חקר הצטברות אלפא-סינוקלאין בתאי עצב דופמין עובריים ראשוניים

תקציר

מקור: Er, S. et al., Learning Pre-formed Fibril Induced α-Synuclein Acculation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons.J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את תהליך כימות הצטברות אלפא-סינוקלאין בנוירונים עובריים של עכברי דופמין שטופלו מראש בסיבי אלפא-סינוקלאין שנוצרו מראש. הוא מתאר את השלבים לתיקון, צביעה וכימות של נוירוני הדופמין המכילים אגרגטים אלפא-סינוקלאין באמצעות immunofluorescence.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנה

1. הכינו דופמין נוירון בינוני (DPM) עם 0.46% D-גלוקוז, 1% L-גלוטמין, 1% N2, 0.2% פרימוצין, להשלים עם DMEM/F12. סנן את ה- DPM לאחר ערבוב החומרים. יש לאחסן DPM בטמפרטורה של 4°C ולחמם כל aliquot פעם אחת בלבד.
   הערה: DPM לא צריך להכיל גורם נוירוטרופי נגזר גליה (GDNF), כפי שהוא יפחית הצטברות α-synuclein בנוירונים דופמין.
2. להכין פיפטות זכוכית סיליקון כי הם הידרופוביים מאוד, ובכך למזער את ההתקשרות על פני השטח ואובדן של תאים במהלך הטיפול הראשוני של נוירונים עובריים.
   1. מוסיפים 10 מ"ל של נוזל סיליקון ל-1 ליטר מים מזוקקים ומערבבים על ידי ערבוב בכלי של 2 ליטר. השאירו את פיפטות הזכוכית שקועות בתמיסת הסיליקון למשך 15 דקות.
   2. שטפו את הפיפטות 3-5 פעמים במים מזוקקים. יבשו את הפיפטות למשך הלילה בטמפרטורת החדר (RT) או למשך 1-2 שעות בטמפרטורה של 100-120 מעלות צלזיוס חלל סטרילי מחומם כדי לזרז את הייבוש.
   3. לעקר את פיפטות על ידי autoclaving סטנדרטי בשקית autoclave אטום.
3. הכינו לוחות באר מצופים פולי-L-אורניתין (PO) עם תחתיות שקופות על ידי הוספת 60 μL של תמיסת PO לבארות האמצעיות של צלחת הקידוח 96 שישמשו לזריעה של הנוירונים, תוך השארת לפחות שורה/עמוד אחד של בארות בשולי הצלחת כדי למנוע השפעות קצה. שמור את הצלחת המצופה למשך הלילה ב 4 ° C או 4 שעות ב RT.
4. לפני ציפוי התאים, שאפו PO לחלוטין ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 μL של 1x פוספט חיץ מלוחים (PBS). שאפו 1x PBS מהבארות והשאירו את מכסה הצלחת פתוח לייבוש מלא.
   הערה: ניתן לאסוף PO משומש ולסנן אותו לשימוש חוזר. ניתן לחזור על פעולה זו פעמיים עבור אותו פתרון PO.
5. הוסף 50 μL של DPM לבארות מצופות בעבר. שואפים DPM מהבארות עם קצה פלסטיק של 100 μL ובו זמנית מגרדים את תחתית הבאר בתנועות מעגליות כדי להסיר את הציפוי בהיקף של כל באר. אי מצופה PO יישאר באמצע הבאר.
6. מתחת למכסה מנוע למינרי, הוסף 10 μL של DPM למרכז כל אי מצופה כדי ליצור micro islands.
   הערה: צלחת עם איי מיקרו מכוסים DPM יכולה להישמר מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית למשך 1-2 שעות במהלך בידוד התאים.

2. בידוד רצפת המוח התיכון הגחוני מעוברי עכבר E13.5

הערה: עיינו באיור 1 עבור שלבי דיסקציה של רצפת המוח האמצעי.

