רישום וצביעה צמודים למיפוי מדויק של פעילות עצבית בחולדה ערה

תקציר

מקור: Moore, J. D., et al. ניטור ולוקליזציה של נוירונים בודדים בתוך מבני מוח תת-קורטיקליים של חולדות ערניות ומרוסנות ראש. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את השיטה של רישום וצביעה בחולדה מאופקת וערה ההליך כולל הקלטת אותות מנוירונים והזרקת צבע כדי למקם במדויק את אתר ההקלטה. טכניקה זו מאפשרת מיפוי מדויק של הפעילות העצבית למבנה האנטומי של המוח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. ניטור צמוד של יחידות עצביות

1. משוך צינורות נימי קוורץ על מושך מיקרופיפטות לייזר פחמן דו חמצני (ראה סעיף חומרים) עם קוטר קצה של פחות מ-1 מיקרומטר (איור 2A).
   הערה: פרמטרי החימום ישתנו בהתאם למכשיר המסוים, וכי קוטר הצוואר הנדרש ישתנה בהתאם למבנה המוח המבוקש. עבור הקלטות בתלמוס של חולדות, למיקרופיפטות יש צוואר שנע בין 5-7 מ"מ.
2. אבטח את הפיפטה במקומה תחת מיקרוסקופ ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) המצויד במטרות למרחקי עבודה ארוכים. השתמש בחימר דוגמנות כדי להחזיק את הפיפטה במקומה על במת המיקרוסקופ.
3. העבירו לאט גוש זכוכית (בעובי 0.5 - 1 ס"מ; פיסת זכוכית המשמשת לייצור סכיני מיקרוטום אולטרה נוחה) לשדה הראייה עם קצה הפיפטה. בעזרת המיקרומניפולטור של הבמה, גע בעדינות בקצה הפיפטה לזכוכית, וגרם לה להישבר. חזור על הפעולה לפי הצורך עד שהקוטר החיצוני של קצה הפיפטה הוא בין 1-3 מיקרומטר ( איור 2B, C). ודא שלמיקרופיפטות אלו יש עכבות בין כ-5-15 MΩ.
4. יש להכין תמיסת מלח חוץ-תאית (135 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl₂, 1 מ"מ MgCl₂, 5 מ"מ HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית), pH 7.2 עם NaOH) ולהוסיף 2% (w/v) Chicago Sky Blue. מלאו את הקצה האחורי של הפיפטה בתמיסה באמצעות מזרק עם מחט של 30 גרם ומטה. לחלופין, לתיוג תאי בודד, הוסף 2% (w/v) נוירוביוטין או דקסטרן אמין ביוטיניל (BDA-3000 או BDA-10000) לתמיסת המלח במקום Chicago Sky Blue.
5. הניחו את החולדה בתוך גרב הבד בתוך הצינור הקשיח על ג'יג ניסיוני מתאים ( איור 1). המתן לפחות 72 שעות לאחר הניתוח לפני הנחת בעל החיים על ג'יג משענת הראש. הדק את השרוך סביב עצם החזה העליונה, ולא הצוואר, כדי למנוע חסימה של דרכי הנשימה. אם נראה שהנשימה מאומצת או חסומה, שחרר את השרוך או הזז אותו לאחור. בצע הליך זה בזמן שהחולדה ערנית.
6. חבר את לוחית ריסון הראש על החולדה לחלק המתאים בג'יג. לשם כך, הצמד תחילה את לוחית משענת הראש למקומה, ולאחר מכן אבטח אותה באמצעות בורג 4-40. הקפד להמתין עד שהחיה תירגע על מנת להימנע מהפעלת מומנט מוגזם על הראש. לאחר מכן, הניחו אום 8-32 על בורג ריסון הראש המושתל בחולדה. לאחר מכן הברג מוט נירוסטה מושחל לבורג הראש. הצמידו את המוט לג'יג הניסוי בצורה כזו שניתן יהיה להדק אותו במקומו (איור 1).
