מאמר שיטה

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ אנופלס Spp.

DOI:

10.3791/3281

⸱

9 בינואר 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Malaria Institute at Macha, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי של אנופלס אח מינים באמצעות PCR.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדינות אנדמיות יותר ויותר לאמץ כלים מולקולריים להקלדה יעילה, זיהוי ומעקב נגד טפילי מלריה ויתושי וקטור, כחלק בלתי נפרד מתוכניות בקרת 1,2,3,4,5. להקמת בר קיימא של גישות המדויקות אלה בפעולות מחקר כדי לחזק את שליטת מלריה ומאמצי חיסול, שיטות פשוטות ובמחיר סבירים, עם ריאגנט החסכן ודרישות ציוד חיוני 6,7,8. כאן אנו מציגים טכניקה Chelex מבוססת פשוטה לחילוץ טפיל מלריה ודנ"א מדגימות יתושי וקטור שדה שנאספו.

אנו מורפולוגית זיהו 72 אנופלס gambiae sl. מ156 יתושים שנתפסו על ידי Pyrethrum התרסיס תופס בחדרי שינה נפרדת של משקי בית תוך 2 קרבה 2,000 ק"מ של מכון המלריה בMacha. לאחר נתיחה כדי להפריד את הראש ובית החזה מהבטן לכל 72 אנופלס gambiae sl. יתושים, שני הסעיפים הונחו בנפרד ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל ושקוע ב20 μl מי deionized. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, כל מקטע יתוש homogenized בנפרד להשעיה אחידה במי deionized. של homogenate שהתפתח מכל קטע יתוש, 10 μl נשמר תוך 10 μl האחר הועברה לצינור מ"ל נפרד autoclaved 1.5. את aliquots הנפרד נחשפו למיצוי DNA או על ידי Chelex הפשוט או סטנדרטי המלחה החוצה חילוץ פרוטוקול 9,10. פרוטוקול ההמלחה החוצה הוא מה שנקרא ושימוש נרחב משום שהיא מעסיקה ריכוז מלח גבוה במקום בממסים אורגניים מסוכנים (כגון פנול וכלורופורם) לצעד משקעי החלבון במהלך חילוץ דנ"א 9.

תמציות שמשו כתבניות להגברת PCR באמצעות פריימרים מיקוד dehydroge פרוקי הרגליים המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotidenase (NADH) 4 גן המקטע (ND4) כדי לבדוק את איכות דנ"א 11, PCR לזיהוי מיני אחי gambiae אנופלס 10 ו PCR מקונן להקלדה של זיהום Plasmodium falciparum 12. PCR השוואה באמצעות איכות ה-DNA (ND4) הראתה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישה היחסית לפרוטוקול מבוסס המלחה החוצה Chelex. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. לא היו הבדלים משמעותיים בשיעור של דגימות נותנות אות amplicon עם Chelex או המלחה מתוך פרוטוקול קבוע בכל השלושה יישומי PCR. גישת Chelex נדרשה שלושה ריאגנטים פשוטים ו37 דקות כדי להשלים, תוך המלחה מתוך הפרוטוקול הכרוך 10 ריאגנטים שונים ו2 זמן העיבוד "47 דקות hr ו, כולל צעד בן לילה. התוצאות שלנו מראות הבשיטת Chelex דומה לחילוץ הקיים המלחה החוצה וניתן להחליף כגישה פשוטה וברת קיימא בהגדרות משאבים מוגבלים שבי שרשרת אספקת מגיב קבועה היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dissection הכנת דגימות יתושים

  1. יתוש מקום על חיתוך קטן של parafilm והר על ביתור מיקרוסקופ.
  2. לכסות בטיפת מי deionized לרכך רקמות.
  3. חתוך נבלת היתוש בדיוק במפרק בין בית החזה והבטן, ובכך סחבתי את הראש ובית החזה מסעיף הבטן.
  4. העבר כל קטע יתושים גזורים לתוך צינור נקי autoclaved 1.5 מ"ל microcentrifuge prelabeled עם פרטי יתושי ת.ז וכראוי מסומן לציון סעיף גוף (לדוגמה: "מ '" לקטע באמצע בטן; "HT" לראש ובית החזה בסעיף).
  5. השלך parafilm ולנגב במת מיקרוסקופ בזהירות עם 70% אלכוהול טבול Kimwipe לפני עיבוד היתוש הבא.