1. לפני הנתיחה, מלאו צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ בחיץ של דולבקו ושמרו אותה על קרח.
2. יש להרדים עכברה הרה E13.5 בהתאם להנחיות המוסד. הניחו את העכבר שטוח על גבו ורססו את הגוף הקדמי באתנול 70%. להרים את העור מעל הרחם עם מלקחיים ולעשות חתך עם מספריים כירורגיים לחשוף את הרחם.
3. בזהירות להסיר את הרחם ומניחים אותו לתוך צלחת פטרי מוכן בעבר על קרח.
4. באמצעות מספריים כירורגיים מתחת למכסה המנוע הלמינרי ב- RT, הסר בזהירות את העוברים מהרחם. מוציאים את כל שאריות השליה מהעוברים בעזרת מלקחיים ומניחים אותם בצלוחית פטרי חדשה בקוטר 10 ס"מ מלאה בחיץ של דולבקו.
5. באמצעות מלקחיים או מחטים, חתכו את החלק האחורי של הראש מהמקומות המסומנים בחצים שחורים באיור 1A. הרחיקו את החתיכה החתוכה משאר העובר (איור 1B).
6. הניחו את החלק האחורי של החתיכה החתוכה לכיוון הצופה (איור 1C) וחתכו אותה בעדינות מקאודלית לגולגולתית (איור 1D). מ-0.5 מ"מ מתחת לפתח הגולגולת, חתכו אזור 2 מ"מ²–3 מ"מ², כפי שמוצג באיור 1E.
7. אספו את רצפת המוח התיכון הגחוני (ראו איור 1F) בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק בנפח 1.5 מ"ל. שמור את צינור המיקרוצנטריפוגה על קרח עד שכל רצפות המוח התיכון נאספות בו.
   הערה: לחלופין, ניתן לאסוף את רצפות המוח התיכון באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל לאחר דיסקציה של כל מוחות העובר.

