מאמר שיטה

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica

DOI:

10.3791/3265

⸱

20 בפברואר 2012

 , 
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, Huntsville, 2USDA-APHIS-PPQ, Center for Plant Health Science and Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים פרוטוקול חסכונית ומהירה genotyping מולקולרי מעסיקה מגוון ספציפיים primers ה-PCR כי ה-DNA היעד רצף ההבדלים בתוך אזור trnL-F הכלורופלסט spacer להבחין בין סוגים שונים של Imperata cylindrica (Cogongrass) שלא ניתן להבחין על ידי המורפולוגיה לבד. זנים אלו כוללים את העשב מזיק רשומים פדרלי, cogongrass מקרוב בנושא, התפשטות רחבה במגוון נוי, אני. cylindrica Var. Koenigii (עשב דם יפני).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) הוא אחד מעשרת המפעלים המובילים פולשניים הגרועים ביותר בעולם, המשפיעים לרעה על משאבים חקלאיים וטבעיים ב 73 מדינות שונות ברחבי אפריקה, אסיה, אירופה, ניו זילנד, אוקיאניה ואמריקה 1-2. Cogongrass טפסים במהירות, להפיץ, דוכני monodominant כי את מקומו של מגוון רחב של מיני צמחים מקומיים בתורו לאיים על בעלי חיים מקומיים התלויים המין העקורים צמחים מקומיים עבור מספוא ומחסה. כדי להוסיף על הבעיה, מגוון נוי [א cylindrica var. koenigii (Retzius)] משווק באופן נרחב תחת שמות "Rubra" Imperata cylindrica, אדום ברון, ועשב הדם היפנית (JBG). מגוון זה הוא סטרילי putatively ו פולשנית ונחשב נוי רצוי עלים בצבע אדום שלה. עם זאת, בתנאים הנכונים, JBG יכול לייצר זרע בר קיימא (קרול Holko, 2009 תקשורת אישית) והוא יכול לחזור ירוק אניטופס nvasive כי היא לעתים קרובות נבדל cogongrass כפי שנדרש על המאפיינים הייחודיים של מגוון wild-type פולשנית 4 (איור 1). זה עושה את הזיהוי באמצעות מורפולוגיה משימה קשה אפילו מאומנים היטב הטקסונומים הצמח. חזרה של JBG כדי פנוטיפ ירוק אגרסיבי הוא גם לא נדיר. באמצעות השוואות רצף של קידוד אזורי ב-DNA משתנה גם גרעיני הכלורופלסט, יש לנו אישר כי JBG חזר לסורו פולשנית ירוק בתוך מדינות מרילנד, דרום קרוליינה, מיזורי. JBG נמכרה ושתל במצב כמעט בכל ביבשת ארה"ב שבה אין התפשטות פעיל cogongrass. היקף הבעיה לחזור ב לא הבין היטב כי הצמחים הם חזרו והרסו מתועד לעתים קרובות.

יישום של פרוטוקול זה מספק שיטה מולקולרית כדי לזהות JBG חוזר והוא יכול לסייע לשמור על אלו סוגים של שיתוף המתרחשיםND ואולי והכלאה. Cogongrass הוא outcrosser מחייבים, וכאשר חצה עם גנוטיפ אחר, יכול לייצר רוח התפזרו קיימא הזרעים להפיץ cogongrass למרחקים רחבים 5-7. JBG יש גנוטיפ שונה במקצת מאשר cogongrass ו יוכלו ליצור כלאיים קיימא עם cogongrass. כדי להוסיף על הבעיה, JBG קר יותר בצל סובלנית יותר cogongrass 8-10, ואת זרימת גנים בין שני זנים עשוי ליצור כלאיים, כי הם יותר אגרסיביים, בצל סובלנית, וקרה הארדי מ wild-type cogongrass. בעוד wild-type cogongrass כיום פושט מעל 490,000,000 דונם ברחבי העולם, בארה"ב ובדרום מזרח הוא פושט על 500,000 דונם והוא מסוגל לכבוש ביותר של ארה"ב כפי שהוא מתפשט במהירות צפונה בשל נישה רחבה שלה 3,7,11 הפוטנציאל הגיאוגרפי. הפוטנציאל של מעבר גנטית היא דאגה רצינית עבור התוכנית הפדרלית USDA-כנימות שבוע רעילים. נכון לעכשיו, משרד החקלאות, כנימות אוסר JBG במדינות ש"שפה יש מכת cogongrass הגדולות (למשל, פלורידה, אלבמה, מיסיסיפי). עם זאת, למנוע שני סוגים של שילוב יכול להוכיח קשה יותר cogongrass ו JBG להרחיב הפצות שלהם. יתר על כן, חלוקת JBG לחזור אינו ידוע כרגע, ללא יכולת לזהות סוגים אלה באמצעות מורפולוגיה, כמה מכת cogongrass עשוי להיות תוצאה של JBG חוזר. למרבה הצער, שיטות מולקולריות שוטפות של זיהוי בדרך כלל לסמוך על AFLP (מוגבר אורך פולימורפיזמים שבר) ואת רצפי DNA, הן אלו זמן רב ויקר. כאן, אנו מציגים 1 חסכונית ואמינה המבוססת על שיטת ה-PCR genotyping מולקולרית במדויק להבחין בין cogongrass ו JBG לחזור.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הדגימה איסוף שימור

