בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

סיכום

ציטומטריית זרימה היא כלי רב עוצמה המאפשר בידוד ומחקר של אוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מתאר שלבים לבידוד תאים המבטאים LacZ מרקמות שבלול מעכברים טרנסגניים יילודים. תאי שבלול מנותקים סומנו באמצעות מצעים מצומדים פלואורסצנטיים של β-גלקטוזידאז לפני ההפרדה באמצעות ציטומטריית זרימה.

תקציר

בידוד של סוגי תאים ספציפיים מאפשר לנתח אוכלוסיות תאים נדירות כגון תאי גזע/אב. גישה כזו לחקר רקמות האוזן הפנימית מהווה אתגר ייחודי בגלל מיעוט התאים המעניינים ומעט מודלים של עכברים מדווחים טרנסגניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בבדיקות מצומדות פלואורסצנטיות כדי לתייג באופן סלקטיבי תאים חיוביים ל-LacZ מהשבלול היילודים.

הפתולוגיה הבסיסית הנפוצה ביותר של ליקוי שמיעה תחושתי-עצבי היא נזק בלתי הפיך ואובדן של תאי שיער חושיים שבלוליים, הנדרשים להתמרת גלי קול לדחפים עצביים. עדויות עדכניות מצביעות על כך שאיברי השמיעה והווסטיבולרי של העכברים מכילים תאי גזע/אב שעשויים להיות בעלי פוטנציאל התחדשות^1,2. ממצאים אלה מצדיקים חקירה נוספת, כולל זיהוי סוגי תאים ספציפיים עם מאפיינים של תאי גזע/אב. מסלול האיתות Wnt הוכח כממלא תפקיד קריטי בשמירה על אוכלוסיות תאי גזע/אב במספר מערכות איברים^3-7. לאחרונה זיהינו תאים המבטאים Axin2 המגיבים ל-Wnt בשבלול היילוד, אך תפקודם אינו ידוע ברובו⁸.

כדי להבין טוב יותר את ההתנהגות של תאים אלה המגיבים ל-Wnt במבחנה, פיתחנו שיטה לבידוד תאים המבטאים Axin2 משבלול של עכברים מדווחים Axin2-LacZ⁹. באמצעות זרימה ציטומטרית לבידוד תאים חיוביים Axin2-LacZ מהשבלול היילודים, יכולנו בתורנו לבצע מגוון ניסויים על תאים חיים כדי לחקור את התנהגותם כתאי גזע/אב. כאן, אנו מתארים בפירוט את השלבים למיקרו-דיסקציה של שבלול יילודים, דיסוציאציה של רקמות אלה, תיוג התאים החיוביים ל-LacZ באמצעות מצע פלואורוגני ומיון תאים. טכניקות לפירוק שבלול לתאים בודדים ובידוד תאי שבלול באמצעות זרימה ציטומטרית תוארו^2,10-12. ביצענו שינויים בטכניקות אלה כדי לבסס פרוטוקול חדש לבידוד תאים המבטאים LacZ מהשבלול היילוד.