3. הקמת תרביות עובריות ראשוניות מעוברי עכבר E13.5 בפורמט צלחת באר 96

1. לאחר איסוף רצפות המוח התיכון מכל העוברים באותו צינור של 1.5 מ"ל, הסר את שאריות החיץ של דולבקו ושטוף את חתיכות הרקמה שלוש פעמים עם 500 μL של Ca²⁺, Mg²⁺ ללא תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS).
2. הסר HBSS והוסף 500 μL של 0.5% טריפסין לצינור. לדגור אותו ב 37 ° C במשך 30 דקות.
3. במהלך הדגירה, חם 1.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ב 37 ° C, להוסיף 30 μL של DNase I ל- FBS ולערבב. כמו כן, לטש באש את קצה פיפטת זכוכית סיליקון. ודא כי החור אין קצוות חדים והוא בערך באותו גודל כמו 1 מ"ל micropipette tip.
   הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בקצה מיקרופיפטה 1 מ"ל הדבקה נמוכה לצורך טריטורציה. עם זאת, פיפטות זכוכית סיליקון נראה לתת את התוצאות הטובות ביותר.
4. ברגע שהדגירה בשלב 3.2 מסתיימת, הוסף 500 μL של תערובת FBS/DNase לרקמה המעוכלת חלקית. השתמש פיפטה זכוכית כדי triturate את הרקמה בתערובת FBS/טריפסין. עשו טריטורציה עד שהרקמות יתנתקו לחלקיקים זעירים שבקושי נראים לעין. הימנע מבועות במהלך טריטורציה.
5. תן לחלקיקים שנותרו לזרז בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה על ידי כוח הכבידה. מבלי לשנן את המשקע בתחתית, לאסוף את supernatant לתוך צינור פוליפרופילן חרוטי ריק 15 מ"ל.
6. דילל FBS/DNase I משלב 3.3 (98:2) עם 1,000 מיקרוליטר HBSS כדי להשיג FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). מערבבים על ידי פיטינג למעלה ולמטה. הוסיפו 1,000 מיקרוליטר של התערובת החדשה לחלקיקים שנותרו בצינור המיקרוצנטריפוגה. נסה שוב וחזור על שלב 3.5.
7. חזור על השלב הקודם פעם נוספת כדי להשתמש בכל FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. לאחר שכל הסופרנאטנט נאסף בתוך צינור 15 מ"ל (משלבים 3.5, 3.7 ו-3.8), השתמש בצנטריפוגה שולחנית כדי לסובב את הסופרנאטנט (~3 מ"ל) במהירות של 100 x גרם, למשך 5 דקות. הסר את הסופרנאטנט מבלי לגעת בתאים הכדוריים בתחתית.
9. שטפו את כדורית התא על ידי הוספת 2 מ"ל DPM לצינור וסובבו אותה ב 100 x גרם למשך 5 דקות. הסירו את הסופרנאטנט וחזרו על הכביסה 2x כדי למזער את הלכלוך בתאים הכדוריים.
   הערה: השתמש תמיד ב-DPM טרי ומחומם עבור תאי עצב בתרבית. עבור שלבי הכביסה, DPM לא חייב להיות טרי אבל צריך להיות מחומם מראש ל 37 ° C.
10. לדלל את התאים עם DPM טרי וחם ולהעביר אותם צינור מיקרוצנטריפוגה. כמות DPM לדילול תלויה במספר העוברים המשמשים לדיסקציה של רקמות. לדוגמה, השתמש ב- 150 μL של DPM כדי לדלל את התאים המתקבלים מעשרה עוברים.
11. העברת 10 μL של תאים ב- DPM לצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבבים אותם עם 10 μL של 0.4% כתם כחול טריפאן. ספירת תאים חיים (כלומר, Trypan blue negative) באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
    הערה: השתמש ב- 30,000 תאים לציפוי לכל באר כדי להשיג ~ 1,000 נוירוני דופמין לכל באר. אם צפיפות התא גבוהה מ~30,000 תאים ל-6 מיקרוליטר, יש לדלל עוד יותר את התאים עם DPM לפני הציפוי, כך שנפח הזריעה לא יפחת מ-6 מיקרוליטר.
12. מבלי לגעת בתחתית הבארות, הסר את ה- DPM מאיי המיקרו שנוצרו בשלב 1.6.
13. על מנת לקבל צפיפות תאים ניתנת לשחזור בכל באר, מערבבים את התאים על ידי פיפטינג עדין לפני ציפוי בבאר. עם מיקרופיפטה של 1-10 μL, הוסף 6 μL של תאים למרכז הבאר במיקום של כל אי מיקרו לשעבר.
14. מלאו את הבארות הריקות בשולי הצלחת ב-150 מיקרוליטר מים או 1x PBS כדי למזער אידוי מהבארות המכילות תרביות עצביות. לדגור את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 1 שעות.
15. לאחר שעה מוציאים את הצלחת מהאינקובטור, מוסיפים 100 מיקרוליטר DPM לכל באר עם תאים, ומחזירים אותה לאינקובטור.
16. יומיים לאחר הציפוי (יום במבחנה 2, או DIV2), להסיר 25 μL ולהוסיף 75 μL של DPM טרי כדי להביא את נפח המדיה הסופי ל 150 μL ולמנוע אידוי ככל האפשר.
17. החליפו מחצית מהבינוני ב-DPM טרי (כלומר, הסירו 75 מיקרוליטר והוסיפו 75 מיקרוליטר DPM טרי) ב-DIV5. אל תבצע שינויי מדיה לאחר DIV5.

4. השראת צברי α-סינוקלאין בנוירונים עובריים ראשוניים של דופמין על ידי זריעה עם סיבים מוכנים

לאחר כל עבודה עם α-synuclein pre-formed fibrils (PFFs), נקו את מכסה המנוע הלמינרי או כל ציוד שעשוי היה ליצור קשר עם PFFs עם 1% נתרן דודציל סולפט (SDS), ולאחר מכן עם 70% אתנול.

