אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית במודל חולדה באמצעות מכשיר הקשה נוזלי לרוחב

תקציר

מקור: McGuire, M. J., et al. שימוש במערכת EEG וידאו אלחוטית לניטור הפרשות אפילפטיות בעקבות פגיעה מוחית טראומטית הנגרמת על ידי נוזל הקשה לרוחב. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון הזה מדגים את האינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) בחולדה באמצעות מכשיר של פגיעת הקשה נוזלית רוחבית (FPI). ההליך כולל יצירת חור בגולגולת של חולדה מורדמת כדי לחשוף את הדורה מאטר, שאליה מחוברת צינורית. לאחר מכן החולדה מחוברת למכשיר, שמייצר גל לחץ שמגיע למוח, ומחקה TBI על ידי גרימת מוות של תאים עצביים ונזק לכלי הדם

פרוטוקול

1. פציעת כלי הקשה נוזלית

1. ללבוש חלוק מעבדה או חלוק כירורגי, מסכה כירורגית, כפפות כירורגיות וכיסוי ראש ולעקר את כל הכלים והחומרים שבאים במגע עם אתר הניתוח.
2. להרדים חולדת וויסטאר זכר בת 10-12 שבועות (350-400 גרם) עם 3% איזופלורן ו-1 ליטר / דקה חמצן בתא אינדוקציה בגודל מתאים לחולדות. הוציאו את החולדה מתא האינדוקציה והעבירו אותה לאזור ההכנה ברגע שהיא מחוסרת הכרה. הכניסו את משחת העיניים הסטרילית לשתי העיניים.
3. גלח את השיער על ראש החולדה עם קוצץ חשמלי עם להב #40 ממש מעל העיניים לבסיס הזנב של האוזניים כדי לייצר מספיק שדה ניתוח. הסר כל שיער רופף וקצוץ מהאתר.
4. נקו את אזור הניתוח על ידי מריחת פילינג כלורוהקסדין 2% על הקרקפת המגולחת ואחריו 70% אתנול. התחל במרכז והתקדם החוצה במעגלים קונצנטריים הרחק ממקום החתך. חזור על תהליך זה 3 פעמים. יש למרוח תמיסת בטדין על המקום באותו אופן ולהניח לייבוש.
5. הנח את החולדה המורדמת לתוך המסגרת הסטריאוטקסית ושמור על הרדמה ב-2-3% איזופלורן-1 ליטר לדקה חמצן דרך האף. בדוק אם יש אובדן רפלקס נסיגה של הגפה האחורית ואובדן רפלקס פלפברלי כדי לוודא שהחולדה נמצאת במישור כירורגי של הרדמה.
6. עקוב אחר קצב הנשימה, קצב הלב, טמפרטורת הגוף וריווי החמצן לאורך כל הניתוח. שמור על דופק בין 300-400 פעימות לדקה, ו-SpO₂ מעל 90%.
   הערה: ניתן להשתמש באוקסימטר דופק המחובר לרגל אחורית כדי לספק קריאה קבועה של דופק ו-SpO₂. דופק מעל 400 פעימות לדקה מצביע על כך שהחולדה אינה מורדמת מספיק. ניתן למקם כרית חימום בעלת ויסות עצמי, יחד עם מדחום רקטלי, המוגדר על 37 מעלות צלזיוס, מתחת לחולדה לאורך כל הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. סטריאומיקרוסקופ עם מקור אור בשילוב מנורת סיבים אופטיים מועילים להמחשת ההליך.
7. השתמש במחט של 23 גרם כדי להזריק 0.5% בופיבקאין הידרוכלוריד תוך עורית לקרקפת במקום החתך לשיכוך כאבים מקומי 10 - 15 דקות לפני ביצוע החתך.
