הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

סיכום

שיטה להרחיב בתאי T γδ מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתואר. PBMC שמקורם בתאי T γδ הם מגורה והרחיב באמצעות zoledronate ו אינטרלויקין -2 (IL-2). הרחבת בקנה מידה גדול של γδ בתאי T יכול להיות מיושם על חיסוני הסלולר עצמיים של סרטן.

תקציר

אדם בתאי T γδ יכול לזהות ולהגיב למגוון רחב של מתח המושרה אנטיגנים, ובכך לפתח מולדת פעילות אנטי סרטניים זיהומיות אנטי רחבה. ¹ רוב בתאי T γδ בדם ההיקפי יש קולטן Vγ9Vδ2 T התא. תאים אלה מזהים אנטיגן באופן מרכזי histocompatibility מורכב עצמאית ולפתח פונקציות חזקה מפעיל cytolytic ו-Th1 כמו ^1. לכן, γδ ותאי T הם תאים למועמד אטרקטיבי עבור מפעיל חיסוני סרטן. Vγ9Vδ2 שתאי T מגיבים phosphoantigens כגון (E)-4-hydroxy-3-methyl-אבל-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), אשר מסונתז חיידקים דרך ביוסינתזה isoprenoid; ² ו pyrophosphate isopentenyl (IPP), אשר מופק בתאים אוקריוטים דרך מסלול mevalonate. ³ במצב פיזיולוגי, הדור של IPP בתא nontransformed אינו מספיק להפעלת בתאי T γδ. Dysregulation של מסלול mevalonate בתאי גידול מוביל הצטברות של IPP ו γδ הפעלה T לתאים. ³ מאחר aminobisphosphonates (כגון pamidronate או zoledronate) לעכב synthase pyrophosphate farnesyl (FPPS), האנזים הפועל במורד הזרם של IPP במסלול mevalonate, רמות תאיים של IPP ו sensitibity להכרה תאים γδ T ניתן להגדיל על ידי aminobisphosphonates טיפולית. IPP הצטברות הוא פחות יעיל בתאים nontransfomred מאשר תאים סרטניים עם ריכוז רלוונטי פרמקולוגית של aminobisphosphonates, המאפשרים לנו אימונותרפיה של סרטן על ידי הפעלת בתאי T γδ עם aminobisphosphonates. ⁴ מעניין, IPP מצטבר מונוציטים כאשר PBMC מטופלים aminobisphosphonates, בגלל יעיל ספיגת התרופה על ידי תאים אלו. ⁵ מונוציטים שמצטברים להיות IPP-הצגת אנטיגן תאים לעורר Vγ9Vδ2 בתאי T בדם ההיקפי. ⁶ בהתבסס על מנגנונים אלה, אנו פיתח טכניקה להרחבת בקנה מידה גדול של תרבויות γδ T התא באמצעות zoledronate ו interleukin -2 (IL-2). ⁷ שיטות אחרות להרחבת γδ בתאי T לנצל את pyrophosphate bromohydrin סינתטי phosphoantigens (BrHPP) ⁸ או 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP). ⁹ כל השיטות האלה מאפשרות לשעבר הרחבת vivo, וכתוצאה מכך מספר גדול של תאים T γδ לשימוש חיסוני המאמצת. עם זאת, רק zoledronate הוא מגיב זמינים מסחרית ה-FDA. Zoledronate-מורחבת γδ בתאי T להציג CD27 ^- CD45RA ^- פנוטיפ זיכרון מפעיל והתפקוד שלהם ניתן להעריך על ידי IFN-γ assay הייצור ^7.

פרוטוקול

1. בידוד של PBMC

1. להקיז דם (7.5-8.0 מ"ל) לתוך Tube Vacutainer BD CPT תא הכנה עם הפרין סודיום. הצינור מכיל נתרן קרישה הפרין ו נוזל Ficoll-Hypaque צפיפות, בתוספת ג'ל פוליאסטר המחסום, המפריד בין שני נוזלים. צנטריפוגה שפופרת / דם מדגם בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) של הרוטור אופקי (נדנדה-out ראש) במשך 20 דקות ב 1800 x גרם. החלף צנטריפוגות את הבלמים.
2. לאחר צנטריפוגה, את רצף השכבות מתרחשת כדלקמן (ראה מלמעלה למטה): א) פלזמה - ב) בתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) וטסיות - ג) פתרון צפיפות - ד) ג'ל פוליאסטר - ה) גרנולוציטים - ו) כדוריות דם אדומות (איור 1).
3. איסוף שבריר של שכבת פלזמה, עוזב 5-10 מ"מ של פלזמה מעל שלבי הביניים מבלי להפריע את שכבת התאים. פלזמה יכולה לשמש תרבות (סעיף 2.5).
4. קציר שבר מועשר (PBMC) בשעה שלבי הביניים עם טפטפת והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל.
5. שטפו את PBMC עם 10 מ"ל של בופר פוספט (PBS), על ידי צינור היפוך 5 פעמים, ולאחר מכן צנטריפוגות 5 דקות ב 400 x גרם.
6. חזור על שלבים כביסה פעמיים, ולאחר מכן resuspend גלולה תא 5 מ"ל של PBS. קבע את מספר התא. בדרך כלל 1.3 x10 ⁶ תאים התאושש 1 מ"ל של דם מלא.
7. קבע את תדירות הפנוטיפ של תאים T γδ ב PBMC ידי cytometry זרימה (סעיף 3) (איור 2).