1. לפני הניסוי, דללו את ה-PFFs עם 1x PBS לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל. סוניק את ה- PFFs המדוללים בצינורות מיקרו-צנטריפוגות עם סוניק אמבטיה בהספק גבוה עם קירור אמבט מים ב- 4 ° C למשך 10 מחזורים, 30 שניות ON / 30 s OFF.
   הערה: זה קריטי כי הסיבים להיות sonicated כראוי כדי ליצור שברים ~ 50 ננומטר אורך. ניתן למדוד את גודלם של PFFs סוניים ישירות מתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת של PFFs מוכתמים. ניתן להשיג סוניקציה כמתואר לעיל בסוניקטור אמבטיה בעוצמה גבוהה. לחלופין, ניתן להשתמש בסוניקטור חוד. ניתן לאחסן PFFs סוניים בטמפרטורה של -80°C באליציטוטים קטנים כדי למנוע מחזורי הקפאה/הפשרה מרובים.
2. ב- DIV8, הוסף 3.75 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של PFFs לבאר ל- 150 μL של בינוני בבאר לריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל. השתמש באותה כמות של PBS 1x עבור קבוצת הבקרה.
3. הכן 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS ולאחסן את aliquots ב -20 ° C. לשם כך, בצע את השלבים הבאים.
   הערה: PFA הוא רעיל; יש לעטות מסכה וכפפות במהלך ההכנה, לעבוד תמיד תחת מכסה מנוע למינרי, ולהשליך את כל פסולת PFA מוצקה ונוזלית בהתאם להוראות המוסד.
   1. חם 500 מ"ל של 1x PBS בכלי 1 L. שים מוט ערבוב בכלי ולשים את הכלי על מערבל מגנטי עם פונקציית חימום. התאימו את הטמפרטורה בין 40-60 מעלות צלזיוס כדי למנוע רתיחה תוך שמירה על חום התמיסה .
   2. יש למדוד 20 גרם אבקת PFA מתחת למכסה המנוע במיכל מדידה חד פעמי מפלסטיק. הוסיפו בזהירות את אבקת ה-PFA לכלי המלא ב-1x PBS. התחילו לערבב את הפתרון.
   3. הוסף 200 μL של 5 M נתרן הידרוקסידי לתוך התמיסה ולהמשיך לערבב במשך ~ 15 דקות עד PFA מתמוסס לחלוטין.
   4. לאחר שהתמיסה נראית הומוגנית, הוסף 168 μL של 5 M מימן כלורי כדי לאזן את ה- pH ל~7. בדוק את ה- pH עם רצועות מחוון pH חד פעמיות קבועות צבע.
   5. הוציאו את הכלי מהתנור ואפשרו לו להתקרר ל-RT. סננו את התמיסה והאליציטוט לאחסון ב-20°C-. הפשירו את האליציטוטים ב-RT לפני השימוש, ואל תקפיאו מחדש לאחר מכן.
4. ב- DIV15, הסר את כל המדיה מהבארות על ידי צנרת. הוסף 50 μL של 4% PFA לכל באר כדי לתקן את התאים ולדגור במשך 20 דקות ב- RT. לאחר הדגירה, להסיר את PFA מן הבארות ולהוסיף 100 μL של 1x PBS לכל באר כדי לשטוף את התאים. הסר 1x PBS ושטוף פי 2 יותר.
5. השאירו 100 μL של 1x PBS בכל באר כדי למנוע התייבשות. אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 4°C עד לביצוע אימונוכימיה.

5. צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיה אוטומטית של נוירוני דופמין עובריים ראשוניים ב-96 לוחות באר

1. הסר PBS 1x וחדיר את התאים על ידי הוספת 100 μL של 0.2% Triton X-100 ב- PBS (PBST) לכל באר ודגירה ב- RT למשך 15 דקות.
2. הסר PBST והוסף 50 μL של 5% סרום סוס רגיל (NHS) לכל באר ל- PBST. כדי לחסום את פעילות האנטיגן הלא ספציפית, דגרו ב-RT למשך שעה אחת.
3. לדלל את הנוגדנים העיקריים נגד טירוזין הידרוקסילאז (TH) ו- pS129-αsyn (1:2,000) ב- 5% NHS ב- PBST. מוסיפים 50 μL של נוגדנים מדוללים לכל באר ודגרים לילה ב 4 °C (75 °F).
4. הסר נוגדנים והוסף 100 μL של 1x PBS לכל באר כדי לשטוף את התאים. מוציאים 1x PBS וחוזרים על הכביסה 2x.
5. כדי למנוע הלבנה של מולקולות פלואורסצנטיות, התחל לעבוד בתנאי תאורה מינימליים. יש לדלל את הנוגדנים המשניים המסומנים בפלואורסצנטיות (1:400) ב-PBST. הוסף 50 μL של נוגדנים מדוללים לכל באר ודגר ב RT במשך 1 שעות.
6. הסר את תמיסת הנוגדנים והוסף 100 μL של 1x PBS לכל באר כדי לשטוף את התאים. מוציאים 1x PBS וחוזרים על הכביסה 2x.
7. הסר PBS 1x, הוסף 50 μL של 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לכל באר כדי להכתים את גרעיני התאים בתרבית, ודגור ב- RT במשך 10 דקות.
8. לשטוף תאים 3x עם 100 μL של 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד. שמור 100 μL של 1x PBS בכל באר לאחר הכביסה האחרונה. כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
9. תמונה נוירונים עובריים ראשוניים של דופמין בלוח תצוגה 96 עם סורק לוחות בעל תוכן גבוה (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרה של פי 10.
10. התאם את ההגדרות בהתבסס על המפרט של צלחת באר 96, כגון סוג הצלחת, יצרן, גודל, מרחק בין בארות, כמו גם סוג וכמות המדיום.
11. בחר את אזור ההדמיה של הבאר כדי לכסות את כל התאים באי מיקרו. בחר דוגמה היטב כדי להתאים את המיקוד האוטומטי. בסס את המיקוד הראשוני על DAPI.
12. כיילו את זמן הרכישה של כל תעלה פלואורסצנטית בהתבסס על עוצמת הצביעה בבארות בקרה. התאם את הפרמטרים כך שבבארות בקרה המטופלות ב- PFF, ניתן להבחין בבירור בתאי דופמין המכילים צברי pS129-αsyn בסומה של תאים, מה שמאפשר כימות חד משמעי של תאים חיוביים pS129-αsyn ו- pS129-αsyn שליליים.
    הערה: בארות שאינן מכילות PFFs לא צריכות להיות בעלות כתמים עבור pS129-αsyn; לכן, בארות אלה יכולות לשמש כבקרה שלילית להתאמת עוצמת pS129-αsyn.
13. תמונה כל הבארות שנבחרו עם מטרה 10x בו זמנית עבור כל הערוצים עם צביעה immunofluorescence עם אותם פרמטרים בדיוק.
14. לחלופין, יש לסמן תכלילי α-סינוקלאין בתת-קבוצה של הבארות עם נוגדנים ספציפיים ל-α-סינוקלאין נימה כדי לאשר ששינויים במספר התכלילים החיוביים ל-pS129-αsyn משקפים את הירידה בהצטברות החלבונים ולא עיכוב של זרחן או דה-פוספורילציה של pS129-αsyn.
15. חזור על שלב 5.3, החלפת נוגדן pS129-αsyn בנוגדן נימה α-synuclein (1:2,000). דמיינו את α-סינוקלאין המצטבר המוכתם כמו בשלב 5.13.