8. בצע חתך בקו האמצע של 1.5-2.5 ס"מ דרך העור והשריר של הקרקפת באמצעות להב אזמל #10. החזר את העור והשריר כדי לחשוף את הגולגולת ולספק שדה כירורגי ברור. לשקף את הפאשיה הבסיסית ורקמת השומן הרחק מהעצם בעזרת צמר גפן סטרילי.
   הערה: יחידת צריבה חשמלית שימושית להשגת המוסטזיס מהיר.
9. גלח את הרכס הצדדי של העצם הקודקודית השמאלית באמצעות קורט כירורגי כדי לייצר משטח שטוח וחלק כך שבסיס רכזת הנעילה של לואר נקבה-נקבה יוכל לנוח צמוד לגולגולת.
10. להשקות את פני הגולגולת והרקמות הסובבות אותה בתמיסת גנטמיצין של 2.0 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים. כתם תמיסה עודפת בעזרת ספוגית סטרילית.
11. מרחו 3% מי חמצן על הגולגולת כדי לייבש את העצם.
    הערה: אם העצם אינה יבשה מספיק, המלט הדנטלי לא יידבק כראוי וייצור אטימה מוצקה.
12. צור אתר כריתת קרניקטומיה בקוטר 5 מ"מ דרך העצם הקודקודית השמאלית.
    הערה: סיבית טרפין המונחת לתוך מקדחה חשמלית המחוברת למסגרת הסטריאוטקטית יכולה להיות מועילה להתחלת כריתת הקרניקטומיה. השתמש במקדחה ידנית עם טרפין בקוטר 5 מ"מ כדי לסיים לאט את כריתת הקרניקטומיה דרך העצם שנותרה. כאשר אתה קרוב להשלמת כריתת הקרניקטומיה, סובב את הטרפין לאחור כדי למנוע קרע של הדורה מאטר הבסיסי. יהיה דילול של הגולגולת סביב היקף הדיסק ודש הגולגולת ירגיש רופף בלחיצה קלה.
13. הסר את דש העצם בעזרת הקורט הכירורגי ומלקחיים לרקמות חלקות.
    הערה: דימום מסוים עשוי להתרחש, אך ניתן להשיג המוסטזיס במהירות על ידי הפעלת לחץ עדין עם צמר גפן סטרילי.
14. השתמש בסטריאומיקרוסקופ ובתאורה כדי לבדוק חזותית את הדורה לאיתור סימני קרע. שפה דקה של עצם תישאר סביב היקף אתר כריתת הקרניקטומיה. הסר בעדינות את השפה הזו עם מלקחיים רקמות חלקות תוך הקפדה לא לקרוע את הדורה.
15. ספוג את הגולגולת עם 70% אתנול כדי להסיר אבק עצם ולייבש את הגולגולת.
16. מרחו שכבה דקה של דבק ג'ל ציאנואקרילט סביב הקצה התחתון של רכזת הנעילה של Luer והדק אותה לגולגולת מעל כריתת הקרניקטומיה מבלי לחסום את הפתח. היזהר לא להביא דבק במגע עם הדורה. יתר על כן, אטום את מנעול ה-Luer במקומו עם שכבה דקה נוספת של דבק סביב הבסיס החיצוני של הרכזת.
17. הכן slurry של מלט שיניים. מרחו את המלט על פני הגולגולת סביב ומעל בסיס רכזת הנעילה של Luer כדי לאבטח אותו במקומו.
18. מלאו את רכזת הנעילה של Luer בתמיסת נוזל מוחי מלאכותי (CSF) סטרילית ללא חומרים משמרים (pH 7.4) באמצעות מזרק ומחט כך שניתן יהיה לראות בולוס קמור של מי מלח מעל החלק העליון של השפה.
    הערה: התמיסה תשמור על לחות הדורה כאשר המלט הדנטלי מתייבש וכן תשמש כאינדיקציה לשלמות האיטום. אם רמת התמיסה יורדת בכלל, זו אינדיקציה לדליפה במערכת ויש להסיר ולהחליף את מנעול ה-Luer.
