תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Summary

Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile כי לשמור על חלבונים בממברנה (הפרלמנט) בתוך bilayer השומנים אבל יש שלב התנהגות ייחודית המאפשרת תפוקה גבוהה סינון על ידי רובוטים התגבשות. טכניקה זו ייצרה בהצלחה מספר ברזולוציה גבוהה מבנים משני מקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. וידאו זה מתאר פרוטוקולים ליצירת תערובת lipidic bicelle, המאגדת חברי פרלמנט לתוך התערובת bicelle, הקמת crystallizations ניסויים (באופן ידני, כמו גם רובוט) וקריסטלים קצירת מן המדיום.

Abstract

חלבונים ממברנה (MPS) לשחק תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים רבים כגון שאיבת מולקולות ספציפיות על פני קרום חדיר bilayer אחרת שמקיפה את כל התאים אברונים. שינויים בתפקוד של חברי פרלמנט תוצאה של מחלות אנושיות והפרעות רבים, ולכן הבנה מורכבת של המבנה שלהן נותר מטרה קריטית עבור מחקר ביולוגי. עם זאת, קביעת מבנה של חברי פרלמנט עדיין מהווה אתגר משמעותי הנובע לעתים קרובות hydrophobicity שלהם.

חברי פרלמנט יש אזורים הידרופובי משמעותי מוטבע בתוך bilayer. דטרגנטים משמשים לעיתים קרובות solubilize החלבונים האלה מן bilayer יצירת micelle אבקת חלבון כי אז יכול להיות מטופל בצורה דומה כמו חלבונים מסיסים. באופן מסורתי, ניסויים התגבשות להתקדם באמצעות תערובת חלבונים חומרי ניקוי, אבל לעתים קרובות הם להתנגד התגבשות או לייצר גבישים באיכות ירודה. בעיות אלה מתעוררות בשלחוסר היכולת של חומר ניקוי כראוי לחקות את bilayer וכתוצאה מכך יציבות ההטרוגניות עניים. בנוסף, מגן חומר ניקוי המשטח ההידרופובי של MP הקטנת שטח זמין עבור אנשי הקשר קריסטל. כדי לעקוף את חברי פרלמנט אלה חסרונות יכול להיות מגובשת בתקשורת lipidic, אשר באופן הדוק יותר המדמה סביבת אנדוגניים שלהם, הפך לאחרונה טכניקה דה נובו לגיבוש MP.

Lipidic שלב מעוקב (LCP) היא bilayer תלת ממדי השומנים חדרה על ידי מערכת של תעלות מחוברים מימית ^1. למרות monoolein הוא השומנים של בחירה, שומנים נלווים כגון monopalmitolein ו monovaccenin יש גם נהגה להכין LCP ^2. חברי פרלמנט ישולבו LCP שבו הם מפוזר בשלושה ממדים קריסטל גרעינים להאכיל. היתרון הגדול של LCP היא כי החלבון נשאר בסביבה יליד יותר, אבל השיטה יש מספר חסרונות טכניים כולל visc גבוהosity (הדורשים מנגנוני המקצועית) וקשיים להדמיה קריסטל מניפולציה ^3,4. בגלל קשיים טכניים אלה, אנו מנוצל אחר בינוני lipidic לגיבוש-bicelles ^5,6 (איור 1). Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile נוצר על ידי ערבוב השומנים phosphatidylcholine (DMPC) עם amphiphile (CHAPSO) או שומנים קצרות שרשרת (DHPC). בתוך כל דיסק bicelle, מולקולות הליפידים ליצור bilayer ואילו מולקולות קו amphiphile את הקצוות apolar מתן תכונות מועילות הן bilayers ודטרגנטים. חשוב לציין, מתחת לטמפרטורת המעבר שלהם, חלבונים bicelle תערובות יש צמיגות מופחתת הם מניפולציה באופן דומה כמו חומרי ניקוי, solubilized חברי פרלמנט, מה שהופך bicelles תואם רובוטים התגבשות.

Bicelles שימשו בהצלחה לגבש חלבונים בממברנה מספר ^5,7-11 (טבלה 1). אוסף זה גדלשל חלבונים ממחישה את הרבגוניות של bicelles על גיבוש שתי הסליל אלפא ביתא חברי פרלמנט גיליון ממקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. בגלל אלה ההצלחות ואת הפשטות של יישום תפוקה גבוהה, bicelles צריכה להיות חלק ארסנל כל חלבון בממברנה של crystallographer. בסרטון הזה, אנו מתארים את המתודולוגיה bicelle ולספק פרוטוקול צעד אחר צעד להקמת תפוקה גבוהה ניסויים התגבשות של חברי פרלמנט מטוהרים באמצעות רובוטיקה סטנדרטי.

Protocol

התגבשות Bicelle מבוסס מורכבת מארבעה שלבים בסיסיים (איור 2): א) הכנת השומנים bicelle להרכיב: תערובת amphiphile; ii) שילוב של חלבונים מטוהרים לתוך המדיום bicelle; iii) ניסויים התגבשות (ידני או רובוט); ו ד) , ויזואליזציה קריסטל מיצוי והקפאה. צעדים אלו מתוארים בפירוט בהמשך

1. הכנת Bicelles

Bicelles יכולים ליצור מגוון רחב של שומנים בדם: שילובים amphiphile ועל פני טווח רחב של ריכוזים. לפיכך, הרכב מבוסס ראשוני מוצלח על התנאים הקודמים, מומלץ (טבלה 1). השילוב המוצלח ביותר הוא DMPC: CHAPSO ניסוח bicelle, אשר יכול לרכוש מסחרית כמו ניסוח מוכן לשימוש מעורבבים מראש (ראה טבלה של ריאגנטים להלן) או הכינו במעבדה כמתואר. עבור התרגיל הזה נכין 1 מ"ל של DMPC 35%: תערובת CHAPSO ביחס טוחנת 2.8:1.

2. אחוז bicelle יכול להשתנות בין 10% -40% עם DMPC: יחס טוחנת CHAPSO החל 2.6-3.0:1 (טבלה 1).
3. הערה: ככל ריכוז bicelle קשה יותר לפרק את השומנים וכתוצאה מכך צמיגות פתרון גבוה יותר. עם זאת, ניסוח מרוכז bicelle יכול להיות יתרון כאשר ריכוז החלבון נמוכה.
4. המסת שומנים להשיג פתרון הומוגני דורשת מאמץ ניכר, מה שהופך את הצעד הזה זמן רב ביותר בשיטת bicelle. מעבר בין השלבים הבאים עד DMPC הוא מעורב לחלוטין:
   1. לחמם את התערובת ל ~ 40 ° C בעזרת אמבט מים או באינקובטור ו מערבולת דקה 1 ~.
      • הערה: מחזורי יותר מתבצעות, מחמם את התערובת תגרום קון ג'ל דמויsistency ולכן קשה מערבולת.
   2. מצננים את התערובת על הקרח מערבולת במשך כמה דקות. קירור עוזר לנזל את הפתרון מה שמקל מערבולת.
      • הערה: מחזורי יותר מבוצעות, התערובת עלולה להיות מעונן בקירור.
   3. חזור על השלבים המפורטים לעיל (1.2.1 ו 1.2.2) עד השומנים הוא נמס לגמרי.
      • הערה: תהליך זה עשוי להימשך מספר שעות. היווצרות Bicelle מותווה על ידי שינויים בהתנהגות שלב של DMPC: ניסוח CHAPSO. בסיום, התערובת תהיה ברורה ג'ל או מעל בטמפרטורת החדר נוזל צמיג על הקרח.
5. תערובת bicelle עכשיו הוא מוכן לשימוש, ניתן לשמור ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך (עד 5 שנים). בשל הסיכון של הידרוליזה של קבוצת ראש פוספוליפידים, זה לא מומלץ לאחסן bicelles בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים.

2. התאגדות של החלבון לתוך bicelles

מבנים MP רוב המתקבלים bicelles היו התגבשו DMPC: CHAPSO bicelle ריכוז החל% 2-8 באמצעות ריכוז חלבון של 8-12 מ"ג / מ"ל (טבלה 1). אם אפשר, מסכי הראשוני צריך להשתמש ההנחיות ריכוזי נוסף יכול להיות מוקרן בשלב אופטימיזציה. לעומת שיטת LCP, שילוב חלבון עם bicelles הוא תהליך פשוט (איור 3), אשר צריכה להיעשות באותו יום כמו ניסויים התגבשות.

