מאמר שיטה

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

16.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3327

⸱

10 בנובמבר 2012

 ,  ,  ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Institute for Biomedical Aging Research, 2Department of Gerontology and Geriatrics, Netherlands Consortium for Healthy Aging, Leiden University Medical Center

במאמר זה

סיכום

שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.

תקציר

הפרוטאזום הוא אברון התאי העיקרי מעורב בפירוק החלבונים של חלבונים, לא תקינים, misfolded פגום או מתחמצנים 1, 2. תחזוקה של פעילות הפרוטאזום הייתה מעורבת בתהליכים תאיים חשובים רבים, כמו תגובתו של תא לחץ 3, רגולצית מחזור תא והתמיינות תאי 4 או בתגובה של מערכת חיסון 5. התפקוד הלקוי של מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום כבר קשור להתפתחות של גידולים ומחלות ניווניות 4, 6. בנוסף, ירידה בפעילות הפרוטאזום נמצאה כתכונה של הזדקנות תאית והאורגניזם 7 הזדקנות, 8, 9, 10. כאן, אנו מציגים שיטה למדידת פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים באמצעות חלבון היתוך GFP-DGN. כדי להיות מסוגלת לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים ראשוניים, הדנ"א משלים בונה מקודד חלבון היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) DGN-(GFP-DGN, לא יציב) וריאנט נושא מוטצית frameshift (GFP-dgnFS, 11 יציבים) מוכנסים בוקטורי הביטוי lentiviral. אנחנו מעדיפים טכניקה זו על טכניקות מסורתיות transfection כי זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלוי בסוג התא או גילו של התורם. ההבדל בין פלואורסצנטי מוצג על ידי GFP-dgnFS (יציב) החלבון והחלבון המעורער (GFP-DGN) בהעדר או הנוכחות של מעכבי הפרוטאזום ניתן להשתמש כדי להעריך את פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בכל מתח תא מסוים. הבדלים אלה יכולים להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ epifluorescence או ניתן למדוד על ידי cytometry זרימה.

פרוטוקול

1. בניית פלסמיד

  1. אוליגו-נוקלאוטידים סדר המותאם אישית לקידוד DGN (11 ACKNWFSSLSHFVIHL) ולdgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) ולקשור אותו לוקטור pEGFP-C1 להשיג היתוך של GFP עם DGN / dgnFS (איור 1).
  2. להגביר את רצף הקידוד לGFP-DGN וGFP-dgnFS באמצעות PCR בהתאם לפרוטוקול של קיט שיבוט topo יווני pENTR ולהמשיך בpLenti6/V5 topo שיבוט הקיט כיווני (איור 6).

2. ייצור וירוס

  1. היום לפני transfection (יום 1) זרע החוצה 293FT תאי HEK בתוך T75 צלוחיות, כך שהם יהיו confluent 90-95% ביום transfection.
  2. ביום transfection לדלל 36 μl של מגיב lipofectamine 2000 ב 1.5 מ"ל של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה ב15 מ"ל בז. השתמש 15 מ"ל בז אחר ולדלל 3 מיקרוגרם pLenti6/V5 נושא את הדנ"א המשלים לבנות לאו GFP -DGN או GFP-dgnFS, pMD2.G 2.5 מיקרוגרם מעטפת הקידוד פלסמיד ועמוד שדרת וקטור מיקרוגרם 7.5 psPAX2 ב1.5 מ"ל של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה. אחרי 5 דקות את ה-DNA המדולל משולב עם מגיב 2000 המדוללים lipofectamine.
  3. דגירה את התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר את מתחמי ה-DNA lipofectamine לטופס.
  4. הסר את המדיום של 293FT תאי HEK, להחליף אותו בזהירות על ידי 7 מ"ל של מדיום (ללא אנטיביוטיקה) ומוסיף את תערובת ה-DNA lipofectamine לבקבוק ורוקו הלוך ושוב לערבוב (יום 2). דגירת בקבוק הלילה על 37 מעלות צלזיוס בhumidified 5% CO 2 חממה.
  5. שינוי בינוני למחרת (10 מ"ל בינוני ללא אנטיביוטיקה; יום 3).
  6. לאחר 48 שעות (יום 5) הקציר supernatant, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולסנן את supernatant דרך 0.45 מיקרומטר PVDF מסנן.