תוצאות

איור 1: דיסקציה של רצפת המוח התיכון מעובר עכבר E13.5. (A) מיקומי חיתוך בחלק האחורי של הראש מסומנים בחצים שחורים ובקווים מקווקווים לבנים. (B) החתיכה הוצאה משאר העובר. החתיכה שהוסרה מעוגלת. (C) היצירה הופנתה ב-90° כדי לפנות לאחור לכיוון הצופה. (D) היצירה נפתחה מהחצים השחורים, מהקאודליים לגולגולתיים (מסומנים בקו מקווקו לבן). (E<...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.4% טריפאן כתם כחול	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	15250061
15 מ"ל CELLSTAR צינור פוליפרופילן	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, גרמניה	188261
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	10236276001
5 מטר הידרוכלור	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
5 מטר נאוה	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
ViewPlate עם 96 בארות (שחור)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ארה"ב	6005182
99.5% אתנול (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, פינלנד	לא ישים
AquaSil נוזל סיליקון	Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	TS-42799
צינור מיקרוצנטריפוגה Autoclaved 1.5 מ"ל	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
התקן סוניקציה Bioruptor	Diagenode, Liege, בלגיה	B01020001
Ca2+, Mg2+ חינם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	14175-053
חבילות התוכנה CellProfiler ו-CellAnalyst	לא ישים	לא ישים	תוכנת קוד פתוח בחינם
צנטריפוגה 5702	Eppendorf AG, Hamburg, גרמניה	5702000019
אינקובטור CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	לא ישים
תא ספירה	BioRad Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב	1450015
מיקרוסקופ DeltaVision ברזולוציה גבוהה במיוחד עם שולחן אוויר וארון	GE Healthcare Life Sciences, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב	29254706
Deoxyribonuclease-I (Dnase I)	Roche, Basel, שוויץ	22098700
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	21331–020
חמור נגד עכבר AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	A21202
חמור נגד ארנב AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	A31573
חמור נגד כבשים AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	A11015
החיץ של דולבקו	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
סרום בקר עוברי (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	10500056
חטיף ערבוב Fisherbrand Plain Economy PTFE	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	11507582
מערכת הדמיה אוטומטית ImageXpress Nano	התקנים מולקולריים, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב	לא ישים
ל-גלוטמין	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	25030–032
עכבר חד שבטי אנטי טירוזין הידרוקסילאז	Millipore, Merck KGaA, דרמשטאדט, גרמנית	MAB318
תוספת N2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	17502–048
סרום סוסים רגיל	Vector Laboratories Inc., ברלינגיים, קליפורניה, ארצות הברית	S-2000
פרפורמאלדהיד (PFA)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	158127
אבקת פרפורמאלדהיד, 95%	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	158127
pH-Fix, רצועות מחוון קבועות צבע	Macherey-Nagel, Düren, גרמניה	92110
מלח חיץ זרחן (PBS)	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
פולי-L-אורניתין	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	עמ' 4957
פרימוצין	InvivoGen, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב	ANT-PM-1, ANT-PM-2
נימה חד-שבטית אנטי-אלפא-סינוקלאין של ארנב	Abcam, Cambridge, בריטניה	ab209538
ארנב חד שבטי אנטי-פוספה-סרין129-אלפא-סינוקלאין	Abcam, Cambridge, בריטניה	dorit_1999
RCT Basic, מערבל מגנטי IKA	IKA-Werke® GmbH, Staufen, גרמניה	3810000
גורם נוירוטרופי רקומביננטי אנושי נגזר גליה (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, ניו ג'רזי, ארה"ב או Prospec, נס-ציונה, ישראל	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
עכבר רקומביננטי אלפא סינוקלאין פיברילים מעוצבים מראש (PFFs)	לא ישים	לא ישים	מתנת משתף פעולה, פרופ' קלווין סי לוק
מערכת סטריאומיקרוסקופ מחקרית	Olympus Corporation, טוקיו, יפן	SZX10
כבשים polyclonal אנטי טירוזין hydroxylase	Millipore, Merck KGaA, דרמשטאדט, גרמנית	dorit_1542
מונה תאים אוטומטי TC 20	BioRad Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב	1450102
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	11332481001
טריפסין	MP Biomedicals, Valiant ושות', Yantai, שאנדונג, סין	2199700