Method Article

בידוד & אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

DOI:

10.3791/3159

⸱

October 26th, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Charles C. Gates Regenerative Medicine and Stem Cell Biology Program, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver, 3Cancer Center, University of Colorado Denver, 4Webb Waring Institute, University of Colorado Denver

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מדגימים את הבידוד של Murine ריאות תושב בתאי גזע mesenchymal (ריאות MSC), הרחבה שלהם, אפיון וניתוח של מאפייני המערכת החיסונית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תושב רקמות mesenchymal בתאי גזע (MSC) הם הרגולטורים חשוב לתיקון רקמות או התחדשות, סיסטיק דלקת, אנגיוגנזה היווצרות הגידול. יחדיו מחקרים אלה מראים כי MSC ריאות תושב לשחק תפקיד במהלך הומאוסטזיס פגיעה ברקמת הריאה, ולתקן במהלך מחלות כגון פיברוזיס ריאתי (PF) ויתר לחץ דם עורקי (PAH). כאן אנו מתארים בטכנולוגיה כדי להגדיר אוכלוסייה של MSC ריאות תושב. ההגדרה של אוכלוסייה זו ברקמת הריאה vivo באמצעות להגדיר סט של סמנים מאפשר בידוד חוזרות ונשנות של אוכלוסייה היטב מאופיינת בתאי גזע על ידי זרימת cytometry ולימוד סוג תא תפקוד ספציפי.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ריאות בידוד

  1. הקורבן עכברים בוגרים (80-10 שבועות גיל: 18-20 גרם; C57Bl6J) בעכברים עם ממנת יתר של isoflurane ואחריו exsanguination באמצעות טכניקה סטרילית. פרופילים ישתנו מעט בין זנים.
  2. להסיר בניתוח את הסרעפת, לפתוח את בית החזה על ידי חיתוך בית החזה רוחבית בכל צד של העכבר. רוקן את הדם לריאות על ידי המרוססת את החדר הימני בלב בעדינות באמצעות 3-5mls של פוספט בופר סליין (PBS).
  3. מנתחים את אונות הריאה הסרת קנה הנשימה הסמפונות וגדולים מקום בצלחת פטרי מלאות הנקס שנאגרו מלוחים (HBSS). בעקבות אוסף של כל מלקחיים אונות הריאה משמשים מקום רקמה על המכסה של המנה. רקמות הוא טחון אז לחתיכות קטנות באמצעות אזמלים חד פעמיות עם נוזלי מספיק כדי לשמור אותם לחים, אבל לא עד כדי כך שהם לצוף ולנוע.
  4. לנתח hindlimb של אחד העכברים ולבודד את מח העצם להשתמש כביקורת מכתים להגדיר את פלוw cytometry שערים. הכתם מח העצם (BM) כפי שתואר לעיל 1.

2. הכנת תרחיף תא בודד מתוך רקמת הריאה

  1. הריאות כל מתעכל באמצעות משקל רקמת אופטימיזציה יחס נפח של 0.2g: 5mls של טרום חימם 0.2% וורטינגטון סוג 2 collagenase (ביוכימיקלים וורטינגטון, לייקווד, ניו ג'רזי; חתול # LS004202) מומס HBSS סטרילית. התערובת הוא שקוע בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות 2,3.
  2. Triturate מדגם היטב עד לעיכול רקמת הריאות זורם בקלות באמצעות פיפטה 10 מ"ל (כ -10 חזרות). דגירה במשך 15 דקות נוספות ב 37 ° C כדי להשלים את הרקמה מעכל ומבטיח השעיה אחיד יותר תא בודד.
  3. לדלל את תא ריאות ההשעיה עם HBSS ו triturate עם פיפטה 5 מ"ל לפזר שברי הרקמה שיורית.
  4. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 70μM להסיר שברי הרקמה מעוכלים. לדוגמא ניתן לחלק multiplצינורות דואר חרוטי בשלב זה כדי למנוע עומס יתר one מסננת התא להקטין את הזמן.
  5. גלולה ההשעיה תא 10 דקות ב 1500 סל"ד ו למזוג supernatant.
  6. Resuspend התא באמצעות גלולה בעדינות בטמפרטורת החדר RBC תמוגה חיץ (eBiosciences, בסן דייגו, קליפורניה; חתול # 00-4333-57) ו לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף נפח שווה של HBSS כדי להשבית את המאגר תמוגה ולסנן את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40μM להסיר פסולת אגרגטים התא.
  7. פיפטה 10μl של כל דגימה להיות מוכתם לספור מספרים התא ריאה והן דגימות BM באמצעות hemocytometer. הערה: להקליט את הנפח הכולל של התאים.
  8. גלולה ההשעיה של תא בודד לתאי ריאה על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1500 עבור 10 דקות.
  9. Resuspend שתי ריאות תאים בע"מ בבית 1x10 6 תאים / מ"ל ב prewarmed (37 ° C) DMEM + (בינוני שונה Dulbecco של הנשר, גלוקוז גבוה (Gibco, בקרלסבד, קליפורניה; חתול # 11965-092) המכיל bovi עוברית 2%ne בסרום (FBS) ו HEPES 10mm.
  10. הכן פתרון מניות 1mg/ml של Hoechst 33342 צבען (Sigma כימיקלים, St.Louis, מיזורי; חתול # B2261) במים ולסנן לעקר 1,4. לצבוע Hoechst עשוי להיות מאוחסן כמו aliquots ב -80 ° C.
  11. הוסף Hoescht 33342 צבע לריכוז סופי של 5μg/ml (דילול 200x מלאי 1mg/ml) על השעיית תא בודד.
  12. מערבבים את התאים על ידי היפוך בעדינות דגירה של 37 ° C אמבט מים במשך 90 דקות בדיוק.