   הערה: אבטחת החיה עם בורג הראש כמו גם לוחית משענת הראש ממזערת את כיפוף המכשיר ומשפרת את יציבות ההקלטה. ברוב המקרים, הרישום יכול להתחיל ביום הראשון שבו בעל החיים נשען על הראש. עם זאת, אם החיה מתעצבנת יתר על המידה או משמיעה קולות, ספקו יום אחד של אימון הרגלה של ריסון ראש לפני שתתחילו בהקלטות כלשהן. במקרה זה, השאירו את החיה על הג'יג למשך 15 דקות ואז החזירו אותה לכלוב שלה. חזור על שלב זה למחרת והמשך בפרוטוקול.
7. פתח את תא ההקלטה והסר את ג'ל הסיליקון. אם הרקמה צמחה מחדש בגולגולת, נקה אותה באמצעות מלקחיים עדינים.
8. חבר את הפיפטה למיקרומניפולטור הממונע, וחבר את ה-headstage pre-ampחיים יותר.
   הערה: בהדגמה הנוכחית, מעגל ממסר קטן על הראש stage עובר בין חוטי ההובלה של המגבר למקור זרם חיצוני עם תאימות גבוהה (איור 3A-C). שים לב שלחלק מהמגברים יש מקור מובנה מתאים עם תאימות גבוהה.
9. השתמש במיקרומניפולטור הממונע כדי להזיז את קצה הפיפטה לסימון המזוהה סטריאוטקסית בתא ההקלטה. שימו לב לקואורדינטות של מיקום זה. היזהר לא לשבור את קצה הפיפטה על הגולגולת.
10. העבר את הפיפטה למיקום ההקלטה הרצוי בציר הקדמי-אחורי והמדיולטרלי. לאחר מכן קדם את הפיפטה בגחון דרך הדורה עד שהיא נמצאת בערך 500 מיקרומטר גב למיקום ההקלטה המיועד.
11. קדם לאט את הפיפטה תוך כדי האזנה לאירועי זינוק על צג שמע של כרך מוגברtage שנרשם בין קצה הפיפטה לחוט הייחוס. לאחר זיהוי אירועי זינוק, המשך להזיז את הפיפטה 0-100 מיקרומטר עד שנצפו סטיות מתח חיוביות הגדולות מכ-500 μV.
    הערה: התנגדות האלקטרודה תגדל בפקטור של כ-1.5-10 כאשר זה קורה.
12. ההקלטה צריכה להתחיל לאחר בידוד יחידה, יחד עם כל שאר המדדים ההתנהגותיים והפיזיולוגיים המעניינים. בהדגמה הנוכחית, תנועות ויבריסה שנוצרו בעצמן מנוטרות באמצעות צילום וידאו במהירות גבוהה (ראה סעיף חומרים ).
13. כדי לתייג את אתר ההקלטה, החלף את מובילי האלקטרודה כדי להתחבר למקור הנוכחי. ישנן מספר דרכים לעשות זאת, באמצעות מעגל ממסר(איור 3A-C), מקור זרם מובנה במגבר, או באופן ידני(איור 3D). העבירו -4 μA עם פולסים של 2 שניות במחזור עבודה של 50% למשך 4 דקות כדי להזריק באופן יונטופורטי Chicago Sky Blue דרך הפיפטה.
14. להרוג ולהחדיר את החיה לאחר מספר הליכי תיוג על פי הנוהג המקובל. חתכו את המוח וצביעו לפי הצורך כדי לזהות את המיקום האנטומי של אתר ההקלטה. מכתים את הרקמה לתגובתיות ציטוכרום אוקסידאז. לחלופין, זהה את מרבצי שיקגו סקיי בלו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: כדי להבדיל במדויק בין יחידות מסומנות שונות, חשוב שכל התוויות ייוצרו עם אותה פיפטה באותו יום, מבלי לשחרר את הפיפטה בין התוויות. במקרה זה, ניתן להבדיל בין אתרי תיעוד על ידי מיקומם היחסי בהיסטולוגיה פוסט-הוק, יחד עם קואורדינטות המניפולטור המצוינות של כל אתר. לזיהוי חד משמעי, סמנו את התוויות במרחק של לפחות 200 מיקרומטר זו מזו, ולא יותר מ-3-5 תוויות לכל אזור במוח.