2. הפקת דנ"א מדוגמאות יתושים

  1. 20 μl פיפטה של ​​מים לתוך צינור deionized מדגם עצת פיפטה שימוש לטחון סעיף היתוש השקוע באו"םהשעית iform.
  2. הוסף 100 μl של פתרון סאפונין 1% לhomogenate מדגם ותמהיל ידי vortexing הרגעי העדין autoclaved 1X PBS /.
  3. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
  4. צנטריפוגה ב XG 20000 עבור 2 דקות וזורקים supernatant.
  5. Resuspend גלולה בμl 1X PBS 100.
  6. צנטריפוגה שוב ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant.
  7. על ידי vortexing העדין (5 שניות), resuspend גלולה במי deionized סטרילי μl 75 ו 25 μl של 20% השעית w / v Chelex-100 שרף במי deionized.
  8. חור פירס במכסה של צינור מדגם באמצעות מזרק 23 ז סטרילי flamed במבער בונזן.
  9. השעית רתיחת מדגם באמבט מים במתקן צף (או בבלוק חימום) למשך 10 דקות.
  10. צנטריפוגה ב XG 20000, עבור פתרון ה-DNA העברה התפתח 1 דקות ולתוך בקבוקון האחסון prelabeled לשימוש כתבנית ביישומי PCR.

3. Plasmodium falciparum genotyping ואנופלסspp. זיהוי מולקולרי

  1. הוסף 2.5 μl של תמצית ה-DNA Chelex ב25 תגובות PCR μl כדי לבדוק את איכות דנ"א 11, לזהות מיני אנופלס 10 ולגנוטיפ פ falciparum 12 דלקות בלוטת אמצע בטן ורוק.
  2. כדי למקסם את תשואת amplicon, במיוחד לפ איתור falciparum, כולל 1.5x אלבומין בסרום שור (BSA) בבדיקת PCR. הרכב התגובה הבא מומלץ: (2.5 תבנית μl, 0.25 פריימרים מיקרומטר, מגנזיום כלוריד מיקרומטר 1.5, 200 dNTPs מיקרומטר, 1X PCR חיץ, 1.5x BSA וDNA פולימראז 1.0U Taq, ב 25 כרכי μl).
  3. כדי לבדוק לאיכות ה-DNA בתמצית, להגביר אזור דהידרוגנז פרוקי רגלי המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotide (NADH) מקטע 4 (ND4) גן (פריימרים ND4FW [5'-GTD יאט tta TGA TTR CCT ​​AA-3 '] וND4RV [5' CTT-CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; מצפה מוצר 400bp) 11,13.
  4. כדי לבדל אנופלס גמביהדואר SL. מיני אחים (An. gambiae ss ו. arabiensis בלבד), להגביר אזור איגוף SNPs באזור spacer intergenic (IGS), (פריימרים האו"ם [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; מצפה 390bp המוצר gambiae ss, 315bp arabiensis) 10,11.
  5. עבור ההקלדה פ פולימורפיזמים סמי התנגדות antifolate falciparum, לבצע PCR המקונן כדי להגביר אזור איגוף קודונים חומצת אמינו 108, 51, 59, 16 ו 164 בטפיל dihydrofolate רדוקטאז (DHFR) גן:
    עגולי פריימרים עיקריים: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] וM5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
    עגולים פריימרים שניים: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] עם F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
    או
    F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] עם M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
    גם להגביר אזור המכיל חומצת אמינו קודונים 436, 437, 540, 581 אnd 613 בפ synthetase גן falciparum dihydropteroate (DHPS):
    הסבב הראשוני פריימרים R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] עם R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
    פריימרים עגולים משניים
    J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] עם K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
    או
    K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] עם K /,
    או
    L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] עם L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12.
  6. 4 amplicon μl הכפוף לdigestions אלל הספציפי הגבלה באנזים 30 תגובות μl בעקבות הוראות היצרן, כדי לזהות פולימורפיזמים סמים antifolate התנגדות הקשורים 12.
  7. 5 μl הנושא של ה-PCR amplicon (או 15 μl הגבלת התקציר) לכל נתיב של 2% ג'ל ethidium רומיד המוכתם agarose לאלקטרופורזה (100 - 120V) ולדמיין להקות תחת קוף UV.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמאות לתוצאות ממבחני PCR לאיכות תמצית ה-DNA יתוש (איור 1), זיהוי אנופלס arabiensis מולקולרי (איור 2) ופ falciparum זיהוי (איור 3) מראה ששיטת Chelex הפשוטה מניבה תוצאות דומות לרמת המלחה מתוך פרוטוקול 10, למרות צעדים הרבה פחות (טבלה 1). עם איכות DNA דומה בתמציות בהתאמה, אין זה מפתיע כי שיעורים חיוביים לדוגמה ביחס ל. מיני אחי gambiae כמו גם שיעורי זיהום טפיל לא היו סטטיסטי המבוסס על בדיקת צ'י המרובעת של McNemar (איור 3) שונים.