1. ההפשרה DMPC: CHAPSO תערובת bicelle בטמפרטורת החדר עד כדי לשלב את השינויים ג'ל ברורה.
   • הערה: מרובות להקפיא מפשיר לא ישפיע על התנהגות bicelle.
2. מניחים את התערובת על קרח Liquify ו מערבולת בקצרה לחדש שלב הומוגניות bicelle. כאשר הניח על הקרח התערובת עלולה להיות מעונן.
3. Frאום נקודה זו על, לשמור את התערובת bicelle וטיהר חלבון על הקרח. זה ישמור על bicelle בשלב נוזל שהופך אותו מקובל pipetting.
4. מוסיפים את תערובת bicelle לחלבון אבקת-solubilized מטוהרים ביחס 1:04 (V / V).
   • לדוגמה: 100 μl תערובת חלבונים bicelle מתקבלת על ידי ערבוב 80 μl עם חלבון bicelle 20 μl. אם ריכוז החלבון היא 15 מ"ג / מ"ל ​​ו - ריכוז bicelle הוא 35%, זה ייתן תערובת bicelle-שולבו חלבון עם ריכוז חלבון של 12 מ"ג / מ"ל ​​ו - ריכוז bicelle של 7%.
5. מערבבים בעדינות על ידי pipetting את התוכן למעלה ולמטה עד הפתרון הופך ברור הומוגנית.
   • הערה: אם מופיעות בועות, סיבוב מהיר (30-60 שניות, 13,000 סל"ד, 4 ° C) עם צנטריפוגה השולחן יכול לעזור להסיר אותם.
6. דגירה את התערובת על קרח דק לפחות 30 כדי לקדם את שילוב מלא של int חלבוןo bicelles. תערובת חלבונים bicelle עכשיו הוא מוכן לניסויים התגבשות.

3. הגדרת ניסויים התגבשות

אחרים התגבשות שומנים טכניקות כמו LCP דורשים ציוד מיוחד בשל צמיגות גבוהה של המדיום, אבל את ההתנהגות הייחודית של שלב bicelles היתרי הביצוע בכל פורמט כמעט התגבשות סטנדרטי כולל רובוטיקה (איור 3). ניסויים התגבשות יכול להתבצע באחת תלויים או יושבים פורמטים ירידה באמצעות מסכי זמינים מסחרית רגילה.

1. אם הגדרת מגשים באופן ידני או באמצעות רובוט התגבשות, לשמור על תערובת חלבון bicelle על הקרח. זה ישמור על קור חלבון bicelle תערובת ולהבטיח את הצמיגות של הפתרון הוא מינימלי.
2. ניסויים התגבשות ידני - בעזרת פיפטה רגיל, תערובת חלבונים bicelle ניתן לערבב עם פתרון המאגר באופן זהה בדרך כלל לבצעעורך עבור חלבונים בממברנה מסיסים או חומר ניקוי, solubilized.
   • הערה: שמור את תערובת חלבונים bicelle על הקרח במהלך הניסויים.
3. ניסויים התגבשות רובוטית - יש לנו המותאמים ניסויים אלה עבור הרובוט התגבשות יתוש, אבל באופן עקרוני (להלן אמצעי הזהירות זהה) הטכניקה צריך להיות תואם את כל הרובוטים התגבשות. הטיפים הבאים יבטיחו את תערובת חלבונים bicelle נשאר קריר pipetted במדויק על ידי הרובוט:
   1. Precool את הצלחת להחזיק את תערובת חלבונים bicelle ידי הצבתו על הקרח.
   2. פיפטה את תערובת חלבונים bicelle לתוך הצלחת להמשיך לשמור את הצלחת על קרח. צלחת זו צריכה להיות הפריט האחרון ללכת על הרובוט לפני תחילת הריצה.
   3. הקמה מגש המאגר ומכסים התגבשות על פלטפורמת 3 ו -5 בהתאמה, של הרובוט יתושים.
   4. מניחים את צלחת המכילה חלבונים bicelle התערובת על פלטפורמת 4של הרובוט יתושים. זה מבטיח את תערובת חלבונים bicelle הוא האחרון להיות נטל על ידי הרובוט והוא שוחרר מיד.
   5. כדי למנוע חימום צמיגות מוגברת, אין לערבב את המאגר עם תערובת חלבונים bicelle.
   6. בעת ביצוע מסכים מרובים, מיד להחזיר את צלחת bicelle-חלבון קרח לקירור בהקדם ריצה הושלמה.
4. נפח Drop יחס (חלבון: המאגר) יכול להיות נבחר לניסויים התגבשות קונבנציונאלי. לדוגמה, בניסויים גביש ראשוני באמצעות רובוט יתוש ניתן להגדיר באמצעות חלבון 0.25 μl: תערובת bicelle פלוס 0.25 המאגר μl.
5. דגירה הניסויים קריסטל בתא ב 20 ° C. טמפרטורה היא ההקרנה טוב פרמטר אופטימיזציה בגלל התנהגות שלב bicelles תלוי בטמפרטורה.
   • טמפרטורות גבוהות להשרות את השלב lamellar ¹² (איור 1), אשר יש את היתרון של טרום בארגוןהחלבון בשכבות. הטמפרטורות מתחת ל -20 ° C יכול להיות מוקרן, אבל אתה לא צריך ללכת מתחת ל -4 מעלות צלזיוס מאז זה עלול לגרום שומנים כדי לזרז על פרקי זמן ארוכים.
6. באותו אופן כמו ניסויים התגבשות מסורתית, ניסויים bicelle יש לעקוב על בסיס קבוע עבור הופעה צמיחה קריסטל. אנו ממליצים לבדוק את מגשי ^ב -1 ו -3 ביום ^השלישי שלאחר ההתקנה ולאחריו בדיקה שבועית.
7. אופטימיזציה קריסטל יכול להתבצע באמצעות שיטות בשימוש שגרתי עבור גבישים אבקת מבוסס כולל הקרנת לרשת, סינון כתוסף, שינוי וכו 'טמפרטורות בנוסף, אחוז bicelle וחלבון: יחס bicelle יכולים להיות מגוונים. יתר על כן, bicelles יכול להיות מסוממים עם שומנים ספציפי עשוי להיות נחוץ ליציבות החלבון או לתפקד.

4. , ויזואליזציה קריסטל מיצוי והקפאה

מאז ניסויים קריסטל עם תערובת חלבונים bicelle יש צמיגות דומה אבקת חלבון טיפות, להדמיה מיצוי קריסטל היא שגרתית מתבצעת כמו בחר קופצים המסורתית.

1. ויזואליזציה: בניגוד לתקשורת LCP כי לעתים קרובות מחייב באיכות גבוהה תאורה תחת אור מקוטב נורמלי לגילוי גביש, ויזואליזציה לא הפריע bicelles. צבעוני כמו גם צבע קריסטל טיפות חלבון ניתן לנתח בקלות באמצעות מיקרוסקופ רגיל לא נדרש ציוד מיוחד.
2. Bicelles, כמו התקשורת lipidic אחרים, נוטים לייצר אחוז גבוה של תוצאות חיוביות שגויות. במיקרוסקופ UV מאוד עוזר להבדיל חלבון מן גבישי מלח (איור 4).
3. Extraction ואת הקפאת: מיצוי מקפיא קריסטל היא פשוטה יחסית ואינה דורשת פירוק של התקשורת bicelle שמסביב. בנוסף, בשלב bicelle עצמו מספק כמה מתון cryo-הגנה.

5. נציג תוצאות:

nt "> זה בדרך כלל נדרשים 2-3 ימים גבישים להופיע כשבוע או יותר להם לגדול לגודל המקסימלי שלהם. זה היה המקרה עבור bacteriorhodopsin ועכבר מתח תלויי אניון ערוץ 1 (mVDAC1) גבישים ^4,8 . עבור חלבונים בממברנה אחרים זה יכול לקחת מספר שבועות הצמיחה קריסטל, ולכן חשוב להמשיך ולעקוב אחר ניסויים גביש הרבה מעבר בשבועות הראשונים.

כמו עם המדיה lipidic אחרים, bicelles נוטים ליצור צורות עשוי להיראות גבישי. הוכח גם ציין כי הם להוביל אחוז גבוה יותר של מלח גבישי חומר ניקוי. UV-מיקרוסקופ פלואורסצנטי המאתר טריפטופן יכול משמעותית לסייע במיגור כאלה שאינם proteinaceous חיוביות שגויות. איור 4 מראה צורות שומנים, מלח גבישי חלבון הנצפים כמו האור הנראה UV כדי לעזור להבחין בין תוצאות שונות שניתן לצפות.