פרוטוקול

1. מיקרו-דיסקציה של השבלול

1. הכן מיקרוסקופ חיתוך מתחת למכסה המנוע על ידי ניגוב משטחים עם 70% אתנול והצבת גושי קרח.
2. הכינו 10-15 צלחות פטרי 35 מ"מ בתנאי סטרילי ומלאו חצי הדרך (~2 מ"ל) בתמיסת מלח מאוזנת סטרילית של האנק עם סידן (HBSS).
3. הכינו שתי צלחות פטרי 35 מ"מ בתנאי סטרילי ומלאו באמצע הדרך (~2 מ"ל) בתמיסה סטרילית של פוספט 1x (PBS).
4. יש לעקר מיקרו-מלקחיים בשפופרת פלקון חרוטית בנפח 50 מ"ל עם 70% אתנול.
5. בחדר נפרד מהמכסה המנוע הסטרילי, השתמש במספריים לקשתית כדי לערוף את ראשיהם של 12-15 עכברי כתב Axin2^LacZ/+ בני 0-3 ימים לאחר הלידה (P) ולהניח ראשים על צלחת פטרי 60 מ"מ על גוש קרח.
6. בעזרת מלקחיים #5 דומונט ומספריים לקשתית, כורתים את הלסת התחתונה והלשון וחותכים את בסיס הגולגולת בגובה החיך.
7. הסר את העור שמעל הקלווריה וחצה את בסיס הגולגולת על ידי החדרת המספריים בחלק התחתון של הפורמן מגנום לאמצע החיך.
8. בצע חתך נוסף עם מספריים לקשתית מהקצה החתוך של החך להיבט העליון של הקלווריה משני הצדדים, והקפיד לא לפגוע בקפסולה האוטית.
9. בידוד מוחלט של העצם הטמפורלית על ידי ביצוע שני חתכים בזווית של 45 מעלות החל מההיבט העליון של הנקב מגנום המשתרע עד לחתך העטרה בחיך הקשה.
10. מניחים עצמות זמניות מבודדות בצלחות פטרי 35 מ"מ המכילות HBSS על גוש קרח.
11. אוספים עצמות זמניות מכ-12-15 בעלי חיים שהוקרבו, בסך הכל 24-30 עצמות זמניות.
12. העבירו צלחת פטרי עם עצמות זמניות מבודדות למכסה המנוע הסטרילי שהוכן בעבר (1.1).
13. מעבירים ארבע עצמות זמניות לכל צלחת פטרי 35 מ"מ שהוכנה מראש המכילה HBSS (1.2) ומניחים על גוש קרח.
14. התחל מיקרודיסקציה באמצעות שני מלקחיים #55 כדי להסיר בעדינות את קליפת המוח, גזע המוח והמוח הקטן בעצם הטמפורלית המכסה את הקפסולה האוטית.
15. מבלי להסיר את הקפסולה האוטית, יש להתרחק מחלקים של קפסולת השבלול החל מהכניסה של העצב הווסטיבולוקוכלארי לתוך הקפסולה האוטית.
16. לאחר חשיפת בסיס השבלול, משוך בעדינות החוצה את השבלול והרקמות שמסביב. הסר את כל הגנגליון הספירלי שנותר ואת כלי הדם של הסטריה החל מהבסיס.
17. מעבירים את השבלול לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה PBS על גוש קרח.
18. לכדאיות אופטימלית של הרקמה, זמן החיתוך הכולל צריך להיות פחות מ-60 דקות.
19. חזור על השלבים לעיל עבור 3-5 עכברי P0-P3 מסוג פרא (WT) כבקרות עבור עכברי Axin2-LacZ.

2. דיסוציאציה של תאים (שונה מהשיטות שתוארו קודם לכן)^2,10

1. מניחים 50 מיקרוליטר PBS סטרילי במרכז באר בצלחת תרבות לא מצופה עם 6 בארות.
2. העבירו עד 20 שבלול Axin2^LacZ/+ לכל טיפה של 50 מיקרוליטר של PBS. יש להשתמש בטיפה חדשה של 50 מיקרוליטר של PBS ליותר מ-20 שבלולים.
3. יש לחמם מראש 50 מיקרוליטר של 0.125% טריפסין למשך ~2 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
4. הוסף 50 מיקרוליטר של 0.125% טריפסין שחומם מראש ל-PBS המכיל את השבלול.
5. מניחים צלחת 6 בארות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, מקפידים לא לנער את המנה.
6. כדי לסיים את הטריפסיניזציה, הוסף 50 מיקרוליטר של מעכב טריפסין פולי סויה לכל טיפה של 100 מיקרוליטר.
7. הוסף 50 μl נוספים של מדיה מלאה (FM) (IGF-1 , EGF , bFGF , HS , אמפיצילין ב-DMEM/F12)²
8. בעזרת קצה פיפטה קהה של 300 מיקרוליטר עם פיפטמן p200 המוגדר ב-125 מיקרוליטר, יש לשלש בעדינות תאים 80 פעמים, תוך הקפדה לא ליצור בועות.
9. לאחר טריטורציה של כל טיפה, הוסף עוד 200 מיקרוליטר FM לכל באר.
10. העבירו תאים דרך מסננת תאי פלקון כחולה של 40 מיקרומטר לבאר חדשה.
11. העבר תאים לצינורות Falcon FACS סטנדרטיים (נשאר כ-300 מיקרוליטר לאחר טריטורציה וסינון).
    1. פיצול תאים משבלול בר לשלושה צינורות, דילול של 100 מיקרוליטר עם 300 מיקרוליטר FM בכל צינור. שפופרת אחת תשמש כבקרה ריקה, אחת תהיה מוכתמת בפרופידיום יודיד (PI, 1 מיקרוגרם/מ"ל) בלבד (לא להוסיף בשלב זה), ואילו האחרונה תיכתם ב-3-carboxyumbelliferyl β-D-galactopyranoside (CUG, ראה 2.15) כדי לזהות פלואורסצנטיות ברקע.
    2. הנח 400 מיקרוליטר של תאים מנותקים משבלול Axin2-LacZ בכל צינור FACS. כבקרת CUG בלבד, יש לדלל 10 מיקרוליטר של תאים ב-390 מיקרוליטר FM (ראה צינור F בשלב 2.15). הביאו את הנפח של כל הצינורות שנותרו ל-400 מיקרוליטר.
12. דגרו תאים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
13. הכן תמיסת CUG:
    1. הכן 200 מיקרוליטר של CUG עבור כל צינור FACS הדורש צביעה.
    2. דילול CUG ב-FM 1:50 במכסה מנוע כהה עם חשיפה מינימלית לאור.
    3. יש לחמם מראש את ה-CUG המדולל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
14. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של CUG מדולל לכל צינור FACS מתאים. עבור צינורות שאינם מיועדים ל-CUG, הוסף FM בלבד (ראה 2.15).
15. בשלב זה, צריכות להיות חמש קטגוריות של צינורות עם התוכן הבא (אל תוסיף PI בשלב זה):
    1. Wildtype - ללא CUG או PI (לפיצוי, ראה שלב 3.5-6)
    2. Wildtype - עם PI בלבד (לפיצוי)
    3. Wildtype - עם CUG ו-PI (לבקרה מול תאי Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - עם CUG בלבד (לפיצוי)
    5. Axin2-LacZ - עם CUG ו-PI (למיון תאים בפועל)
    6. Axin2-LacZ - עם CUG ו-PI (לניתוח אירועים)
16. הגן על כל הצינורות מפני אור ודגר אותם בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות.
17. הכן תמיסת HEPES + סרום בקר עוברי (FBS) טרייה לעצירת התגובה לאחר הדגירה:
    1. יש לדלל 400 מיקרוליטר של FBS שזה עתה הופשר ב-10 מ"ל של HEPES סטרילי של 10 מ"מ (ב-PBS) בשפופרת פלקון של 15 מ"ל.
    2. יש להניח את השפופרת על הקרח עד להשלמת 2.16.
18. הוסף 1.8 מ"ל של תמיסת HEPES קרה כקרח לכל צינור FACS מתחת למכסה מנוע סטרילי עם אורות כבויים כדי למזער את החשיפה לאור.
19. תאי צנטריפוגה ב-1200 סל"ד למשך 5 דקות.
20. הסר תאים סופרנטנטים והשעיה מחדש ב-300 מיקרוליטר FM, אסוף את כל ה-aliquots עבור דגימת המיון (Axin2-LacZ מוכתם ב-CUG ו-PI).
21. הוסף PI לכל שפופרת כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
22. הניחו תאים על קרח והגנו מפני אור.

3. ציטומטריית זרימה

1. אנו משתמשים ב-BD Aria II המצויד בלייזרים של 488 ננומטר, 633 ננומטר ו-407 ננומטר. זיהוי CUG נעשה באמצעות לייזר סגול 407 ננומטר ו-PI באמצעות לייזר כחול 488 ננומטר במתקן FACS המשותף של סטנפורד.
2. נדרש מפעיל ציטומטר זרימה מיומן. המשך לשלב הבא לאחר חימום הלייזרים, כיול גלאי הציטומטר באמצעות הוראות היצרן והגדרת פרמטרי מיון אופטימליים. מניסיוננו, מצאנו שהשימוש בזרבובית של 100 מיקרומטר מייעל את כדאיות התא לניסויים הבאים.
3. נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: סף ב-5,000 אירועים, קצב זרימה פחות מ-3,000 אירועים לשנייה, פיזור קדימה (FSC) ב-125 וולט ופיזור צד (SSC) ב-250 וולט, ערוץ PE-Cy5 שימש עבור PI ו-Cascade Blue עבור CUG.
4. שטוף תא ציטומטר עם 70% אתנול ו- PBS פעמיים כל אחד בסדר זה.
5. התחל בניתוח עם תאים לא מוכתמים ופראיים (צינור A בשלב 2.15). אסוף 1,000 אירועים כדי לקבוע את התפלגות התאים בעלילת FSC לעומת SSC. אם אין צורך בפיזור, התאם את פרמטרי FSC ו- SSC.
6. בצע פיצוי באמצעות תאי WT (שפופרת A), WT מוכתמים PI (שפופרת B) ותאי Axin2-LacZ (שפופרת D) מוכתמים ב-CUG. פיצוי יאפשר הבחנה מדויקת יותר של אותות בין אורכי הגל השונים של הלייזר.
7. התחל ניתוח עם תאים מוכתמים PI ו-CUG מסוג בר (צינור C) והגדר פרמטרי שער עבור:
   1. אי הכללת פסולת על סמך חלקת FSC לעומת SSC.
   2. אי הכללה של כפולות וגושים באמצעות תרשים גובה FSC לעומת שטח FSC.
   3. אי הכללת תאים מתים על סמך אזור FSC לעומת חלקת אזור PE-Cy5.
   4. הגדר עלילה של אזור FSC לעומת אזור כחול מפל עם כל מיקום שער.
8. לאחר מכן, נתח 10,000 אירועים מצינור דגימה ממיון המכיל תאים מוכתמים Axin2-LacZ PI ו-CUG (צינור F).
   1. יש להחיל כאן את כל השערים שהוגדרו באמצעות תאים wildtype.
   2. באמצעות תרשימים עבור תאים מסוג בר, צור שערים עבור תאים גבוהים של Cascade Blue שהם פחות מ-1% ממספר האירועים הכולל.
   3. אותם שערים של Cascade Blue-high מקיפים כעת כ-15-20% מהתאים בדגימת Axin2-LacZ, מה שהופך את התאים הגבוהים הללו ל-Axin2.
   4. באמצעות תרשים הניתוח של תאי Axin2-LacZ, צור שער עבור 15-20% מהתאים הכי פחות פלואורוגניים, ומכאן ואילך תאים נמוכים Axin2.
9. בהתבסס על אסטרטגיית השער שהוזכרה לעיל, מיין תאים לצינורות FACS המכילים 500 מיקרוליטר FM, צינור אחד לתאים גבוהים של Axin2 והשני לתאים נמוכים של Axin2. ודא שצינורות האיסוף נמצאים בתא מקורר ל-4 מעלות צלזיוס במהלך המיון.
10. רשום מספר תאים שנספר לפי ציטומטר זרימה עבור כל אוכלוסייה.

4. תוצאות מייצגות (ראה איור 2):

עם הפרוטוקול לעיל, אנו בדרך כלל משחזרים 40-45% תאים נטולי פסולת הן מהשבלול הפראי והן משבלול Axin2^LacZ/+ (איורים 2A ו-B), כאשר כ-70% מהם נקיים מכפילים (ראו איורים 2A' ו-B). רוב התאים הממוינים הם ברי קיימא ולא קלטו PI (~95%) (איורים 2A' ו-B'). בממוצע, התאים החיוביים ל-CUG ~20% העליונים נחשבים לתאים חיוביים ל-Axin2-LacZ (איור 2B''') ומתאמים לכ-15,000 תאים גבוהים של Axin2-LacZ לכל 10-12 חיות.