רגישות (%) חושבת כTP / (TP + FN) * 100, שם מציין TP החיוביים אמיתית וFN מציין שליליים כוזבת. סגולי (%) נקבע כTN / (TN + FP) * 100, שם מציין TN תשלילים אמיתיים וFP מציין תוצאות חיוביות שגויות. איכות ה-DNA ( ND4) PCR הראה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישת Chelex השוואה להמלחה הוקם מתוך פרוטוקול כתקן זהב. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR.

התוספת של BSA לתערובות תגובה הביאה לעלייה כללית של התוצאות חיוביות PCR (איור 3) בשל הקלה של ה-PCR מעכבי 14, לשניהם Chelex והסדיר פשט המלחה את הפרוטוקול. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטי, פרט לאיכות ה-DNA (ND4 PCR) על תמציות Chelex (p = 0.039). עיכול אנזים הגבלת אלל ספציפי בפ falciparum DHFR (או גן היעד אחר) amplicon מאפשר genotyping של זיהומי מלרית בלוטת אמצע בטן ורוק לאללים סמי התנגדות (איור 4; נתוני בלוטת רוק אינו מוצגים).

תהליך פשוט Chelex תקן המלחה את הנוהל
צעדים ריאגנטים צעדים ריאגנטים
  1. הוסף לצינור דגימה microfuge מ"ל 1.5 והומוגני ב100 μl של פתרון Saponin% 1 (2 דקות) 1X PBS /.
  2. השאר בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
  3. ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant.
  4. הוסף 100 μl של 1X PBS ומערבב בעדינות על ידי vortexing רגע (3 שניות).
  5. ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant.
  6. הוסף 25 μl של 20% Chelex w / v במי deionized ומי deionized סטרילי μl 75.
  7. חור פירס במכסה של צינור דגימה באמצעות מחט חמה, סטרילי 23 ז מזרק ותכולת שפופרת להרתיח למשך 10 דקות.
  8. ספין צינור microfuge בשעת 20000 XG לדקות 1.
  9. העברת supernatant לפתרון ה-DNA חנות בקבוקון prelabeled סטרילית וב -20 ° C עד לשימוש (2.5 μl בתגובת PCR 25 μl).

PBS


Saponin

Chelex-100 חרוזים

  1. הוסף לצינור דגימה microfuge מ"ל 1.5 והומוגני ב* חיץ נדר μl 100 עם DEPC% 1 (2 דקות).
  2. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך השעות 1.
  3. הוסף תצטט 15 μl קר ז 8 אשלגן. מערבב בעדינות ולדגור על קרח למשך 45 דקות.
  4. ספין מדגם בצינורות microfuge ב20000 XG למשך 10 דקות והעברה supernatant לצינור מ"ל חדש 1.5.
  5. הוסף 250 μl של אתנול 100% ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור.
  6. דגירת מדגם בRT למשך 5 דקות.
  7. ספין דגימות ב20000 XG במשך 15 דקות.
  8. לשאוב ולהשליך supernatant, והשאיר את הכדור לייבוש מלא בצינור (30 מ 'ב).
  9. Resuspend גלול ב 20 μl של 0.1x SSC + RNAse (10 מיקרוגרם / מ"ל) הלילה ב 4 ° C.
  10. מוסיף מי 80 μl DEPC ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש.

Diethylpyrocarbonate (DEPC)
* נדר מאגר:
0.1 מ 'NaCl
0.2 סוכרוז M
0.1 מ 'טריס-HCL


0.05 M EDTA, pH 9.1


0.5% SDS במי DEPC

תצטט ז 8 אשלגן

אתנול

נתרן ציטראט חיץ מלוח 0.1x (SSC)

RNAse (10 מיקרוגרם / מ"ל)

זמן כולל: 37 דקות זמן כולל: 2 47 דקות לשעה, בתוספת הלילה
rder = "1">

טבלת 1. הצעד אחר צעד השוואה של ריאגנטים ודרישות זמן לפרוטוקול Chelex פשוט ולעמודארד המלחה את השיטה להפקת דנ"א מדגימות יתושים.

figure-results-1
איור 1. השוואת ND4 המיטוכונדריה PCR של DNA מאיכות הפשוטה Chelex "C" וסטנדרטי המלחה את התמציות "M" על דגימות שדה arabiensis אנופלס. NC שליטה, שלילית; M1 ו C1, C2 וM2, M3 ו-C3, ו M4 ו-C4 היא לזווג את ההמלחה ותמציות Chelex מאותה. דגימות יתושי arabiensis. L, סולם 100 נ"ב ה-DNA.