שיטה זו פותחה נבדק באמצעות טריים, קפואים, מיובשים ורקמות עלה לאחרונה.

  1. זהה את cogongrass ו / או JBG רקמות בעזרת הטקסונום המתמחה זיהוי מינים הדשא. עם עלים בצבע אדום בהיר שלה, JBG נוי קל ויזואלית להבחין בין wild-type cogongrass ו JBG לחזור, אך cogongrass ו JBG לחזור הם נבדלים זה מזה כמעט. Cogongrass ואת הפנוטיפ JBG חזרו להיות ירוקים, עלים ארוכים יותר, קני שורש משמעותית גדולים יותר ויותר, ושטח עלה יותר מ JBG 12 (איור 1).
  2. רקמת העלה טרי מספק את ה-DNA הנפוץ ביותר באיכות הגבוהה ביותר ניתן שנאספו בשדה או בחממה א גדל cylindrica צמחים. אם רקמה טרי היא לשמש, לחלץ DNA תוך 3 שעות של אוסף כדי למנוע השפלה. אחרת, להכין את הרקמה לאחסון, keeping רקמות קריר הרחק מאור שמש ישיר.
  3. כדי לאחסן רקמות להפקת DNA במועד מאוחר יותר, השיטה האופטימלית ביותר היא להקפיא ולאחסן את הרקמה ב -80 ° C באופן מיידי. אל תאפשר רקמות קפוא להפשיר לפני מיצוי DNA. להעביר את הרקמה הקפואה אל חנקן נוזלי לפני הצעדים שחיקה של מיצוי DNA כדי למנוע הפשרה.
  4. אם המקפיא -80 ° C אינו זמין, יבש רקמות באופן מיידי. לאחסון יבש, הצב את רקמת למעטפה נייר ולאחסן את המעטפה סיליקה ג'ל או מיובש desiccants פעילים אחרים בטמפרטורת החדר. כמות קטנה של סיליקה מדד מעורב עם שאינו מצביע סיליקה סיליקה יבטיח כי הוא מיובש לחלוטין מתאים ייבוש רקמות הצמח.
  5. השתמש לפחות 10 פעמים סיליקה ג'ל יותר רקמת העלה טרי לפי משקל. רקמת הצמח צריך להתייבש בתוך 24 שעות. האיכות והכמות של ה-DNA הוא מופחת באמצעות אחסון יבש לאורך זמן (כמו במקרה של הדגימה העשבייהs).

2. הפקת DNA

כדי לחלץ דנ"א רקמות הצמח, בצע את הצמח DNeasy מיני קיט (Qiagen, ולנסיה, CA, חתול # 69104 או 69106) הוראות היצרן עם שינויים קטין אחד. במקום להשתמש הציע פחות מ 100 מ"ג רקמה טרי או פחות מ 20 מ"ג רקמה יבשה עבור כל עמודה, לטחון יותר מ 100 מ"ג, ולאחר מכן להעביר 100 מ"ג מרקמות טרי או קפוא (או> 20 מ"ג מרקמות יבש) לצינורות המתאימים עבור החילוץ. ה-DNA הגרעיני plastid מופק בו זמנית.