תרבות בינונית - DMEM (HEK 293FT)

אוהל "> DMEM
10% FBS
0.1 המ"מ MEM NEAA
6 מ"מ L-גלוטמין
פירובט נתרן MEM 1 mM
1% עט דלקת (לא חובה)
500 מיקרוגרם / המ"ל Geneticin (אופציונלי)

3. ריכוז נגיף על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

  1. הוסף פתרון אחד נפח פוליאתילן גליקול (50 גליקול mM פוליאתילן, 41 המ"מ NaCl, חיטוי, pH = 7.2; PEG) ארבעה כרכים של supernatant ו הדגירה במשך 2 שעות ב 4 ° C. לערבב אותו בזהירות בכל 20-30 דקות על ידי היפוך.
  2. ספין למטה XG ב 1500 למשך 30 דקות ב 4 ° C. גלולה לבנה צריכה להיות גלויה.
  3. לשאוב supernatant וסרכזת שוב ב 1500 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב את פתרון PEG הנותר.
  4. Resuspend הגלולה במדיום או פוספט נאגר מלוח (PBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה ומערבולת נמרצת במשך 20 עד 30 שניות. כקו מנחה לשימוש 500 μl T75 בקבוק אחד וaliquot אותו ל 100 μl. אחסן את הווירוס ב-80 ° C.

= "Jove_title"> 4. Titering של וירוס

  1. זרעים מתוך 5 × 10 4 תאים U2-OS לכל אחד גם מצלחת 6-גם היום לפני transfection.
  2. ביום transfection להסיר את מדיום התרבות ולהחליפו ב1 מ"ל של DMEM המכיל 8 מיקרוגרם / המ"ל polybrene (hexadimethrine רומיד). דלל את הנגיף המרוכז supernatant 1:10 ו1:100 ולהוסיף כל μl 1 עד 1 היטב. לריכוזים גבוהים יותר וירוס להשתמש μl 1, 5 ו 10 μl μl של supernatant נגיף המרוכז לבארות שנותרו. אחד טוב שנשאר כביקורת חיובית.
  3. למחרת להחליף את המדיום של 2 מ"ל של DMEM.
  4. התחל עם הבחירה ביום למחרת. החל Blasticidin 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​על כל באר. החלף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה בכל יום שני.
  5. כ 6-7 ימים לאחר שהתחיל את בחירת תאי untransduced מתים. להכתמה לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולכסות את התאים עם קריסטל סגול (10 מ"ג / ליטר קריסטל סגולבאתנול 20%) ודגירה במשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר. Aspirate קריסטל הסגול (ניתן לעשות שימוש חוזר כמה פעמים) ולשטוף את בארות פעמים עם DDH 2 O ולייבש את הצלחת.
  6. ספירת המושבות ורבו עם 1000 והדילול המתאים (איור 7). הליך זה מאפשר לחשב יחידות transfection (TU) של הנגיף / המ"ל.

תרבות בינונית - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6 מ"מ L-גלוטמין
1% עט דלקת

5. תמרה של פיברובלסטים אנושיים דיפלואידיים (הליך זה יכול לשמש לכל סוג תא.)

  1. זרעים מתוך 5 × 10 4 fibroblasts אדם דיפלואידיים (HDFS) לצלחות 6-גם היום לפני התמרה.
  2. השתמש ריבוי של זיהום של שניים יחד עם מיקרוגרם 8 / polybrene מ"ל כתמרה משפרת בסך של מ"ל אחד.
  3. שינוי בינוני ביום למחרת.
  4. כאשרהתאים הם ב70-80% מתחילת confluency בחירה עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin. לאחר הבחירה הושלמה (אין תאי untransfected יותר למות) ההתרחבות של התאים יכולה להתחיל והתאים מוכנים לניסויים. בחירה כרונית עם blasticidin מאפשרת לייצר יציבות תא קו overexpressing GFP-DGN או היתוך חלבוני GFP-dgnFS, מוכנים למדידת פעילות הפרוטאזום. הליך זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלויה בסוג התא.

6. מדידה על ידי זרימת cytometry

  1. זרעים מתוך 1 × 10 5 תאים (ביצוע או GFP-DGN או GFP-dgnFS) היום לפני הניסוי.
  2. לטפל בתאי בקרה 3 שעות לפני המדידה עם מעכב הפרוטאזום, למשל 100 מק"ג / LLNL מ"ל.
  3. לשטוף פעמים עם PBS ולקצור את התאים באמצעות 0.5 מ"ל של טריפסין. כדי להפסיק להשתמש trypsinisation 4.5 מ"ל של מדיום התרבות ולהעביר את התאים ל15 מ"ל בז.
  4. ספין לאהוא תאים בטמפרטורה של 300 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. לשאוב את המדיום, resuspend תאים בPBS וספין למטה שוב ב 300 XG למשך 5 דקות בשעת 37 ° C.
  6. לשאוב PBS, resuspend ב400 μl של FACS חיץ (10 Hepes מ"מ, 140 המ"מ NaCl, 2.5 המ"מ CaCl 2, pH = 7.4) ולהעביר את התאים לתוך צינורות FACS.
  7. לשמור על התאים בדגימות קרח ולמדוד על ידי cytometry זרימה. התאים לא צריכים להיות מאוחסנים כבר מ 30 דקות ב 4 ° C.

