ביצים ציפוי תאית סביב ביצים לעתים קרובות שחרור פפטידים, חלבונים ומולקולות קטנות אשר לתקשר עם זרע כדי להנחות אותם אל הביצה ובכך לקדם את ההפריה. שימוש בזרע צפרדע אנו מתארים ולהשוות שני מעמדות של מבחני לשמש כדי לזהות chemoattraction זרע - הצטברות זרע מבחני ומעקב מבחני הזרע.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע
במאמר זה
סיכום
תקציר
Chemoattraction זרע חסרי חוליות יכולים להיות חזקים מספיק שאפשר במקום טפטפת המכיל את פפטיד אטרקטיבי לתוך ההשעיה זרע מיקרוסקופית לדמיין הצטברות זרע סביב פיפטה 1. Chemoattraction זרע בעלי חוליות כגון צפרדעים, מכרסמים ובני אדם קשה יותר לזהות דורש מבחני כמותי. מבחני אלה שני סוגים עיקריים - מבחני כי לכמת תנועה זרע למקור של chemoattractant, שנקרא הצטברות מבחני זרע, מבחני שבעצם המסלול מסלולי השחייה של זרע בודדים.
הצטברות מבחני זרע עשרות המאפשר מהיר יחסית או מאות מבחני להיעשות ביום אחד, ובכך לאפשר תגובה מינון עקומות וקורסים זמן להתבצע במהירות יחסית. אלו סוגים של מבחני נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין רבים מערכות chemoattraction מבוססת היטב - לדוגמה, chemotaxis נויטרופילים כדי BACפפטידים terial ו chemotaxis זרע בנוזל הזקיקים. מעקב מבחני זרע יכול להיות עבודה יותר אינטנסיבית אבל להציע נתונים נוספים על אופן chemoattractancts למעשה לשנות את נתיבי שחייה לקחת זרע. סוג זה של assay יש צורך להוכיח את הכיוון של תנועת הזרע יחסית לציר שיפוע chemoattrractant וכדי להמחיש פונה מאפיין או שינויים בכיוון זה להביא את הזרע קרוב יותר אל הביצית.
כאן אנו מתארים את השיטות של כל אחד אלה שני סוגים של מבחני. הצטברות זרע assay מנוצל נקרא "שתי קאמרית" assay. זרע דוחי ממוקמים להכניס תרבות צלחת רקמה עם רצפת פוליקרבונט בעל מסנן בקוטר 12 מיקרומטר הנקבוביות. הוספת עם זרע ממוקמים בתוך התרבות רקמות בארות צלחת ובה חיץ chemoatttractant pipetted בזהירות לתוך קרקעית הבאר שבו הרצפה פוגש את הקיר (ראו איור. 1). לאחר דגירה, להכניס העליון המכיל את מאגר הזרע בזהירות removed, והזרע בתא התחתון שעברו דרך הממברנה מוסרים, pelleted וספר מכן על ידי hemocytometer או cytometer לזרום.
Assay מעקב זרע מנצל קאמרית Zigmond שפותחה במקור עבור התבוננות chemotaxis נויטרופילים ואת שונה להסתכלות על ידי הזרע של Giojalas ועמיתים לעבודה 2,3. תא מורכב שקופית זכוכית עבה שלתוכו שתי שקתות אנכי כבר במכונה. אלה מופרדים באמצעות פלטפורמה 1 תצפית רחב מ"מ. לאחר היישום של זרע זכוכית, מכסים נטענים לתוך השוקת אחד, סוכן chemoattractant לתוך השני התנועה של הזרע במיקרוסקופ על ידי הפרט דמיינו וידאו. קטעי וידאו מנותח ולאחר מכן באמצעות תוכנה לזיהוי דו מימדי תנועות תא במישור xy כפונקציה של זמן (xyt ערכות נתונים) היוצרות את המסלול של כל הזרע.
פרוטוקול
1. חומרים המשמשים מאגרים
- מאגר Ringer של הביצית (1.5 x OR2) מכיל 124 mM NaCl, KCl mM 3.75, 1.5 mM CaCl 2, 1.5 מ"מ MgCl 2, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 10 Hepes מ"מ, pH 7.8. מאגר הפריה (F-1) מכיל 41.25 mM NaCl, KCl mM 1.25, 0.25 mM CaCl 2, 0.06 mM MgCl 2, 0.5 mM Na 2 HPO 4, 2.5 Hepes מ"מ, pH 7.8.
- Xenopus מים laevis ביצה מוכנה פי סוגיאמה et al. 4. תיאר בקצרה, הוליד טרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Chemotaxis של תאים על ידי העברת תנועה או amoeboid או שוטונים המופעל השחייה נמצא בהקשרים ביולוגיים רבים במחקר של תופעה זו מחייבת את הזמינות של מבחני מעשי ואמין. כמה דוגמאות של התופעה, כגון משיכה של זרע ביצה קיפודי ים או כינוס של תאים עובש רפש להקים גוף הפרי, יש השפעה ויזואלית מיידית. Quantitation של תופעה זו בוצעה במגוון דרכים כפי שתואר על ידי אייזנבך 18. מבחני אלו כוללים שימוש chemoattractant מלא נימים למשוך הזרע, שימוש נימים שהצטרף מאגרי כדי ליצור שיפוע ושימוש תא Makle.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים מעבדה קק WM bioimaging לשימוש של וידאו תחנת העבודה שלהם במיקרוסקופ. מחקר זה נתמך על ידי NSF מענק IBN-0615435.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם פריט | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| 24 גם צלחות | בקטון, דיקנסון | 35/1147 | |
| 12 מ"מ קוטר מוסיף החיצוני עם קרום 12 מיקרומטר נקבוביות | Millipore | PIXP01250 | השתמשנו בעבר שחקן המשנה, קורנינג צלחת transwell # 3403, כעת הופסק |
| Zigmond קאמרית | Neuroprobe | Z02 | |
| שמן סיליקון | ג'נרל אלקטריק | SF1154 | שווה נוזלים דאו קורנינג 550 |
| תמונה J תוכנה | וויין Rasband, שירותי מחקר ענף, המכון הלאומי לבריאות הנפש | הורדה חינם ב http://rsbweb.nih.gov/ij | Java התוכנית פועלת על Windows, ליןUX ו-Mac |
| MtrackJ תוכנה | אריק Meijering / Imagescience / ביו קבוצה דימות , Erasmus MC - מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת רוטרדם | הורדה חינם ב http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | תוכנית Java שפועל על Windows, Linux ו-Mac |
| תוכנת Virtual Dub | GNU General Licensed אישי תוכנה | הורדה חינם דרך http://www.virtualdub.org/index.html | הוראות ההתקנה באתר תמונה J תחת plugins; עבור Windows בלבד |
| cellSens תוכנה | אולימפוס | ראה אתר: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp? מוצר = 1070 | בקרות רוכש תמונות ממגוון רחב של מצלמות. יש גם יכולת עיבוד תמונה |
מקורות
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