  1. לפני תחילת הליכים אלה, ודא כי אתנול נוספה מאגרים AP3 / E ו AW.
  2. טוחנים> 100 מ"ג של רקמת העלה טרי או קפוא (או> 20 מ"ג של רקמת העלה יבש) לאבקה דקה באמצעות שלושה סיבובים של חנקן נוזלי עם טחינה במכתש ועלי צונן. הפרעה מספקת של חומר המוצא או תמוגה מספיק יכול גם להוביל בתשואות נמוכות יותר של ה-DNA. בזהירות לטחון tissUE ולא להעמיס את העמודות עם רקמות יותר מדי.
  3. העברת 100 מ"ג אבקת קפוא מרקמות טרי או קפוא (או 20 מ"ג של אבקת מרקמות יבש) לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 400 μl של מאגר AP1 ו 4 μl של RNase א כל שפופרת ניתן לשים מדף קטן לאזן לפקח על המשקל הנכון של רקמות לכל צינור.
  4. מדגם וורטקס תנער (ים) לערבב דגירה של 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, צינור היפוך (ים) 2-3 פעמים במהלך הדגירה.
  5. הוסף 130 μl של מאגר AP2 מדגם זה. מערבבים על ידי צינור היפוך (ים) כמה פעמים, דגירה של 5 דק 'על הקרח.
  6. Pipet כל lysate לתוך עמודה QIAshredder נפרדת מיני ספין, ומניחים כל עמודה צינור מ"ל 2 אוסף (מסופק עם הערכה). צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 2 דקות על XG 20000 (~ 14,000 סל"ד), ולהעביר את כל הזרימה דרך חלק לתוך צינור חדש (לא מצורף בערכה) מבלי לשבש כל גלולה נוצר.
  7. הוסף 1.5 כרכים של מאגר AP3 /, E ומערבבים ידי pipetting.
  8. העברת 650 μl של התערובת בעמודת ספין DNeasy מיני בצינור מ"ל 2 אוסף. צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 1 דקות ב XG 6000 (~ 8000 סל"ד), וזורקים את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו עם התערובת שנותרה על מדגם זה.
  9. מניחים את הטור ספין (ים) לתוך צינור חדש מ"ל 2 אוסף (ים), ולהוסיף 500 μl של AW מאגר לחלק העליון של כל עמודה. צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 1 דקות ב XG 6000 (~ 8000 סל"ד), וזורקים זרימה דרך.
  10. הוסף μl 500 של AW מאגר לחלק העליון של כל עמודה. סרכזת דקות 2 ב XG 20000 (~ 14,000 סל"ד). צעד זה ייבש את הטור, ובכך להסיר כל אתנול שיורית הכלול מאגרים שיכול לעכב PCR.
  11. העברת כל עמודה ספין כדי צינור חדש microcentrifuge 1.5 מ"ל דגימה. הוסף 100 μl AE מאגר לחלק העליון של כל עמודה עבור elution, ו דגירה עמודה (ות) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה עמודה (ות) עבור 1 דקות ב XG 6000 (~~~HEAD=NNS 8,000 סל"ד) לאסוף את ה-DNA.
  12. חזור על elution השלבים פעם אחת, משחררי דנ"א לתוך צינור מ"ל זהה 1.5 microcentrifuge להניב 200 μl של המדגם. דגימות דנ"א חנות ב -20 ° C עד השימוש. ריכוזי ה-DNA תלויה בסוג הרקמה ותנאי אחסון. תשואות אופטימליות מתקבלים כאשר משחררי DNA עם סך של 200 μl של חיץ AE, עם זאת, בריכוזים ניתן להגדיל כמויות אם elution מופחתים μl קטנה כמו 50.

3. אימות של איכות וכמות ה-DNA

  1. לבדוק את האיכות והכמות של דנ"א חילוץ לפני ההתקנה PCR באמצעות ספקטרופוטומטר או fluorometer ו אלקטרופורזה בג'ל. זה יעזור להבטיח את הצלחת השלבים הבאים.
  2. שימוש, ספקטרופוטומטר בדיקת DNA איכות וכמות. תשואות ה-DNA טוב צריך להיות בין 50 ל 150 ng / μl עם 260/280 ו - 230/280 יחס קרוב ל 2.0. לדוגמה, תרשים 2 מציג תוצאות באיכות טובה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE).
  3. לבצע באמצעות אלקטרופורזה בג'ל רגיל 1% agarose. ודא נוכחות של להקות גדולות יחסית (> 10 Kb) עם שום נמרח קצת זיהום RNA (איור 3).
  4. אם ריכוז ה-DNA הוא גבוה, דגימות DNA לדלל עד 70 ng / μl על הצעדים הבאים.

4. PCR primers

Primers את ה-PCR נעשה שימוש בפרוטוקול זה מבוססות על הבדלים רצף בין אזור trnL-F plastid spacer של גנוטיפים cogongrass ו JBG. הבדלים אלה באים בצורה של SNPs (פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד) ו InDels (הוספות ומחיקות) שאפשרו את התפתחות מגוון ספציפיים primers ידי איתור primers באתרי רצפים ייחודיים (איור 4).

