את העכבר על גבי כרית החימום מעל המיטה הסטריאוטקסית.
5. השתמשו במרית כדי לפתוח את הפה ולמקם את השיניים החותכות בתוך מגן השיניים. אבטח את האף מעל פני העכבר. הדקו אותו בעדינות ולא חזק מדי.
6. מקם את פסי האוזן הדו-צדדיים לתוך הבשר השמיעתי כדי לאבטח את הראש. הזיזו כל מוט הצלבה פנימה עד שהוא פוגע בגולגולת, ואז סובבו את הבורג כדי לנעול אותו.
   1. כדי לוודא שהראש מאובטח, השתמש באצבע המורה כדי לדחוף בעדינות כלפי מטה על הראש. אם הראש מאובטח כראוי הוא לא ייפלט או יזוז כאשר לוחצים עליו.
7. יש למרוח טיפת קרם עיניים או טיפת עיניים על העיניים כדי לשמור על לחותן. יש לוודא שהעיניים לחות לאורך כל ההליך הכירורגי.
8. כדי לחטא את אתר הניתוח להשתמש בצמר גפן סטרילי כדי להחיל תמיסת betadine על העור מעל הגולגולת, ואחריו 70% אתנול. בצעו ניקוי לסירוגין של בטאדין ו-70% אתנול פעמיים נוספות.

6. ניתוח ועירוי

1. השתמש באזמל כדי לבצע חתך של 2-3 מ"מ בקו האמצע של הקרקפת, ולאחר מכן השתמש במספריים דקים ישרים כדי להאריך את קו החתך ל 1.0-1.5 ס"מ כדי לחשוף את התפר הסגיטלי, ברגמה, ולמבדה של הגולגולת, ציוני דרך שעליהם מבוססות הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. השתמש מלחציים מיקרו כדי לשמור על העור בנפרד.
   הערה: עמדות הברגמה והלמבדה מוסברות באטלס המוח של העכבר "מוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקסיות".
2. קחו צמר גפן, השרו אותו במי מלח סטריליים והשתמשו בו לניקוי הגולגולת. לאחר מכן, השתמש בצמר גפן יבש ונקי כדי לייבש את הגולגולת.
3. השתמש בעט נקודה דק סטרילי כדי לסמן נקודה על הברגמה. השתמש במיקרומניפולטור הסטריאוטקסי כדי למקם את מזרק המילטון כך שקצה המחט פשוט ייגע בנקודה על הברגמה.
   1. הקלט את קואורדינטת DV.
   2. כדי לבדוק אם ציר AP של הגולגולת ישר, הזיזו את מזרק המילטון לאחור כך שקצה המחט ייגע בנקודת הלמדא
   .
   3. הקלט את מיקום ה- DV. ודא שקואורדינטות DV עבור bregma ו- lambda נמצאות בטווח של 0.5 מ"מ.
      הערה: המטרה היא למזער את ההבדל DV בין bregma ו lambda.
4. השתמש במיקרומניפולטור כדי להחזיר את קצה מחט מזרק המילטון בחזרה לנקודת הברגמה.
5. הקלט את מיקום נקודת הגישה ההתחלתית.
6. חשב את מיקום נקודת הגישה המסתיימת על-ידי הפחתת 2.00 מ"מ מקואורדינטת נקודת הגישה הפותחת.
7. השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם מחדש את מחט מזרק המילטון לקואורדינטת AP הסופית.
8. הקלט את קואורדינטת ML הנוכחית.
9. חשב את קואורדינטות ML המסתיימות משמאל ומימין על-ידי הוספה או חיסור של 1.3 מ"מ מקואורדינטת ML ההתחלתית.
10. השתמש במיקרומניפולטור כדי להזיז את מחט מזרק המילטון לקואורדינטת ML הסיום.
    1. גע בקצה המחט לפני השטח של הגולגולת בשתי קואורדינטות ML המסתיימות ורשום את קואורדינטות DV וודא שהערכים הם בטווח של 0.5 מ"מ.
       הערה: המטרה היא למזער את הפרש ה- DV בין שתי קואורדינטות ML המסתיימות .
    2. בעוד בקואורדינטת סיום למשוך את המחט למעלה 0.5-1 ס"מ מעל הגולגולת. קח עט נקודה דק סטרילי כדי לסמן נקודה על פני הגולגולת. חזור על שלב זה עבור הצד הנגדי של הגולגולת.
11. להניף את מזרק המילטון מהדרך.
12. חבר ראש מקדח 0.8 מ"מ למקדחה. קח את המקדחה בשתי ידיים, הנח מרפקים על פני השולחן ליציבות, ומקם את ראש המקדחה מעט מעל הנקודה החדה בקואורדינטת ML השמאלית או הימנית. הפעל את המקדחה, הורד את קצה המקדח על פני הגולגולת כדי להכניס חור בגולגולת. חזור על שלב זה עבור הצד הנגדי.
    הערה: דימום מסוים עלול להתרחש מהחורים החדשים שהוכנסו. אם יש דימום אז להשתמש צמר גפן יבש נקי לטפוח את הדם.
13. החזירו את מזרק המילטון למקומו מעל אחד מחורי ה-ML החדשים שהוכנסו. הורידו את מחט המילטון ממש מעבר לגולגולת. בשלב זה היזהרו לא לנקב את המוח. כדי לוודא שהמחט עברה את הגולגולת, קחו את האצבע המורה ודחפו בעדינות את המחט כנגד הגולגולת כדי לוודא שהמחט לא יוצאת מהחור.
14. הקלט את קואורדינטת ה- DV המתחילה.
15. חשב את קואורדינטת DV המסתיימת על-ידי הפחתת 2.2 מ"מ מקואורדינטת DV ההתחלה.
16. הורד את המחט למטה לקואורדינטת DV המסתימת.
17. הפעל את משאבת המזרק הסטריאוטקסי כדי לשאוב 4 μl של Aβ1-42 לתוך הפיתול המשונן בקצב של 0.5 μl / min.
18. כאשר העירוי הושלם, תן למחט להישאר במקומה למשך דקה נוספת כדי למזער את זרימת התמיסה החוצה מאתר ההזרקה.
19. הזיזו את המחט לצד השני של המוח וחזרו על שלבים 6.13-6.18.

7. פינוי בעלי חיים וטיפול לאחר ניתוח

1. פתחו את הברגת מוטות האוזניים ואת מגן הפנים/אף. הסר את העכבר מהמנגנון.
2. השתמש במלקחיים בתבנית סטנדרטית של תלמיד כדי לסגור את הקרקפת ולאחר מכן לאטום את הפצע עם תפר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל)	הנרי שיין מדיקל	1049007	100 מ"ג קטמין לכל 1 ק"ג בעלי חיים
קסילזין (20 מ"ג/מ"ל)	הנרי שיין מדיקל	לא זמין	10 מ"ג קסילזין לכל 1 ק"ג בעלי חיים
Aβ1-42	דיוויד טפלו / UCLA	לא זמין	100 מיקרומטר; עמילואיד זה שימש במאמר
Aβ1-42	בכם	H-1368	ניתן להשתמש במקום עמילואיד ממעבדת Teplow
Aβ1-42	פפטיד אמריקאי	62-0-80ב	ניתן להשתמש במקום עמילואיד ממעבדת Teplow
מקושקשת Aβ1-42	פפטיד אמריקאי	62-0-46ב	יכול לשמש כפפטיד בקרה להשוואת Aβ1-42
ג'ל עיניים GenTeal Lubricant	נוברטיס	לא זמין	לשמירה על עיני העכבר לחות במהלך הניתוח; ניתן למצוא בחנויות הפארם המקומיות
Refresh Optive סיכה טיפות עיניים	אלרגן	לא זמין	לשמירה על עיני העכבר לחות במהלך הניתוח; ניתן למצוא בחנויות פארם מקומיות; ניתן להשתמש במקום GenTeal
בטדין	סטולטינג	50998	לחיטוי וחיטוי
מרית עגולה/מחודדת	VWR	82027-490	לפתיחת פה בעלי חיים