3. מכתים והכנת השעיית ריאות מסוג תאים לניתוח זרימת cytometry

  1. אחרי 90 דקות את כל השלבים עם תאים Hoechst ריאות מוכתמות חייב להיות מוצא להורג על 4 מעלות צלזיוס או על קרח כדי למנוע בזרימת צבע. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1500 עבור 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend התאים חיץ קרים כקרח מכתים (PBS 2% FBS).
  2. תאים Resuspend בריכוז של לא יותר מ 1x10 7
  4. "

  1. >

  1. "
  2. "

"">figure-protocol-1

figure-protocol-2

figure-protocol-3
""

figure-protocol-4

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו צריכים להתאים שיטה המשמשת בתחילה כדי לזהות תאים hematopoietic BM לבודד אוכלוסייה ספציפית של MSC ריאות תושב. בשל שחזור של בידוד תאים אלה היו אז מאופיין גם MSC. המוצא שלהם הוגדר תושב בריאה עכבר בוגר (להבדיל BM נגזרת) ופרופיל פנוטיפי מולקולרית מתועד 2. היכולת שוב ושוב לבודד אוכלוסיה זו מתאפיינת מאפשר מחקר נוסף של חשיבות ביולוגית תפקיד של MSC הריאה במהלך הומאוסטזיס רקמה ומחלות. ההגדרה האחרונה של אוכלוסייה זו in vivo ברקמת הריאה הן Murine האדם ומקל על הפיתוח של אסטרטגיה טיפולית המכוונת להציל את התאים אנדוגני כדי להקל לתקן ריאות במהלך פציעה ומחלה.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענקים SMM: GIA0855953G AHA, NIH 1R01 HL091105-01. תמיכה נוספת סופק על ידי: DW: NIH RO1DK075013, DDK וקרן Kleberg; תזרים UCCC cytometry Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), את UCCC microarray הליבה (NCI P30 CA 46934-14).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
פוספט בופר סליין (PBS) סיגמא P-5368
הנקס שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) Thermo Scientific SH30588.01
0.2% וורטינגטון סוג 2 collagenase וורטינגטון ביוכימיקלים LS004202
תא דם אדום תמוגה חיץ eBiosciences 00-4333-57
DMEM Invitrogen Gibco 11965-092
Hoechst 33342 צבע סיגמא B2261
CD45-APC BD Pharmingen 559864
Propidium יודיד סיגמא 81845
, ממ Thermo Scientific SH30265.01 ;
FBS Invitrogen 16000-069
0.5% טריפסין / EDTA Cellgro 25-053-Cl
MesenCult השלם בינוני תא גזע טכנולוגיות 05511
0.4% w / v Giemsa פתרון מכתים סיגמא GS1L
4% paraformaldehyde מיקרוסקופית אלקטרונים שירותים 15710 Paraformeldehyde 16% הוא מדולל ל -4% באמצעות PBS
Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) סיגמא 21888

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).
  3. Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
  4. Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
  5. Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
  6. Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
  7. Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
  8. Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
  9. Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
  10. Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
  11. Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
  12. Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung Mesenchymal Stem CellsFlow CytometryTissue DigestionHoechst Low CD45 NegativeColony Forming AssayCell SortingBone Marrow ControlPulmonary FibrosisMesenchymal DifferentiationFlow Cytometry Setup

Related Articles