2. הרחבת γδ ותאי T

1. צנטריפוגה השעיות תא 15 צינורות חרוטי מ"ל במשך 5 דק 'ב 400 x g בטמפרטורת החדר, וזורקים supernatants.
2. הכן בינוני תרבות (CM) על ידי הוספת IL-2 האנושי (IL-2) ו zoledronate (Zometa) לריכוזים האחרון של 1000 IU / מ"ל ​​ו - 5 מיקרומטר, בהתאמה. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) או OpTmizer (Invitrogen) תמיכה בתקשורת הרחבה טובה של γδ ותאי T (מידע נוסף הפניות 6 ו - 9). Zometa מסופק בצורת נוזל (4 בקבוקון mg/5-ml). כדי להכין פתרון 5 מיקרומטר, הוסף 50 μl של Zometa עד 30 מ"ל של מדיום תרבות.
3. Resuspend תא גלולה במדיום תרבות להסתגל 1x10 ⁶ תאים / מ"ל.
4. Pipet 1 מ"ל של CM המכיל 1x10 ⁶ תאים לתוך הבאר כל צלחת 24 באר. עבור בקנה מידה גדול תרבויות, תאים יכולים להיות seeded ב 0.5 x 10 ⁶ תאים / ² ס"מ על פי שטח פנים של בארות צלחת, צלחת או בקבוק.
5. הוסף פלזמה עצמיים (סעיף 1.3), אספו אדם א.ב. סרה, או FCS כך הוא כ 10% מנפח של התרבות (100 μl גם עבור כל צלחת 24 באר). מניחים את הלוחות humidified 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך 24-48 שעות.
6. שמירה על תרבות בצפיפות תא של 0.5-2 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. הוסף בינוני טרי המכיל IL-2 אנושי (1000 IU / ml) בלבד (ללא Zometa) כל 2-3 ימים, העברת תאים בתרבית לתוך בארות חדשות או צלוחיות לפי הצורך, בהתאם למידת התפשטות תאים (איור 3). אספקת פלזמה או בסרום עד בינוני, כך ריכוז בסרום יכול להישמר לפחות 1%.
7. קציר תאים ביום 12-14 ולקבוע את תדירות, פנוטיפ, פונקציות של תאים T γδ ידי cytometry זרימה (ראה להלן).

3. ניתוח פנוטיפי על ידי זרימת cytometry

1. העברת 200 דגימות μl המכיל 2 x 10 ⁵ תאים מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) צינורות.
2. הוסף 2 מ"ל PBS קר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x גרם. ואז, resuspend את כדורי במאגר FACS 50 μl (PBS + 1% אזיד הנתרן FCS + 0.1%). הוסף 5 μl של נוגדנים לכל דגימות (נוגדנים חד שבטיים מפורטים טבלה 1).
3. לדגור על הקרח בחושך במשך 20 דקות.
4. הוסף חוצץ 2 מ"ל FACS לטעום כל, ולאחר מכן מערבולת. צנטריפוגה דגימות דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C. בזהירות למזוג supernatant.
5. Resuspend התאים חיץ 300 FACS מערבולת μl ו. ניתוח דגימות על cytometer זרימה (איור 2).