figure-results-2
איור 2 המולקולרי זיהוי PCR לarabiensis אנופלס C1 ו M1, M2 וC2, C3 ו-M3, C4 ו M4 יסמנו amplicon המתאים מהמלחה החוצה "ז" ופשט תמציות Chelex "C" לאותן דגימות דנ"א יתושים;.. AR, אנופלס arabiensisביקורת חיובית; הליטר, 100 נ"ב סולם הדנ"א.

figure-results-3
איור 3. איתור של תוצאות חיוביות על Chelex והמלחה החוצה תמציות DNA לדגימות שדה יתושים, עם מבחני PCR לזיהוי מולקולרי של אנופלס arabiensis (ע"ר) 10, גן פרוקי רגלי NADH דהידרוגנז 4 (ND4) בדיקת איכות ה-DNA 11, ו-P עמידות לתרופה antifolate . falciparum DHFR 12 genotyping (F-M4). תוצאות מוצגות עבור מבחנים לרוץ עם או בלי BSA בתמהיל התגובה. מבחן צ'י המרובע של McNemar שמש כדי לקבוע אם ההבדלים בין אחוזי PCRs החיובי מהדנ"א שחולצו מן Chelex הפשוט והסטנדרטיים המלחה מתוך פרוטוקולים היו מובהקים סטטיסטי.

figure-results-4
פ זיהומי falciparum ביתושים (נתוני אמצע הבטן מוצגים) עבור אללים עמידות לתרופה. אני עיכול BstN על amplicon איגוף קודון 108 לפ גן falciparum DHFR 12 תערוכות מוטנטים S108T cycloguanil עמידים בדגימות יתושים (M1-M5; נתוני אמצע הבטן מוצגים). U, לא מעוכל 522 נ"ב amplicon; FCR3, המעבדה הסטנדרטית פ שיבוט falciparum חיובי שליטה נושא S108T; K1, פ falciparum מעבדה סטנדרטית שליטה שלילית שיבוט נושאה S108N cycloguanil רגיש; הליטר, 100 נ"ב סולם הדנ"א.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה הפשוטה Chelex מוצגת כאן מאפשרת מיצוי של האיכות אנופלס spp ופ דנ"א falciparum מדגימות המתאימים ליישומים מגוונים PCR יתושים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת לזיהוי מולקולרי של יתושי מלרית וקטור ומעקב של פ העמיד לתרופות אללים falciparum ביתושים לתוכניות בקרת מלריה לאומיות. יתרונותיה של הטכניקה הפשוטה Chelex כוללים פשטות, ריאגנטים פחות ולכן עלות, בטיחות וזמן עיבוד קצר יותר (37 דקות) מפרוטוקולים סטנדרטיים כגון (47 דקות 2 שעות וצעד לילה, טבלת 1) המלחה את השיטה 10. היתרונות הנ"ל והדרישות מינימאליות מגיבות (3 ריאגנטים) בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הנוכחי (10 ריאגנטים, טבלת 1) 11,15, להפיק את פרוטוקול Chelex הפשוט ידידותי במיוחד למעבדות במדינה אנדמית בי מגיבה מתמדתשרשרת אספקה ​​היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה. מגבלה של השיטה היא שכמו הפרוטוקול הסטנדרטי, זה היה גם נושא למעכבי PCR הידועים להתרחש בintegument יתושי 16. עם זאת, זו היא קלה בקלות על ידי הוספה של BSA במבחנים. BSA גם הועסק בהצלחה כהגברה משפרת נגד מעכבים ביישומי PCR אחרים 17,18.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הם חבים לראשים, מוכתרים והקהילות של Macha לunwaveing ​​לשתף הפעולה במהלך אוספים לדוגמא שדה יתושים. ד"ר דאג נוריס ורבקה קנט הציע מומחיות רבה ערך על פרוטוקול ההמלחה החוצה. עבודה זו מומנה על ידי מערכת ג'ונס הופקינס מלרית מכון מחקר פיילוט המענק. סטנדרטי הטפיל DNA מעבדת יתושים ונתרמו באדיבות על ידי MR4 סוג, אמריקאי ואוספת תרבות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
Chelex-100, 50-100 רשת יבשה BioRad # 143-2832
Saponin SIGMA 142-7425
BSA ניו אינגלנד Biolabs B9001S

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54(2007).
  2. Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31(2008).
  3. Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
  4. Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254(2010).
  5. Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410(2009).
  6. Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
  7. Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
  8. Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401(2011).
  9. Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390(1989).
  10. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
  11. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
  12. Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
  13. Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
  14. Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
  15. Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
  16. Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
  17. Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
  18. Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA ChelexAnophelesDNAChelexPCR

מאמרים קשורים