תוצאות

איור 1: ג'יג ניסיוני. דיאגרמה של חולדה בג'יג המכני לניסויים אלקטרופיזיולוגיים וניטור התנהגותי. הג'יג משתמש בסרגל ובצלחת

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (תמיסת קסילזין)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodine)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger אספקה תעשייתית	4KL86	20-40 cp cyanoacrylate
Vetbond	3M	1469SB
אחיזה אבקת מלט	Dentsply Intl	675571	לבסיס תא ההקלטה
Grip צמנט נוזל	Dentsply Intl	675572	לבסיס תא ההקלטה
סיליקון ג'ל	Dow Corning	Mar-80
אבקת אקריליק לתיקון תותבות סילון	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	לאבטחת מנגנון משענת הראש לגולגולת
Ortho-Jet נוזל שרף אקרילי אורתודונטי מהיר ריפוי	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	לאבטחת מנגנון משענת הראש לגולגולת
שיקגו כחול שמיים	סיגמא	C8679
Paraformaldehyde	Sigma	158127	לזלוף וקיבוע רקמות
מי מלח חוצץ	פוספט Sigma	P3813	לזלוף וקיבוע רקמות
ציטוכרום C	Sigma	C2506
Diaminobenzidine	Sigma	D5905
גרב עכברוש	לתפור אלגנטי (סן דייגו, קליפורניה)	N / A
PVC צינור 2 1/2 אינץ'	ארה"ב פלסטיק ושות'	34108
פינים ושקעים תת-זעירים D TE	Connectivity	205089-1
חוט מוסיקה מפלדת אל-חלד בקוטר "0.010	Precision Brand Products, Inc.	21010
מסגרת אחיזה סטריאוטקסית	Kopf מכשירים	דגם 900
מוטות אוזניים סטריאוטקסיים	Kopf מכשירים	דגם 957
מניפולטור סטריאוטקסי	Kopf מכשירים	דגם 960
1/2 מ"מ מקדחה	בור הנרי שיין	100-3995
מקדחה דנטלית באוויר שקט	המערב התיכון שיניים	393-1600
נירוסטה 0-80 1/8 אינץ' בורג	אטב סופרסטור	247438
0.2 מ"ל צינור צנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-407-8A
מוט אחיזת ראש מותאם אישית	UCSD SIO חנות מכונות	N / A
זווית ישרה פוסט מהדק	ניופורט	MCA-1
8-32 3/4 אינץ' בורג	אטב סופרסטור	240181
4-40 1/4 אינץ' בורג	אטב סופרסטור	239958
צינורות נימי קוורץ	Sutter Instruments	QF-100-60-10
מיקרומניפולטור ממונע	Sutter Instruments	MP-285
מגבר מיקרואלקטרודה	התקנים מולקולריים	Multiclamp 700B	חלק חלופי: התקנים מולקולריים Axoclamp 900A
שלב ראש מגבר מיקרואלקטרודה התקנים	מולקולריים	CV-7B	חלק חלופי: HS-9Ax10 עם התקנים מולקולריים Axoclamp 900A
ממריץ דופק מבודד	A-M Systems	דגם 2100	חלק חלופי: HS-9Ax10 עם התקנים מולקולריים Axoclamp 900A
צג שמע	רדיו שאק	32-2040
חוט עופרת אלקטרודה	חוט קונר	NEF34-1646
ממסר למגבר ראש שלב	COTO טכנולוגיה	# 2342-05-000	(אופציונלי) בשימוש עם לוח מעגלים מודפסים בהתאמה אישית (חנות אלקטרוניקה לפיזיקה של UCSD), איור 6A-C
מצלמת וידאו דיגיטלית	Basler	A602fm
מחזיק פיפטות	Warner Instruments	#MEW-F10T
צלחת אחיזת ראש מותאמת אישית	UCSD SIO חנות מכונות	N/A