83fig1.jpg "/>
באיור 1. Bicelle סכמטי. Bicelles מורכבים מולקולה bilayer להרכיב שומנים כגון DMPC (כחול) amphiphile כגון CHAPSO (ירוק), המגנה את הקצוות של bilayer הידרופובי. כאשר הטמפרטורה עולה, דיסק כמו bicelles לעבור שינוי פאזה לתוך ¹² גיליונות מחורר lamellar.

באיור 2. תרשים זרימה של השיטה התגבשות bicelle מתאר את ארבעת השלבים הבסיסיים.

באיור 3. הניסויים קריסטל הגדרת סכמטית. מטוהרים אבקת-solubilized חלבונים בממברנה יכול להיות מעורב באופן ישיר, פשוט על ידי pipetting את התוכן יחד עם bicelles על הקרח. לאחר דוגרים את תערובת חלבון / bicelle על קרח ~ 30 דקות, ניסויים התגבשותניתן להגדיר באמצעות כל פורמט סטנדרטי כולל רובוטיקה.

איור 4. ויזואליזציה של ניסויים קריסטל. תמונה גלויה (הפאנל העליון) ואת התמונה UV (הפאנל התחתון) של (A) מחט בצורת גבישים נצפו במצב מלח בלבד. הקרינה לא ניתן להבחין בין הגבישים, סימן חיובי כוזב. (ב) רוד בצורת גביש נוצר מצב MPD. גביש fluoresced חלושות אך נמצאה בלתי proteinaceous באמצעות קרני רנטגן עקיפה. (ג) קריסטל נצפתה כארבעה שבועות לאחר הגדרת ניסויים. הקרינה חזקה תחת אור UV מאשר זה גביש החלבון.

לא.	חלבון	מקור	Bicelle גיבוש	Concentrati חלבוןעל	דטרגנט 1	החלטה (א)	הפניה
1	Bacteriorhodopsin 2	Halobacterium salinarum	8% DMPC: CHAPSO (2.8:1)	8 מ"ג / מ"ל		2.0	Faham ואת בואי, 2002
			8% DTPC: CHAPSO (03:01)	8 מ"ג / מ"ל		1.8	Faham et al. 2005
2	β2-adrenergic קולטן / מורכבים Fab	הומו ספיינס	8.3% DMPC: CHAPSO (03:01)	10 מ"ג / מ"ל	DDM	3.4/3.7	רסמוסן et al. 2007
3	מתח תלויי אניון ערוץ 1	Mus שריר	7% DMPC: CHAPSO (2.8:1)	12 מ"ג / מ"ל	LDAO	2.3	Ujwal et al. 2008
4	Xanthorhodopsin	Salinibacter ruber	4.2% DMPC, NM 5%	4 מ"ג / מ"ל	DDM	1.9	Luecke et al. 2009
5	מעוין פרוטאז	Escherichia coli	2% DMPC: CHAPSO (2.6:1)	9 מ"ג / מ"ל	Nonyl glucoside	1.7	Vinothkumar, 2011

1 דטרגנט המשמש לטיהור חלבון ממברנה
2 שומנים מן הילידים ממברנות סגול יכול להיות נישא במהלך טיהור

טבלה 1. סיכום התנאים התגבשות של מבנים חלבוניים בממברנה לפתור באמצעות bicelles.

Discussion

Bicelles הם מדיה lipidic ייחודי מציעים סביבת יליד bilayer כמו בעוד מתנהג כאילו solubilized ידי דטרגנטים. מאפיין זה נותן bicelles יתרון בולט על פני השומנים מבוסס שיטות אחרות התגבשות שכן אין עקומת למידה או ציוד מיוחד נדרש עבור טכניקה זו. לאחר bicelles זמינים, או מסחרי או מוכן במעבדה, הם יכולים להיות מעורבים ישירות עם מטוהרים חלבון מנקודה זו ואילך ניסויים התגבשות להמשיך כמעט בדיוק כמו עם פרוטוקולים סטנדרטיים מבוססי חומר ניקוי. יתר על כן, bicelles להציע יתרונות מעשיים מספר לעומת טכניק...