7. נציג תוצאות

חלבון היתוך GFP-DGN נושא רצף שהוא ממוקד לפרוטאזום ולכן החלבון הוא מייד מושפל: היא מקבילה לירידה באות פלואורסצנציה GFP. Frameshift המוטציה (GFP-dgnFS) מבצעת גרסת מוטציה של הרצף הזה ולא מושפל על ידי הפרוטאזום, זה מוביל לפלואורסצנטי הירוק הגבוה יותר. מסיבות אלו, צעירים HDFS עם פעילות גבוהה הפרוטאזום צפוי וtransduced עם GFP-DGn להראות (6% תאים חיוביים) אות פלואורסצנציה נמוכה בשתי מדידות זרימת cytometry ובepifluorescence (איור 2 א 'וב', איור 3). אותו HDFS transduced עם GFP-dgnFS להציג 39.7% מתאים חיוביים. הטיפול בתאים עם המעכב LLNL הפרוטאזום (N-אצטיל-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) העלה את האות למקסימום של 62.9% בשניהם, GFP-DGN ותאי GFP-dgnFS (איור 2 א 'וב' ).

כדי לקבוע ירידה אפשרית בפעילות הפרוטאזום בדגימות עור אדם בגיל, עורי fibroblasts שבודד מתורמים צעירים, בגיל עמידה ומבוגרים היו נגוע בGFP-DGN וGFP-dgnFS, כפי שתואר לעיל, והוא גדל לאותו מספר מעבר לפני הניתוח על ידי זרימה cytometry. בניסויים אלה, עלייה מובהקת באות ה-GFP בין אנשים צעירים (11.2 ± 0.88% תאי GFP חיובי) ובגיל עמידת תורמים (20.4 ± 2.27% תאים GFP חיוביים, P = 0.003) נצפו, המציין ירידה בProteasפעילות Ome בדגימות שהתקבלו מתורמים בגיל 7 (איור 4). לא חל ירידה נוספת בפעילות הפרוטאזום נצפתה בפיברובלסטים שבודדו מאנשים ותיקים (איור 4). עוצמת קרינה לGFP-dgnFS הייתה בכל המקרים עד 90% (נתונים לא מוצגים) המצביעים על יעילות transfection גבוהה בשלוש קבוצות הגיל השונות.

איור 1
איור 1. רצף GFP-DGN וGFP-dgnFS. הוצג הוא בסופו של ה-GFP-3'(ירוק) באתר השיבוט המרובה של pEGFP-CL1 הווקטור (אפור) ורצף DGN / dgnFS (אדום).

איור 2
איור 2. ניתוח cytometry זרימה של ה-GFP-DGN ופיברובלסטים אנושיים דיפלואידיים GFP-dgnFS. א fibroblasts אדם הצעיר עורלה (HFF-2) היו נגוע בוקטורי lentiviral נושאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-DGN גן או GFP-dgnFS (frameshift) לבנות, כפי שצוין ונותח לGFP פלואורסצנטי באמצעות cytometry זרימה (FACS קנטו השני, הקיטון דיקינסון). איפה ציין, תאים טופלו גם ל3h עם מעכב הפרוטאזום N-אצטיל-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLNL). תאים נגועים שמשו כביקורת. ניסויים בוצעו בtriplicates. נתוני B. הם נציג של שלושה ניסויים עצמאיים. המספרים משקפים את כמות התאים חיוביים GFP. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. ניתוח פלואורסצנטי מיקרוסקופיה של ה-GFP-DGN וGFP-dgnFS HFF-2 תאים. צעיר HFF-2 היו כאל באיור 2. ב 9 ימים לאחר הדבקה, תאים היו visualized על ידי קרינה ומיקרוסקופ לעומת השלב.

איור 4
איור 4. שינויים בפעילות הפרוטאזום בהזדקנות עור אנושית., הפיברובלסטים עורלת האדם מתשעה תורמים שונים בקבוצות הגיל שצוינו הורחבו מינימאליים ונגועים במבני lentiviral קידוד עבור GFP-DGN. ב 9 ימים לאחר הדבקה, התאים נותחו על ידי cytometry זרימה. נתונים התקבלו על שלוש דגימות בכל קבוצת גיל בכפילויות (± SE).

