מאמר שיטה
ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות necromenic Pristionchus פקיפיקוס ללימודי הביולוגיה האבולוציונית, התפתחותיים, התנהגותיים.
למרות זאת הוא סביר יותר ויותר עבור אורגניזמים מודל המתעוררים להשיג רצף הגנום לחלוטין, נוסף מעמיק פונקציה גן ומנתח ביטוי על ידי התערבות RNA ו transgenesis יציב להישאר מוגבלת מינים רבים בשל האנטומיה בפרט ביולוגיה תאית מולקולרית של האורגניזם. כך, למשל, מחוץ Caenorhabditis קבוצת כתר הכולל Caenorhabditis elegans 3, המשודר ביציבות קווי מהונדס שאינם Caenorhabditis מינים לא דווחו מערכה זו מטעה (Nematoda), למעט Strongyloides stercoralis 4 ו Pristionchus פקיפיקוס 5. כדי להקל את תפקידו המתרחב של פ פקיפיקוס במחקר של התפתחות, אבולוציה, התנהגות 6-7, נתאר כאן את השיטות הקיימות להשתמש microinjection להכנת חיות טרנסגניות ואת הגן להפיל על ידי RNAi. כמו בלוטות המין של פ פקיפיקוס הוא syncitial ומסוגלים שילוב DNA ו-RNA לתוך ביציות כאשר נמסר על ידי microinjection ישיר. שלא כמו ג elegans עם זאת, transgene ירושה יציבה ביטוי סומטי פ פקיפיקוס דורש תוספת של הדנ"א הגנומי עצמי מעוכל עם endonucleases משלים את הקצוות של transgenes היעד סמנים coinjection 5. תוספת של הדנ"א הגנומי הספק דומה הדרישה לביטוי transgene ב Strongyloides stercoralis 4 והן בתאי הנבט של C. elegans. עם זאת, לא ברור אם דרישה ספציפית של הדנ"א הגנומי שלו של החיות הוא כי פ פקיפיקוס סומה הוא יעיל מאוד השתקת שאינם מורכבים רב להעתיק את הגנים או מערכים extrachromosomal ב P. פקיפיקוס דורשים רצף גנומי להרכבה kinetochore נאות במהלך מיטוזה. ההגירה הגחון של שני חמושים (didelphic) בלוטות המין של הרמפרודיטים מסבכת עוד יותר את היכולת להזריק הן בלוטות המין של תולעים הפרט 8. אנחנו גם מדגימים את השימוש microinjection כדי מציאה מוטציה דומיננטית (הרים, tu92) על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך בלוטות המין כדי להשיג ללא גלגול 1 הצאצאים F. שלא כמו ג elegans, אבל כמו נמטודות האחרים, פ ' פקיפיקוס PS312 אינו פתוח RNAi מערכתי באמצעות האכלה השריית ולכן dsRNA חייב להיות מנוהל על ידי microinjection לתוך בלוטות המין syncitial. במחקר הנוכחי, אנו מקווים לתאר את התהליך microinjection צורך להפוך האמרגן PPA-EGL-4:: כתב ה-GFP היתוך מציאה הרים דומיננטי PRL-1 (tu92) מוטציה בפרוטוקול מידע חזותי.
1. Transgenesis: הכנת ה-DNA
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פ אוכלוסיות פקיפיקוס נמצאים בשיתוף הדוק עם מינים שונים חיפושית חיפושית ברחבי העולם הוא נמטודות מודל ביניים בין חיים חופשיים נמטודות טפיליות. כוחה של פ פקיפיקוס כאורגניזם מודל המתעוררים טמון בשילוב של מפות גנטיות הפיזי שלה כי לקדם מיפוי מיקומית של מוטציות גנטיות מבודד מסכי קדימה משוחדת (כלומר, לא רק עבור גנים מועמדים מאופיין בעבר C. elegans) 6,10. עם זאת, C. טכניקות elegans גנטית אינם ניתנים להעברה בקלות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
המחברים מודים מאוד RJ זומר ו-X וואנג לסיוע עם microinjection, כמו גם הערות תובנה מן הבודקים אנונימי. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק SC2GM089602.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| המוצר: | קטלוג #: | הספק: | |
| DMI3000 הזרקת מיקרוסקופ | DMI3000 | לייקה | |
| Microinjector מניפולטור (נסיעה ישירה) | Narashige BC-3 בול משותף | Tritech מחקר | |
| מחט פולר | Narashige PC-10 | Tritech מחקר | |
| MicroInjector ™ All-Digital Multi-לחץ מערכת | Narashige MINJ-D | Tritech מחקר | |
| GeneElute ™ היונקים הדנ"א הגנומי Miniprep Kit | G1N70 | סיגמא | |
| pJet שיבוט Jet ערכת | K1231 | Fermentas | |
| GeneJET פלסמיד Miniprep ערכת | K0502 | Fermentas | |
| ה-DNA Clean & מרוכז ™ | D4005 | ZYMO מחקר | |
| BLOCK-IT ™ RNAi Topo ® ערכת שעתוק | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen | |
| אגר Difco ™ נובל | DF0142-15-2 | פישר Scientifi | |
| כיסוי זכוכית מיקרוסקופ (1.5-0.16 עד 0.19mm עבה; גודל: 50 x 45 מ"מ) | 12-554-F | פישר סיינטיפיק | |
| זכוכית נימים (נימה) | 615000 | AM מערכות | |
| שמן פרפין (קשה) | O122-1 | פישר סיינטיפיק | |
| KH 2 PO 4 | P386-500 | פישר סיינטיפיק | |
| Na 2 HPO 4 | AC20651-5000 | פישר סיינטיפיק | |
| NaCl | BP3581 | פישר סיינטיפיק | |
| MgSO 4 | M80-500 | פישר סיינטיפיק |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה