Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Summary

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Abstract

וגינוזיס בקטריאלי (BV) היא תסמונת polymicrobial חוזרת מאופיין בשינוי החיידקים "נורמלי" של לקטובצילוס הנשלטת על החיידקים הנשלט על ידי מספר מינים חיידקי, כולל vaginalis Gardnerella, Atopobium vaginae ועוד ^1-3. מצב זה קשור עם מגוון של תוצאות בריאותיות שליליות, כולל איידס רכישת ^4, וזה יכול להיות קשה לנהל קלינית ^5. יתר על כן, האבחנה של BV הסתמכה על השימוש גראם כתמים של מריחות משטח וגינאלי, כי הם ציונים מספריים על קריטריונים שונים ^6,7. בעוד אבחון זה הוא פשוט, לא יקר, מתאים גם משאב מוגבל הגדרות, זה יכול סובלים מבעיות הקשורות פרשנויות סובייקטיביות זה לא נותן פרופיל מפורט של הרכב החיידקים הנרתיק ^8. מאמצים אחרונים רצף עמוק חשפו החיידקים עשיר, מגוון עם הנרתיקהבדלים ברורים בין דגימות שנלקחו מאנשים אשר מאובחנים עם BV לעומת אותם אנשים שנחשבים ^9,10 נורמלי, אשר הביאה לזיהוי של מספר יעדים פוטנציאליים לאבחון מולקולרי של BV ^11,12. מחקרים אלו סיפקו שפע של מידע שימושי, אבל רצף עמוק עדיין לא מעשית כשיטת אבחון בסביבה קלינית. תיארנו לאחרונה שיטה מהירה לאפיון החיידקים בנרתיק במתכונת זמנית באמצעות oligonucleotide מצמידים חרוזי ניאון עם זיהוי על פלטפורמה Luminex ^13. שיטה זו, כמו כתם הנוכחי מבוסס שיטות סבתא, היא מהירה ופשוטה אבל מוסיפה את יתרון נוסף של ניצול הידע המולקולרי הנובעים רצף לימודי עיצוב בדיקה. שיטה זו ולכן מספק דרך הפרופיל מיקרואורגניזמים העיקריים נמצאים מקלון הנרתיק שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן BV עם סגוליות גבוהה comp רגישותared כדי גראם כתם תוך מתן מידע נוסף על נוכחות מינים ושפע באופן חצי כמותי ומהיר. שיטה זו זמנית ניתן להרחבה גם מעבר לטווח של PCR כמותי מבחני הנוכחי של אורגניזמים מסוימים, אשר כרגע מוגבל ל 5 או 6 מבחני שונים יחיד מדגם ^14. חשוב לציין כי השיטה אינה מוגבלת לזיהוי דגימות של חיידקים בנרתיק ניתן להתאים בקלות במהירות פרופיל כמעט כל הקהילה מיקרוביאלי של עניין. לדוגמה, יש לנו לאחרונה החל ליישם מתודולוגיה לפיתוח של כלי אבחון לשימוש בצמחים וטיפול בשפכים.

Protocol

שיטה זו שימשה במחקר דיווחו Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

תרשים סכמטי המתאר את הליך הכולל מוצג באיור 1.

1. ביד צימוד

זה מתאר את שיטות לשמש צימוד בדיקות oligonucleotide כדי חרוזי פוליסטירן Luminex (ראה טבלה 2). כרכים מותאמים מעט על בסיס ניסיוני להערכת בדיקות ללכוד חדשים; כרכים אלה מסומנים בסוגריים.

Discussion

סגוליות של הדור אות היא בעלת חשיבות מכרעת, אתה חייב להיות בטוח כי האות שנצפה באמת משקף את הזיהוי של amplicon שנוצר אורגניזם הזה. תוכנות כגון PrimerPlex (פרמייר Biosoft) יכול לעזור לתכנן בדיקות אשר להכליא ביעילות, אבל הם עשויה או לא עשויה לחצות להכליא ליעד הלא מינים. כאשר אוניברסלי primers PCR משמשים כמתואר בפרוטוקול זה, חשוב לזכור כי amplicon שנוצר מייצג את כל האורגניזמים הנמצאים במדגם. חשוב, אפוא, לנתח את פוטנציאל בדיקות לאפשרות של הכלאה הנגדית על ידי השוואת רצפי הציע ידי תוכנת ע.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide שם	חברה	רצף 1
H279BP	Invitrogen, IDT, או אחרים	ביוטין-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		ביוטין-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1o, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A; אני, inosine; Y, C או T, R, A או G, K, G או T, S, C או G.

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
1-אתיל-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC)	לנקב	22980
קלקר חרוזים פלורסנט: MicroPlex microspheres (Luminex), או Bio-Plex COOH ביד (Bio-Rad)	Luminex או Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx כאשר xxx מקביל מזהה חרוז	חרוזים מגנטיים הופכים זמינים עבור צימוד oligonucleotide ועשויים להציע יתרונות מסוימים. לא נוסו על ידי המחברים האלה.
לכידת oligonucleotides (C12 אמינו 5 "שונה)	Invitrogen, IDT, או אחרים	שונים	רמת טוהר Desalted מקובל. רצפים של בדיקות ללכוד להשתמש לאפיין למשטח מהנרתיק ניתנים כתב היד שבו פרוטוקול זה מבוסס 13.
T7exonuclease	ניו אינגלנד Biolabs	M0263S
Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE)	Invitrogen	S-866	היזהר להשיג טוהר גבוהה SA-PE, זה מספר קטלוג מומלץ
Thermowell 96 גם צלחות PCR	דיג	CS006509	להשתלב thermocycler הן 96-היטב מכונת BioPlex
Thermowell איטום מחצלת	דיג	CS006555	ניתן שימוש חוזר, לשטוף עם מים וסבון, לשטוף היטב, יבש
5M TMAC	סיגמא	T3411
Bio-Plex או מכשיר Luminex	Bio-Rad או Luminex	Bio-Rad: 171-000201
PrimerPlex תוכנה לעיצוב בדיקה	פרמייר Biosoft	www.premierbiosoft.com	הצעות עבור Luminex בדיקה דהסימן, למרות פלטפורמות תוכנה אחרים עשויים לשמש

רכיב	μl / assay	מבחני μl/100	הריכוז הסופי
10x PCR חיץ (Invitrogen)	5	500	1x
50 מ"מ MgCl 2 (Invitrogen)	2.5	250	2.5 מ"מ
10 mM dNTP	1	100	0.2 מ"מ כל אחד
H279BP, 25 מיקרומטר	0.25	25	375 nM
H1612BP, 25 מיקרומטר	0.75	75	125 nM
H280, 25 מיקרומטר	0.25	25	375 nM
H1613,25 מיקרומטר	0.75	75	125 nM
מים	34	3400	---
סכומים	44.5	4450