  1. איכות primers את יכולה להיות השפעה משמעותית על תוצאות ה-PCR. סדר primers מחברה מכובדת. אנחנו מזמינים primers שלנו אלכסוני ביו, Inc (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), מבקש רק desalting הליכים סטנדרטיים.
  2. trnL-F primers בקרה חיוביות: קבוצה זו תחל מגביר את האזור plastid trnL-F spacer של מינים הדשא ביותר 11-13 ומשמש בקרה חיובית טוב (וכתוצאה מכך הלהקה נ"ב 890).
    שם רצף
    trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 "
    trnL (אקסון '5), C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 "
  3. Wild-type primers cogongrass: אלה קבעו פריימר ספציפי cogongrass ולא להגביר את האזור F trnL של JBG גנוטיפים. את סט התוצאות הלהקה כי הוא 595 נקודות בסיס.
    שם SEQuence
    trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 "
    trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 "
  4. JBG ו JBG בטל primers: זו קבוצה פריימר ספציפי JBG גנוטיפ ולא להגביר את האזור F trnL של cogongrass. את סט התוצאות הלהקה כי הוא 594 נקודות בסיס.
    שם רצף
    trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 "
    trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 "
  5. Resuspend כל צבע יסוד בהיקף מספיק nuclease ללא DDH 2 O להשיג 100 מניות מ"מ פתרונות שניתן לאחסן ב -20 ° C, לטווח ארוך.
  6. לדלל כל המניות תחל מ"מ 12 לפני שלבי ההתקנה ה-PCR.

5. הגדרת ה-PCR

ה-DNA עקירות הם מוגבר באמצעות כל אחד מגדיר פריימר לעיל PCR תגובות. כלול שליטה חיובית על מנת להבטיח כי כל ריאגנטים ה-PCR עובד טוב יכול ליצור הלהקה. כלול שליטה שלילי על מנת להבטיח שאף אחד ריאגנטים הם מזוהמים DNA לא רצוי. שליטה שלילית מכיל ללא תבנית ויש גורמת לייצור לא הלהקה.

  1. הכן את כל התגובות דק דופן צינורות ה-PCR על מנת לאפשר העברת חום טובה יותר בין גוש thermocycler ואת המדגם. אנו ממליצים להשתמש זמינים מסחרית אירוסול ללא טיפים פיפטה כדי למנוע זיהום.
  2. עבור מדגם זה ה-DNA בודד, הקים 50 תגובות μl ה-PCR באמצעות כל אחד מגדיר פריימר הנ"ל ב דק דופן צינורות 0.2-מ"ל ה-PCR על ידי הוספת חומרים כימיים הבאים על הקרח כדי המפורטים להלן. אם דוגמאות רבות נמצאים בהכנה, את קוקטייל המכיל את כל חומרים כימיים, למעטשל תבנית דנ"א כדי לקבוע תנאים אחידים בין כל התגובות.
    PCR מגיב נפח משומשים סופי Concetration
    Nuclease ללא DDH 2 O 40.5 μl
    10X Advantage 2 PCR חוצץ (Clonetech, CA) 5.0 μl 10% (V / V)
    היתרון ultrapure PCR dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחד, Clonetech, CA) 1.0 μl 0.2 מ"מ
    פריימר 1 (12μM ב DDH 2 O) 1.0 μl 0.24 מיקרומטר
    פריימר 2 (12μM ב DDH 2 O) 1.0 μl 0.24 מיקרומטר
    2 היתרון פולימראז Mix (Clonetech, CA) 0.5 μl 1% (V / V)
    מיצוי DNA(70 ng / תגובה: לשנות DDH 2 O נפח לפי הצורך) 1.0 μl 1.4 ng / μl
    סה"כ: 50.0 μl
  3. על מנת להבטיח כי כל ריאגנטים ה-PCR עובד היטב, להגדיר את השליטה חיובית באמצעות primers בקרה חיוביים. זו קבוצה פריימר עובד לא פחות טוב cogongrass, JBG, JBG לחזור ועשבים אחרים תגרום הלהקה כלומר 890 נקודות בסיס.
  4. הגדרת הבקרה השלילית באמצעות פריימר אותה שליטה כאמור שליטה חיובית, תוך שימוש DDH 2 O במקום מיצוי DNA. אם ריאגנטים כל חופשיים של DNA מזהם, התגובה הזו תגרום הלהקה לא.
  5. אם ריכוז ה-DNA הוא נמוך, ה-DNA יותר ניתן להוסיף כל תגובה, התאמת כמות nuclease ללא DDH 2 O נהג להביא את עוצמת התגובה סך μl 50. אין להשתמש יותר מ 5 μl של ה-DNA (10% הנפח הכולל) לכל Reaction, זיהומים כמו האפשריים הכלולים דגימות DNA יכול לעכב PCR תגובות.