4. IFN-γ ייצור assay ¹⁰

1. יום לפני assay, להכין ממריץ תאים על ידי 3-5 culturing x10 ⁵ תאים Daudi / מ"ל במדיום 1640 RPMI FCS בתוספת 10% (RPMI-10) לילה עם Zometa (5 מיקרומטר) (להלן המיועד Z-Daudi).
2. איסוף Z-Daudi ו resuspend ב RPMI-10 ב 2x10 ⁶ תאים / מ"ל. הוסף 100 μl של Z-Daudi (2x10 ⁵⁾ היטב כל צלחת סביב תחתית 96-היטב.
3. הכן בתאי T γδ ב 2x10 ⁶ תאים / מ"ל RPMI-10 המכיל Brefeldin ב 20 מיקרוגרם / מ"ל. העברת 100 μl של השעיה T γδ תא (2x10 ⁵⁾ זה Z-Daudi התאים היטב המכיל או לשלוט בארות (100 μl של RPMI-10 בלבד, או RPMI-10 עם 20 ng / ml של phorbol 12-13-myristate אצטט[PMA] פלוס 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ionomycin).
4. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור.
5. צנטריפוגה את הצלחת דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C ו resuspend את כדורי ב μl 200 של קר PBS.
6. העברת דגימות צינורות FACS. הוסף 4 מ"ל של קר PBS ו צנטריפוגות צינורות דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C.
7. Resuspend את כדורי ב 50 μl של חיץ FACS עם FITC-מצומדות אנטי TCRVγ9 (5 μl) ו PE/Cy5-conjugated אנטי CD3 מב (2.5 μl). דגירה מוגן מפני אור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הוסף 100 μl של מגיב IntraPrep 1 ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 4 מ"ל של PBS על צינור כל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x g בטמפרטורת החדר.
9. הסר את supernatant על ידי שאיפה ולהוסיף 100 μl של 2 מגיב IntraPrep. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר בלי לרעוד.
10. הוסף 5 μl של PE-מצומדות אנטי IFN-γ מב אל המבחנה. דגירה מוגן מפני אור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
11. הוסף 4 מ"ל של PBS על צינור כל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x g בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ידי השאיפה ואת resuspend התא גלולה ב 0.5 מ"ל של חיץ FACS.
12. נתח את התאים על ידי זרימה cytometer. שער על CD3 ^{+ +} TCRVγ9 תאים לבחון את הביטוי של IFN-γ (איור 4).

5. נציג תוצאות:

חשוב לקבוע את אחוז בתאי T γδ ב PBMC ב חניכה של התרבות. כפי שמוצג באיור. 2 אחוז CD3 ^{+ +} TCRVγ9 γδ בתאי T ב PBMC היה 1.6% ביום 0. האוכלוסיות היו דומיננטיים CD27 ^{+ +} CD45RA נאיבי או CD27 ⁺ CD45RA ^- פנוטיפים הזיכרון המרכזי. כאשר γδ בתאי T היו מגורה בצורה יעילה, הם יצרו צבירים בימים 3-5 (איור 3 A ו-B). כאשר היווצרות אשכול התעכבה, את הצמיחה של תאים מסוגים אחרים, כגון CD4 ⁺ או CD8 ⁺ αβ בתאי T או תאים NK יכול להשתלט על הצמיחה של γδ ותאי T (איור 3 C ו-D). לאחר 14 ימים של תרבות, תדירות γδ בתאי T עלה ל 93.8% יותר מאשר של תאים בתרבית γδ תרבויות מוצלח תא T (איור 2 E). תאים בתרבית T γδ NKG2D שהוגברו ו CD69 הביטוי (איור 2 G ו-H). הם מוצגים CD27 ^- CD45RA ^- פנוטיפ זיכרון מפעיל (איור 2 F). הפונקציות של γδ בתאי T הוערכו לגבי ייצור ציטוקינים ו cytotoxicity. IFN-γ תאיים מכתים הוכיח כי γδ המיוצר בתאי T IFN-γ בתגובה PMA / ionomycin טיפול או Z-Daudi תאים IPP שנצבר לאחר הטיפול zoledronate (איור 4). תוצאות אלו מצביעות כי zoledronate ביעילות לעורר ולהרחיב פונקציונלי בתאי T γδ.

שפופרת	FITC	PE	ECD	PE/Cy5
1	CD3	CD19	CD45	CD14
2	CD3	TCRαβ	CD4	CD8
3	CD3			CD56
4	TCR Vγ9	TCRαβ	CD45	CD3
5	TCR Vγ9	NKG2D
6	TCR Vγ9	CD69
7	TCR Vγ9	עכבר IgG1
8	TCR Vγ9		CD45RA	CD27
9	TCR Vγ9		עכבר IgG1	עכבר IgG1

טבלה 1. נוגדנים חד שבטיים משמשים מכתים ססגוניות של תאים T γδ. דוגמה לניתוח פנוטיפי של תאים T γδ שבוצעו במעבדה שלנו מוצג באיור. 2.