19. לאחר שהמלט הדנטלי נרפא לחלוטין, הפסק את הרדמת הגז והסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית.
20. הנח את החולדה על פלטפורמה ליד מכשיר ה- FPI.
21. למכשיר FPI יש קצה מתכת מעוקל המשתרע ממתמר הלחץ בקצה מאגר הנוזל. אבטח צינור לחץ באורך 12 ס"מ לקצה הקצה המעוקל כאשר הקצה הנגדי מסתיים במחבר טוויסט מנעול Luer זכר 2 ס"מ. אבטח את החולדה למכשיר FPI על ידי חיבור הקצה הנקבי של הרכזת בגולגולת החולדה למחבר הזכר.
    הערה: ודא שהחיבור מאובטח היטב ושכל בועות האוויר הוסרו מהמערכת.
22. הנח את החיה בשכיבה חזה ובדוק שוב ושוב אם יש חזרת רפלקס נסיגה. ברגע שהחולדה מחזירה את רפלקס הנסיגה אך עדיין מורדמת, שחרר את המטוטלת של מכשיר ה-FPI כדי לגרום לדופק לחץ יחיד של 20 אלפיות השנייה ולגרום לפציעה.
    הערה: חשוב לא לגרום לפציעה בזמן שהחיה מורדמת עמוק מכיוון שהדבר נוטה לגרום לתמותה מוגברת עקב בצקת ריאות הנגרמת על ידי נוירוגניה. כל המכשירים מראים שונות. עם זאת, במכשיר המשמש לניסוי זה, מיקום זווית של 17 מעלות של הפטיש מייצר דופק לחץ אטמוספרי של 2.2 - 2.3. ללא פציעה, בעלי חיים מזויפים עוברים את כל אותם הליכים למעט דופק הנוזל בפועל כדי לגרום לפציעה.
23. נתק מיד את החולדה ממכשיר ה-FPI לאחר הפציעה, הנח אותה בשכיבה על החזה וספק חמצן משלים (1 ליטר לדקה) דרך חרוט האף עד שהנשימה הספונטנית חוזרת. דום נשימה הוא תוצאה צפויה של הפציעה. במידת הצורך, ספקו נשימות ידניות תקופתיות באמצעות מסכת שסתום שקית עד שהחולדה מתחילה לנשום באופן ספונטני בכוחות עצמה.
    הערה: בדרך כלל, דום נשימה נמשך פחות מ-2 דקות. עלייה מהירה חולפת בקצב הלב (>500 פעימות לדקה) נצפית מיד לאחר מתן דופק הלחץ עקב פרץ קטכולאמין. ניתן לנטר זאת באמצעות אוקסימטר דופק המחובר לכף הרגל של החולדה ויכול לשמש אינדיקטור אפשרי לכך שהתרחשה פציעה קשה.
24. עקוב אחר החולדה באופן רציף ורשום את זמן החזרה של רפלקס ישר (אמבולציה יציבה בכל ארבע הגפיים).
25. גודל דופק הלחץ האטמוספרי עבור כל חולדה צריך להיות בטווח של ± 0.05 אטמוספרות זו מזו. ודא שכל אחד מפולסי הלחץ מייצר אות חלק על האוסילוסקופ עם משרעת ומשך עקביים.
    הערה: אות רועש עשוי להצביע על בועות אוויר במערכת שיש להסיר לפני העברת דופק הפגיעה. פעימות לחץ אטמוספרי המייצרות פציעה חמורה, בניסוי זה, הן אלה שבדרך כלל גורמות לזמני תיקון של בעלי חיים של 30-60 דקות. טווח זה של זמני יישור קשור לשיעור תמותה של כ-40-50%).
26. יש לתת 10 מ"ל של מי מלח שחוממו מראש באופן תת עורי כטיפול תומך.