6. PCR אופניים

  1. ביצוע amplifications PCR ב thermocycler מצויד במכסה מחוממת באמצעות הפרמטרים הבאים ה-PCR אופניים. אנו משתמשים Pro Mastercycle S thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, ניו יורק) מוגדר לפעול בתנאים סטנדרטיים ramping הטמפרטורה. כל thermocycler איכות צריך ביצועים טובים.
    מחזור Denaturation חישול פילמור
    1 2 דק 'ב 95 ° C
    2 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס 30 שניות על 61 מעלות צלזיוס 90 שניות על 68 מעלות צלזיוס 35 מחזורים
    3 5 דק 'ב 68 ° C
    להחזיק ב 4 ° C עד המדגם מוסר
  2. לייעל את התנאים PCR (כולל טמפרטורת צבע יסוד חישול, פעמים הרחבה, ומספר מחזורי) לפי הצורך בהתאם לאיכות של ה-DNA, primers, פולימראז Taq או סוג של thermocycler בשימוש. אנו ממליצים להשתמש thermocycler מסוגל שיפוע בעת קביעת אופטימלי חישול בטמפרטורה.
  3. אם thermocycler בשימוש אין מכסה מחוממת, להוסיף 1 טיפה של שמן מינרלי לחלק העליון של מדגם זה על מנת למנוע אידוי בעת רכיבה על אופניים PCR.

7. ג'ל אלקטרופורזה של PCR מוצרים

כדי להמחיש את תוצאות הניתוח, נפרדים מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose 1% באמצעות אלקטרופורזה רגילה.

  1. שלב 2 μl של מאגר ה-DNA תקן הטעינה (בדרך כלל פתרון או 5x 6x) עם 5 μl של כל מוצר PCR מוגבר.
  2. טען דגימות על 1% agarose ג'ל המכיל EtBr (ברומיד ethidium עבור מכתים DNA) עשה עם הither טה או SB (borate נתרן) חיץ מערכות 16. אנו משתמשים 1 μl של פתרון EtBr 10 מ"ג / מ"ל ​​המניות לכל 100 מ"ל agarose 1% (0.1 מיקרוגרם / מ"ל).
  3. הפעל דגימות ב ~ 120V עד לפני צבע מגיע ¾ באורך כולל של ג'ל.
  4. תחת אור UV (למשל גל קצר UV תיבת אור), לבדוק את להקות כתוצאה לראות אם שבר המתאים היה מוגבר.
  5. לתעד את הג'ל להקות וכתוצאה מכך באמצעות המערכת זמינה צילום תיעוד או מצלמה.

8. נציג תוצאות

עם ויזואליזציה של מוצרי ה-PCR, cogongrass יש דפוס פסים ייחודי בהשוואה לזו של JBG או חזרו JBG (איור 5). עבור מדגם זה ה-DNA, trnL-F קבוצה חיובית פריימר השליטה צריכים להביא הלהקה בעוצמה גבוהה יחיד ~~~HEAD=NNS 890 נ"ב. זה מוודא כי כל ה-PCR ריאגנטים פועלות כראוי. כמו כן, השליטה תגובה שלילית (ללא תבנית) צריך להכיל לא להקות עבור כל צבע יסוד שלet בשימוש. זה מוודא שאף אחד ריאגנטים היו מזוהמים.

אם דגימת DNA נגזר wild-type cogongrass, תגובת PCR באמצעות מערכת cogongrass ספציפי פריימר תגרום להקה אחת ב ~ 595 BP בעוד JBG ספציפיים primers תגרום הלהקה לא. כמו כן, אם דגימת DNA נגזר JBG או חזרו JBG, תגובת PCR באמצעות מערכת JBG ספציפי פריימר תגרום להקה אחת ב ~ 594 BP בעוד cogongrass ספציפיים primers תגרום הלהקה לא. בגלל JBG וחזרו JBG יש חומצה זהה רצף גרעין, הם לפיכך יש דפוסי שהתקבצו זהים. אם דוגמאות רבות כדי להשוות על ג'ל בעת ובעונה אחת, אנו ממליצים להפעיל את כל דגימות הנגזרות פריימר כל קבוצה זה לצד זה, ובכך קל יותר לסרוק את הדגימות עבור תוצאות חיוביות.