באיור 1. ההפרדה של PBMC. דם (7.5-8.0 מ"ל) נשאבים לתוך Tube Vacutainer BD CPT תא הכנה עם הפרין סודיום ו centrifuged ישירות עבור 20 דקות ב 1800 x גרם. לאחר צנטריפוגה, שכבות וכתוצאה מכך כפי שניתן לראות מלמעלה בוttom: א) פלזמה - ב) PBMC וטסיות - ג) פתרון צפיפות - ד) ג'ל פוליאסטר - ה) גרנולוציטים - ו) כדוריות דם אדומות.

איור 2. פנוטיפ אופייני משטח של תאים T γδ. PBMC היו מגורה עם zoledronate ו IL-2 למשך 14 יום. תאים הוכתמו FITC שכותרתו אנטי TCR Vγ9 ו PE/Cy5-labeled אנטי CD3 לפקח על התרחבות γδ ותאי T (A ו-E). γδ בתאי T זוהו על ידי הביטוי שלהם TCRVγ9, והבעתם של CD27 ו CD45RA (B ו-F), NKG2D (C ו-G), או CD69 (D ו-H) נבדק.

איור 3. נציג γδ תרבויות T התא. PBMC היו מגורה עם IL-2 (1,000 IU / ml) ו zoledronate (5 מיקרומטר). שדות נציג מוצגים (IX71 מיקרוסקופ הפוך [אולימפוס] X 200). אשכולות של אגרגטים γδ בתאי T ניתן לצפות ביום 3 (א) יום 5 (ב), כאשר γδ בתאי T הורחבו בהצלחה. לעומת זאת, לא אשכולות או אגרגטים נצפו כאשר γδ T צמיחת תאים לא היה מספיק (C ו-D).

איור 4. IFN-γ הייצור. γδ בתאי T הודגרו עם RPMI-10 בלבד (A) או PMA / ionomycin (ב) או Z-Daudi (C) עבור 4 שעות. ראשית, הבעת הפנים של TCRVγ9 היה מוכתם ואז IFN-γ הייצור נבדק ע"י IFN γ-תאיים מכתים.

איור 5. קינטיקה של התרבות T γδ התא. (א) מספר מוחלט של תאים בתרבית, (B) אחוז γδ בתאי T, ו - (ג) המספר המוחלט של תאים T γδ בנקודות הזמן שצוין.

דיון

השיטה המוצגת כאן מאפשרת התפשטות יעילה של תאים T γδ מ PBMC. γδ שתאי T מופעלים והרחיב על ידי zoledronate ו IL-2 לפתח פונקציות מפעיל מלאה, שהתבטאה ייצור ציטוקינים ו cytotoxicity. זה כבר דווח כי pyrophosphate סינתטי phosphoantigens bromohydrin (BrHPP) ו 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP) להרחיב גם בתאי T γδ, אולם הם אינם זמינים מסחרית. לעומת זאת, zoledronate מורשה כבר יישומים קליניים כמו Zometa. לכן, מגיב אמין זמין בקלות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
ZOMETA	נוברטיס פארמה ק K		zoledronate
PROLEUKIN	נוברטיס פארמה		IL-2 רקומביננטי אנושי
BD Vacutainer הכנה CPT Cell Tube עם הפרין סודיום	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203 בינוני	Cell מדע וטכנולוגיה מכון	0301-7
OpTmizer	Invitrogen	0080022SA
brefeldin	סיגמא	B5936-200UL
phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA)	סיגמא	P1585-1mg
ionomycin	סיגמא	13909-1ML
IntraPrep	Beckman קולטר	A07803
אנטי אנושי CD3-FITC או PE/Cy5	Beckman קולטר	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
אנטי אנושי CD4-ECD	Beckman קולטר	6604727
אנטי אנושי CD8-PE/Cy5	Beckman קולטר	6607011
אנטי אנושי CD14-PE/Cy5	Beckman קולטר	A07765
אנטי אנושי CD19-PE	Beckman קולטר	A07769
אנטי אנושי CD45-ECD	Beckman קולטר	A07784
אנטי אנושי CD56-PE/Cy5	Beckman קולטר	A07789
אנטי אנושי TCRαβ-PE	Beckman קולטר	A39499
אנטי אנושי TCR Vγ9-FITC	Beckman קולטר	IM1463
אנטי אנושי CD27-PE/Cy5	Beckman קולטר	6607107
אנטי אנושי CD45RA-ECD	Beckman קולטר	IM2711
אנטי אנושי CD69-PE	BD	555531
אנטי אנושי NKG2D-PE	Beckman קולטר	A08934
Anti-humal IFNγ-PE	Beckman קולטר	IM2717U
עכבר IgG1 אלוטיפ לשלוט-PE	Beckman קולטר	A07796
עכבר IgG1 אלוטיפ שליטה ECD או PE/Cy5	Beckman קולטר	A07797 A07798