הדמיה ומיפוי של פלאק עמילואיד המסומן ב-Methoxy-X04 בקטע מוח של עכבר במחלת אלצהיימר

תקציר

מקור: Bisht, K., et. al. מיקרוסקופיה של אור ואלקטרונים בקורלציה לחקר אינטראקציות מיקרו-גליאליות עם פלאק β-עמילואיד. J. Vis. exp. (2016)
}

סרטון זה מדגים את ההדמיה והמיפוי של פלאק עמילואיד מתוקסי-X04 במוח עכבר של מחלת אלצהיימר חתכים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ושדה בהיר, המאפשרים מתאם מדויק של פלאק עם מבנים אנטומיים לחקר פתולוגיה של אלצהיימר.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. סינון קטע לנוכחות של לוחות מוכתמים במתוקסי-X04

1. }בעזרת אטלס מוח של עכבר סטריאוטקסי, בחר קטעי מוח המכילים את אזור העניין, למשל, ההיפוקמפוס CA1 כפי שנעשה בו שימוש בדוגמה הנוכחית. הנח כל חלק לבאר בתוך צלחת תרבית של 24 בארות המכילה מספיק תמיסת קריופרוטקטנט כדי למנוע את התייבשות החלקים.
2. בדוק כל קטע ברצף כדי להימנע מייבוש הקטעים באמצעות ההליך הבא:
   1. הוסף טיפה של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לשקופית מיקרוסקופ עם פיפטה חד פעמית והנח את הקטע על הטיפה.
   2. בדוק את הקטע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות אזורים המכילים מתוקסי-X04 המסומנים בפלאק Aβ.
      הערה: מתוקסי-X04 ניתן להמחשה בקלות באמצעות מסנן אולטרה סגול פלואורסצנטי (UV) (עירור 340 - 380 ננומטר).
3. צלם תמונות של אזורי עניין (ROI) בשדה בהיר כמו גם במצב פלואורסצנטי מבלי להזיז את שלב המיקרוסקופ, מכיוון שכל תמונה חייבת להראות את אותו אזור בשני השדות על מנת לתאם את נוכחות הפלאק ישירות לאזור המבני של קטע הרקמה.
4. שמור ותן שם לתמונות שצולמו בהתאם למספר החיה. רשום גם את מספר הבאר בצלחת ואת שדה התמונות שצולמו. לדוגמה, לדוגמה: 9978A1B; מספר בעל חיים: 9978; מספר באר: A1; שדה: בהיר. החזר את החלק לבאר המיועדת לו לאחר השלמת ההדמיה.
   הערה: בסופו של דבר, עבור כל חלק שנבדק, מתקבלות שתי תמונות, אחת בשדה בהיר ואחת בשדה UV.
5. פתחו את שתי התמונות של אותו ROI (אחת בשדה בהיר והשנייה בשדה UV) בתמונה J, ובעזרת התוסף MosaicJ, יישרו את הקצוות של שתי התמונות ושמרו את התמונה המיושרת והמשולבת לפי מספר הבאר שממנו הגיעה.
6. שמור את התמונה בתיקיה נפרדת עם מספר החיה המסוימת. שלב את התמונות כדי לזהות ולמקם את הפלאק בקטע הרקמה ולקבל תצוגה מלאה של כל החלק בשני השדות השונים (בהיר ו-UV).
7. לאחר השלמת תהליך הסינון, אחסן את החלקים שנבדקו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בצלחת תרבית של 24 בארות המכילה קריופרוטקטנט עד לביצוע צביעה חיסונית או עיבוד נוסף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Methoxy-X04	Tocris Bioscience	4920	10 מ"ג מצע לטבליה
מיקרוסקופ שקופיות	Fisher Scientific	12-550-15
24-well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	353047
אתילן גליקול	Fisher BioReagents	BP230-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-4