הבדלים מורפולוגיים בין JBG ו JBG חוזר ברורות למדי (למשל, הצבע האדום של העלים קומה נמוכה של JB G לעומת צבע ירוק, שיעור קומה גדול יותר וצמיחה אגרסיבית של JBG לחזור), אז בעוד תוצאות ה-PCR יהיה אותו דבר, הזנים JBG קל להבחין באמצעות מבנה הצמחים.

figure-protocol-1
באיור 1. השוואת החממה גדלה Imperata cylindrica var. Koenigii (עשב דם יפני), הוחזר א cylindrica var. koenigii (JBG החזר) ואני cylindrica (wild-type cogongrass).

figure-protocol-2
איור 2. דוגמה דגימות דנ"א לאמת באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. שימו לב, בלי קשר ספקטרופוטומטר שימוש, יחס 260/280 צריך להיות קרוב ל -1.8 והיחס 260/230 יש קרוב 2.0.

ontent "> figure-protocol-3
באיור 3. דגימות DNA אומת באמצעות אלקטרופורזה בג'ל רגיל על ג'ל agarose 1%. סמן דנ"א מסחרי שימש ניתוח גודל. ליין מס '4 הוא דוגמה מדגם באיכות ירודה DNA, מראה מריחות וכמה זיהום RNA.

figure-protocol-4
באיור 4. יישור רצף של trnL-F אזורי Imperata cylindrica var. Koenigii (עשב דם יפני), הוחזר א cylindrica var. koenigii (JBG החזר) ואני cylindrica (wild-type cogongrass). חיצים שחורים אנכיים מציינים הבדלים רצפים הנובעות SNPs ו InDels. החצים הירוקים האופקיים מציינים את עמדותיהם של wild-type primers cogongrass המשמשים cogongrass ספציפי PCR. החיצים האדומים מציינים את אופקי poוחיבורים של JBG ו JBG בטל פריימרים המשמשים JBG ספציפי PCR.

figure-protocol-5
איור 5. תוצאה נציג ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR הנגזרות cogongrass, JBG ו JBG לחזור דגימות DNA בשילוב עם cogongrass-and JBG ספציפיים primers וכן trnL-F בקרה חיובית מלאה כל תבנית שלילית.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הילדים בארה"ב תעשיות נוף ניזונים טיפוח ומכירת מיני צמחים אקזוטיים רומן. זה, יחד עם הגלובליזציה הגוברת של הסחר, מגביר את הסיכוי זן צמחים פולשניים יהיה להיכנס, להקים, ופרש בארה"ב היכולת לווסת פדרלי צמחים כאלה מסתמך על מידע שהוא לעיתים קרובות אינה זמינה, כולל פוטנציאל להפוך פולשנית , טקסונומיה נכונה, ואבחנה גנטית בין מינים יליד לאזרח. בגלל הידע שלנו על צמחים פולשניים בדרך כלל מוגבל, צמחים מיובאים עם מאפיינים פולשניים מוסתרים הוכנסו רק ברצון ללמוד לאחר מכן כי הם פולשים משאבים חקלאיים וטבעיים שלנו. פרוטוקול זה נועד לטפל בבעיות כאלה הקשורים עם י cylindrica זנים ידי מתן השיטה הראשונה מולקולרית פשוטה שיכולה במדויק להבחין בין wild-type cogongrass וצורת חזרה של עמיתו JBG נוי שלה.

"jove_content> עבור פיתוח של פרוטוקול זה, wild-type cogongrass נאסף אוכלוסיות שהתאזרח בבית יחידת קריק יערנות בריכה סנטה רוזה במחוז ליד ג'יי, פלורידה ביוני 2008. JBG היה רכש מהמשתלה מסחרי (הציפור הכחולה משתלת, Inc ..) בחודש יוני 2008 וכן מאוסף של בעל הבית בקולומביה, מיזורי JBG חוזר התקבלו בחצר מוזיאון קמפבל הגיאולוגית ב אוניברסיטת קלמסון, SC ביוני 2008; מאוניברסיטת פארק ריברדייל, MA ביוני 2009; ו מן החצר הקדמית של בעל הבית בקולומביה, מיזורי בשנת 2009 (מזוהה על ידי לילנד Cseke). כל הצמחים נשמרו בחממה ממוקם באוניברסיטת אלבמה בהאנטסוויל (Huntsville, AL).