איור 5
איור 5. גישה ניסויית. נוקלאוטידים מותאמים אישית-אוליגו לDGN וdgnFS המשובטים לתוך וקטור pEGFP-C1 ווירוסים מיוצרים עבור כל מבנה באמצעות 293FT תאי HEK. כייל של הווירוסים נקבע. תאי transduced עם הווירוס והתרחבו. לאחר הטיפול המועדף התאים מנותחיםלאות פלואורסצנציה ידי cytometry זרימה.

איור 6
איור 6. מפה של pLenti GFP-DGN. המפה של וקטור pLenti6/V5-DEST כוללים רצף GFP-DGN מוצגת. קיצורים: PCMV (אמרגן CMV), GFP-DGN (רצף של ה-GFP-DGN), P SV40 (SV40 אמרגן מוקדם), EM7 (EM7 אמרגן), Blasticidin (גן ההתנגדות Blasticidin), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR עם U3 אזור נמחק), SV40 הרשות הפלסטינית (SV40 אות polyadenylation), אמפיצילין (גן התנגדות אמפיצילין), PUC האורים (מקור PUC), PRSV / 5'LTR (אמרגן היברידי RSV / 5'LTR), Ψ (-HIV-1 אות אריזת Ψ ), RRE (אלמנט תגובת Rev-HIV-1).

איור 7
איור 7. צלחת U2-OS titering. U2-OS נזרעה על צלחת 6-היטב וtransfected עם ריכוזי וירוסים שונים (דילול של 1/100 ו1 / 10, 1, 5 ו 10 μl של שיתוףncentrated supernatant הנגיפי). אחד גם שמש כשליטת untransfected (NT). לאחר 6-7 ימים, התאים היו מוכתמים בקריסטל סגול ואוויר היבש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרסום הראשון באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמצע לפעילות כתב היוביקוויטין-הפרוטאזום פורסם בשנת 2000 12. מאז, GFP הפך לכלי נפוץ לדמיין פעילות הסלולר, במיוחד בתהליך היוביקוויטין-הפרוטאזום. כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום in vivo במודל עכבר מהונדס עם כתב ה-GFP מבוסס כבר הציג 13. נוסף במחקר vivo הוקם מודל עכבר מהונדס אחר בכתב degron-GFP מעורער דומה כמו בשימוש בפרסום 14 זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

מחקר זה מומן על ידי: רשת מחקר הלאומי להזדקנות (NFN S93) על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF), הנציבות האירופיות המשולב MiMAGE פרויקטים וPROTEOMAGE, הולנד ג'נומיקס יוזמה / ארגון הולנד למחקר מדעי (NGI / NWO; 05040202 ו050 - 060-810 NCHA), האיחוד האירופי במימון רשת של אקסלנס תוחלת חיים (FP6 036894), וחדשנות תכנית מוכוונת מחקר על ג'נומיקס (SenterNovem; IGE01014 וIGE5007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים
וקטור pEGFP-C1 BD Clontech Bioscience 6084-1
pENTR יווני topo שיבוט הקיט Invitrogen K2400-20
ערכת שיבוט topo יווני pLenti6/V5 Invitrogen V496-10
מגיב Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM סיגמא D5546
PVDF המסנן (Rotilabo-Spritzenfilter) רוט P667.1
פוליאתילן גליקול סיגמא P2139
NaCl מרק 1.06404.1000
פוספט של Dulbecco Buffered סאליne 1x (PBS) Invitrogen 14190
hexadimethrine רומיד סיגמא 10,768-9
Blasticidin Invitrogen R21001
קריסטל סגול סיגמא C3886
FACS צינורות BD Biosciences
סטרפטומיצין פניצילין (עט-דלקת) Invitrogen 15140130
L-גלוטמין 200 מ"מ Invitrogen 25030024
עוברי בסרום שור (FBS) Biochrom AG S0115
חומצות אמינו לא חיוניות ממ (NEAA) 100x Invitrogen 11140035
100 מ"מ פירובט נתרן MEM Invitrogen 11360039
D-(+)-גלוקוז (45%) סיגמא G8769
Geneticin Invitrogen 11811023
CaCl2 מרק C5080
Hepes סיגמא H3375
טריפסין-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300054

מקורות

  1. Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
  2. Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
  3. Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
  4. Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
  5. Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
  6. Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
  7. Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
  8. Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
  9. Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
  10. Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
  11. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  12. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  13. Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
  14. Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
  15. Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
  16. Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
  17. Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
  18. Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFP Dgn

מאמרים קשורים