27. החזירו את החולדה לכלוב הבית שלה ואפשרו לה להתאושש למשך 4 שעות לפחות.
    הערה: נצפתה תמותה מוגברת כאשר החולדות מוחזרות מיד להרדמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.00 מ"מ מקדחים	עיר מקדחים: כלי קרביד חדשים	05M200
3M ESPE Durelon Carboxylate צמנט	3M , נויס גרמניה	38019	צמנט דנטלי
4-0 Suture	אתיקון, סומרוויל, ניו ג'רזי	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26 מ"מ 1/2c Taperpoint, 30 אינץ' (75 ס"מ), תפר שחור קלוע לא נספג
5 מ"מ קוטר חיצוני טרפין	כלים מדעיים	18004-50
דומונט #6 מלקחיים	כלים מדעיים	11260-20
דומונט #7b מלקחיים	כלים מדעיים יפים	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, פולס צ'רץ', וירג'יניה
נקבה Luer חוט סגנון מצמד שקוף פוליקרבונאר	כלי קול-פאלמר	SKO#45501-22	פריט הזמנה #214271
תרגיל כוח רגל	גרובט, ארה"ב, קרלשטאדט, ניו ג'רזי	דגם C-300
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution)	Phoenix, מיוצר על ידי Clipper Distributing Company LLC, St. ג'וזף, MO		NDC 57319-520-05
דיאטת המרשם של Hill's a/d כלבים/חתולים	Hill's Pet Nutrition, Inc. , טופקה, קנזס
תוכנת IOX2	EMKA Technologies, פולס צ'רץ', וירג'יניה
איזופלורן, USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, India		NDC 66794-013-25
מכונת הרדמה IsoTech	SurgiVet	WWV9000
התקן FPI לרוחב	AmScien	302	קצה מעוקל, עם הארכת צינורות לחץ. מחובר באמצעות מחבר מנעול בורג (Cole-Palmer; #4550-22)
סטריאומיקרוסקופ Leica A60	Leica Biosystems, ריצ'מונד, וירג'יניה	PN: 10 450 488
מרקאין (0.5%) Bupivacaine hcl זריקת usp 5 מ"ג/מ"ל	הוספירה, לייק פורסט, אילינוי	CA-3627	50 מ"ל בקבוקון מינון מרובה; NDC 0409-1610-50
מלקחיים מיקרו-אדסון	כלים מדעיים יפים	11018-12
מחזיקי מחט אולסן-הגר עם חותכי תפרים	כלי מדע עדין	12002-14
צמנט עצם PALACOS R+G עם גנטמיצין	Heraeus,	סימוכין: 5036964	צמנט עצם רדיופאק המכיל 1 x 0.5 גרם גנטמיצין
תמיסת פובידון-יוד			בטאדין
Puralube Vet Ointment	Dechra Veterinary Products, אוברלנד פארק, קנזס		NDC 17033-211-38
להב אזמל (#10) ומחזיק	אינטגרה מילטקס, יורק, פנסילבניה	סימוכין: 4-110
ידית אזמל - #4	כלים למדע עדין	10004-13
סכין מגל	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1705 HM	להב מעוקל 5 מ"מ. ידית עגולה. אורך כולל 168 מ"מ, 6.6 אינץ'.
סילברסטיין מיקרו מראה	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1706 S8	קוטר 3 מ"מ. בזווית של 45 מעלות. אורך כולל 180 מ"מ, 7.2 אינץ'
Thermal Cautery Unit	Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA	מספר דגם: 150
Vetivex	Dechra Veterinary Products, אוברלנד פארק KS		הזרקת pHyLyteTM וטרינרית pH 7.4 (הזרקת אלקטרוליטים מרובים, סוג 1, USP)
חולדות IGS של וויסטאר	נהר צ'ארלס	קוד זן 003	בן 12 שבועות בזמן הפציעה
מפסק וולשטיין	כלים מדעיים	17018-11