רצף גנטי של ה-DNA שנאספו מצמחים אלה כלל בהשוואות עומק של 9 אזורים דנ"א עצמאיים הנפוצים לצמחים ברקוד 2. בכל מקרה, רצף של JBG היו במשחק 100% לאלו של JBG לחזור, ובכך עוזרלוודא כי אכן JBG לחזור לטופס, ירוק פולשנית. רק ITS גרעיני trnL-F אזורים הכלורופלסט יש הבדלים שניתן להשתמש בהם כדי להבחין בין גנטית cogongrass ו JBG. באזור שלה יש בסך הכל 3 SNPs (פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד) בין cogongrass ו JBG, ואילו באזור trnL-F יש 2 SNPs ו 2 InDels (הוספות ומחיקות). אלה הבדלים גנטיים שונים מותר ספציפיים primers ה-PCR יש לפתח שיכולים להבחין בין wild-type cogongrass ו JBG חוזר. את התוצאות הכי אמין הגיעו primers שמקורם באזור trnL-F plastid. כך, פרוטוקול זה מבוסס על ההבדלים בין רצף ה-F-trnL אזורים בגנום הכלורופלסט של cogongrass, JBG וחזרו JBG (איור 4).

כדי לסייע ביצירת פריימרים ספציפיים יותר את הזנים הנדונים ועל מנת למנוע תוצאות חיוביות שגויות ממינים הקשורים באופן הדוק, אלידוע וסעד trnL-F רצפים של א זנים cylindrica הושוו trnL-F רצפים ממינים דשא הקשורים (43 רצפים עצמאיים מ 29 מינים, כגון Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, קמיליה Miscanthus, Saccharum officinarum, halepense דורה). אמנם, בחנו מגוון ספציפיים רצפים פריימר על 29 מינים של הדשא, את הספציפיות של מגוון ספציפיים primers לא נבדקה באופן מקיף על יכולתו להגביר את ה-DNA מרוב מיני דשא אחרים. כתוצאה מכך, רקמת משמש להפקת DNA יש לזהות היטב כמוני cylindrica לפני החל בפרוטוקול זה. אם הדשא לא ניתן לזהות או cogongrass או JBG, אז אנחנו מציעים רצף של מוצר ה-PCR על מנת לוודא כי הם רצפים התאמה מדויקת כדי cogongrass או JBG. נכון לעכשיו, השיטה המדויקת ביותר כדי לוודא את זהותו של הדגימה הדשא נתון הוא לבצע PCR על שניהם לאrnL-F ואזורים שלה, שייבדק על ידי רצף של מוצרי ה-PCR והשוואה של רצפים על רצפים של מינים ידועים לזהות במדויק. ה-DNA יכול להיות מוגבר באמצעות primers בקרה המפורטים בפרוטוקול זה (לאזור trnL-F) או פריימרים אחרים הזמינים בפרסומים אחרים 13-15. סידור העבודה הוא הרבה יותר ועלות אינטנסיבית יותר באמצעות הליך פשוט שלנו.

האיכות של פריימרים המשמשים PCR היא קריטית להצלחת ההליך. עשינו את primers עבור הליך זה זמין אלכסוני ביו, Inc ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). יתרון הזמנת את primers מ ביו אלכסוני היא שהם לאחסן מספר רב של aliquots של צבע יסוד אחד מתוך סדרת ייצור זהה מדגם כמו primers השתמשנו לאופטימיזציה במעבדה שלנו. כתוצאה מכך, primers לא רק את רצף זהה, אך לאהיי באים הרבה הייצור המדויק ששימשה בפרוטוקול זה. באמצעות פריימרים ממגרש זאת, יכול לסייע במניעת משתנים חיצוניים בהליך הנובעים הבדלים באיכות של primers PCR. כמו כן, בעוד אחרים polymerases Taq אמור לעבוד בסדר עבור ה-PCR, איכות פולימראז Taq בשימוש תהיה השפעה על איכות תוצאות ה-PCR. כדי לאפשר מרקם טוב יותר PCR ריאגנטים, יש לנו מותאם פרוטוקול באמצעות חומרים כימיים מ Clontech. 2 Advantage פולימראז (Clontech, Mountain View, קליפורניה, חתול # 639201 או 639202) הוא תערובת של פולימראז חזקים, Taq חם ההתחלה האנזים הוכחה קריאה המסייע לספק סגוליות גבוהה amplifications מדויקות יותר.