בולדוג סרפינים מלחציים (לסת עמומה. 9X1.6 מ"מ; אורך 28 מ"מ)	כלים מדעיים משובחים	18050-28	אופציונלי; לשמירה על הפרדת עור הקרקפת במהלך ההזרקה
מספריים דקים ישרים (קצה חיתוך 25 מ"מ; אורך: 11.5 ס"מ)	כלים מדעיים משובחים	14060-11	לחיתוך הקרקפת
#3 ידית אזמל	כלים מדעיים משובחים	10003-12
#11 להב כירורגי	כלים מדעיים משובחים	10011-00	לביצוע חתך בקרקפת
Student Standard Pattern Forcep (קצה עמום 2.5x1.5 מ"מ; אורך: 11.5 ס"מ)	כלים מדעיים משובחים	91100-12	להחזקת הקרקפת סגורה במהלך התפירה
ערכת גוזם משולבת	קנט סיינטיפיק	CL9990-1201	לגילוח השיער
T / משאבת מים חמים Recirculator	קנט סיינטיפיק	TP-700	לחימום בעל חיים במהלך ניתוח
משטח Warmining לשימוש חוזר (5 אינץ' x 10 אינץ')	קנט סיינטיפיק	TPZ-0510FEA	על חיבורו למחזור המים החמים T/Pump כדי לחמם את בעל החיים במהלך הניתוח
מקדחה מיקרו אלחוטית	סטולטינג	58610	השתמש בקוצי פלדה בקוטר 0.8 מ"מ כדי לקדוח חורים בגולגולת
מכשיר סטריאוטקסי סטנדרטי במעבדה עם מתאם עכבר וחולדות יילודים	סטולטינג	51615
רק עבור מכשיר סטריאוטקסי עכבר	סטולטינג	51730	יכול להשתמש בזה במקום חתול גנוב. #51615
מזרק סטריאוטקסי מובהק	סטולטינג	53311
מעקר חרוזים מזכוכית יבשה	סטולטינג	50287	לחיטוי מכשירי נירוסטה
וילונות כירורגיים סטריליים (18" x 26")	סטולטינג	50981
מזרק המילטון 50 מ"ל, דגם 705 RN SYR, NDL	חברת המילטון	7637-01	להזרקת מוח; השתמש מזרקים שונים עבור פתרונות שונים
29 מחט מד, רכזת קטנה RN NDL	חברת המילטון	7803-06	לחיבור מזרק המילטון להזרקת מוח
1 מ"ל מזרקי שחפת BD	VWR	BD309659	למתן חומרי הרדמה ומי מלח
מחט 30 ("0.5)	VWR	BD305106	למתן חומרי הרדמה ומי מלח
סולם סדרת CS אלקטרוני נייד (Ohaus)	VWR	65500-202	לשקילת בעלי חיים לקביעת מינון הרדמה
פלטה חמה (צלחת עליונה עמומה 7.25x7.25 אינץ')	VWR	47751-148	לחימום בעלי חיים לאחר ניתוח
Sofsilk משי תפר C-1 חיתוך 3/8, 12 מ"מ	קובידיאן	S1173	לסגירת פצע
דבק רקמות Vetbond (3M)	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-361931	אופציונלי: לסיוע בסגירת פצע; יש להשתמש עם תפר.
אפליקטורים סטריליים עם מוט עץ עם קצוות כותנה	פישר סיינטיפיק	22-029-488	לניקוי וייבוש פצעים כירורגיים
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus של Fisherbrand	פישר סיינטיפיק	12-550-15	לאיסוף קטעי מוח
זכוכית כיסוי מיקרו VWR 24 X 50 מ"מ	VWR	48393241	להרכבת שקופיות מיקרוסקופ
מסנן מזרקים Thermo Scientific Nalgene 0.2 מיקרומטר	פישר סיינטיפיק	194-2520	לעיקור תמיסת מלח
סמני עור סטריליים בעלי קצה כפול מבית Viscot Medical	מדליין	VIS1422SRL91	לסימון קואורדינטות על הגולגולת