כי פרוטוקול זה מסתמך על ה-DNA הכלורופלסט, אשר ירש אימהי של עשבים, אירועים הכלאה בין גנוטיפים cogongrass ו JBG לא יכול ליפול בפח עם הליך הזיהוי המולקולרי שלנו. במקרים בהם hypridization הוא suspected, מומלץ להשתמש באזורים גרעיני שעברו בירושה משני ההורים. הנפוץ ביותר לא plastid האזור משתנה לשקול genotyping המפעל הוא האזור גרעינית ריבוזומלי ITS 13-15,17. נכון לעכשיו, אנו מתקדמים לקראת ריבוב הגברה של האזור הכלורופלסט trnL-F עם זה של אזור הגרעין שלה בצינור PCR אחת. ריבוב plastid עם אזורים דנ"א גרעיני היה פוטנציאל לעקוף את מגבלות השימוש לבד, עם זאת, שיטות אלו דורשות אופטימיזציה והערכה נוספת כדי לקבוע היתכנות על מקרה לגופו. השימוש כמותי בזמן אמת PCR (QPCR) וטכנולוגיות חדשות יותר, כגון אלומות מולקולריות (בדיקות פריימר ניאון), הם גם העריכו כמו שיטות genotyping כשל ומדויק הצמח.

הפרוטוקול המובא כאן מספק גישה מהירה ואמינה להבחין JBG לחזור מזה של wild-type cogongrass. אנו ממליצים להשתמשRS פרוטוקול זה לפנות אלינו על מנת לדווח על תוצאות הנובעת משימוש של פרוטוקול זה. מידע משותפים אלה יסייעו לספק מידע על התפלגות JBG חוזר. זה גם יעזור הרגולטורים ב USDA לקבל החלטות מושכלות על פעולות שניתן צריך לעקוף את התפשטות פוטנציאל הכלאה של זנים פולשניים מאוד cogongrass.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו מה למסור.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים אלן טסקר (USDA-כנימות, ריברדייל, MD), סטיבן קומפטון (Clemson), שרי Aultman (Clemson), קרייג רמזי (USDA-כנימות, פורט קולינס, CO), ובטי Marose (UMD) לקבלת סיוע בהשגת דגימות . אנו מודים לתלמידים אנדרו אדריאן (UA-Huntsville) ודרק Thacker (UA-Huntsville) על עזרתם בבדיקת פרוטוקול זה, ויוסף Herdy עבור עבודתו צילומי וידאו. עבודה זו מומנה על ידי דגים הלאומי קרן חיות הבר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
DNeasy הצמח מיני קיט Qiagen, ולנסיה, CA 69104 או 69106 כל הגנומי מכובד במפעל ערכת ה-DNA כי התשואות DNA באיכות טובה אמורה לפעול על נהלים אלה.
trnF (GAA)-F אלכסונית ביו, Inc 3-0578 בקרה חיובית קדימה פריימר
trnL (אקסון '5), C אלכסונית ביו, Inc 3-0579 הפוך פריימר בקרה חיובית
trnLF-C-F1 אלכסונית ביו, Inc 3-0864 קדימה wild-type cogongrass פריימר
trnLF-C-R1 אלכסונית ביו, Inc 3-0865 להפוךwild-type cogongrass פריימר
trnLF-R-F2 אלכסונית ביו, Inc 3-0866 קדימה JBG ו JBG לחזור פריימר
trnLF-R-R2 אלכסונית ביו, Inc 3-0867 הפוך JBG ו JBG לחזור פריימר
היתרון ultrapure PCR dNTP Mix Clontech, Mountain View, CA 639125
2 היתרון פולימראז Clontech, Mountain View, CA 639201 או 639202 טוב הוכחה לקריאה, חם תחילת Taq פולימראז

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).
  2. CABI, Crop Protection Compendium. Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , Wallingford, UK. (2007).
  3. MacDonald, G. E. Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management. Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).
  4. Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).
  5. Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management. Weed Technology. 12, 737-743 (1998).
  6. Chikoye, D., Ekeleme, F. Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa. Weed Research. 41, 475-490 (2001).
  7. Weber, E. Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).
  8. Patterson, D. T. Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats. Weed Science. 28, 735-740 (1980).
  9. Cole, J. T., Cole, J. C. Ornamental grass growth response to three shade intensities. Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).
  10. Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability. Weed Technology. 21, 141-144 (2007).
  11. Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States. Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).
  12. Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. CPHST Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).
  13. Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers. J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).
  14. Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).
  15. Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data. Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).
  16. Brody, J. R., Kern, S. E. Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques. 36, 214-216 (2004).
  17. Chou, C. -H., Tsai, C. C. Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

b ng PCRDNADNADNA

מאמרים קשורים