ניתוח מיון מחדש של ציטומטריית זרימה של תאים גבוהים Axin2 חשף טוהר גדול מ-93% בערוץ Cascade Blue. על מנת לאשר עוד יותר את זהותם של תאים אלה, ביצענו צביעה חיסונית לאחר המיון של תאים גבוהים של Axin2 ו-Axin2-low באמצעות נוגדנים נגד β-גלקטוזידאז, ומצאנו כי התאים הגבוהים של Axin2 הכילו ~93.4% תאים חיוביים ל-β-galactosidase (יותר מ-1,500 תאים שנותחו) וכי תאים נמוכים של Axin2 הכילו ~4.8% תאים חיוביים ל-β-galactosidase.

איורים וטבלאות:

איור 1.פרדיגמה ניסויית. האיור לעיל מתאר את האסטרטגיה והטכניקות הניסיוניות הכוללות כפי שתוארו בסעיף הפרוטוקול. שבלול מעכברי Wildtype ו-Axin2^LacZ/+ נקצרים ומפורקים לתאים בודדים, שטופלו לאחר מכן ב-CUG, מצע פלואורסצנטי ל-β-galactosidase. לאחר מכן הופרדו תאים גבוהים ו-נמוכים של Axin2-LacZ באמצעות ציטומטריית זרימה. לחץ כאן לצפייה בגרסה בגודל מלא של תמונה זו.

איור 2.אסטרטגיות שער. איור זה ממחיש את אסטרטגיות שער הזרימה הציטומטריות בהן נעשה שימוש. ת) תאי פרא מנותקים שעברו את אותו טיפול כמו תאי Axin2-LacZ מנותחים כאן באמצעות סך של 10,000 אירועים. הפאנל הראשון מדגים את אזור הפיזור הצדדי (SSC-A) לעומת אזור הפיזור הקדמי (FSC-A). כאן, קבוצה מובחנת של אירועים היא בגודל גדול בהרבה מאותם אירועים הקרובים יותר לציר ה-y. אירועים אלה מוגדרים כ"פסולת שלילית". השער הבא, A', מנתח את תאי "פסולת שלילית" מפאנל A, שהם 43.8% ממספר האירועים הכולל (ראה טבלה למטה). בפאנל זה, גובה הפיזור קדימה (FSC-H) לעומת ה-FSC-A משמש כדי לא לכלול כפולות. אירועים החורגים מהאופי הליניארי הצפוי של העלילה אינם נכללים. תכשיר זה מניב בדרך כלל ~70% אירועים בתוך השער המיועד, והתאים הנותרים אינם נכללים. בפאנל A', פרופידיום יודיד (PI) כפי שזוהה על ידי ערוץ PE-Cy5, משמש לסימון תאים מתים (5.3%). בפאנל הבא (A'''), הערוץ הכחול Cascade משמש לזיהוי המצע הפלואורסצנטי CUG. כאן, השערים הגבוהים של LacZ כוללים פחות מ-1% מכלל האירועים. ב) תאים מנותקים מעכברי Axin2-LacZ שטופלו ב-CUG ו-PI מנותחים כאן באמצעות סך של 10,000 אירועים. שערים זהים מפאנל A מוחלים כאן. B' מראה ש-29.5% מהתאים אינם נכללים ככפולים ואילו B' מדגים ש-5.4% אינם ברי קיימא. השערים הראשוניים עבור תאים LacZ-high ו--low משורטטים באמצעות לוח B''' כאשר LacZ-high מוגדר בתחילה על 19.7% ו-LacZ-low על 20.4%. לחץ כאן לצפייה בגרסה בגודל מלא של תמונה זו.

<גבול טבלה="1">     מספר אירוע אחוז א ניתוח Wildtype 10,000   א' פסולת שלילית 4,381 43.80% א'' כפל שלילי 3,116 71.10% א''' PI שלילי 2,951 94.70%   LacZ גבוה 16 0.54%   LacZ-נמוך 2,790 94.50% ב ניתוח Axin2-LacZ 10,000   ב' פסולת שלילית 4,218 42.2% ב'' כפל שלילי 2,973 70.50% ב''' PI שלילי 2,813 94.6%   LacZ גבוה 553 19.70%   LacZ-נמוך 573 20.40%

טבלה 1. ניתוחים כמותיים של אסטרטגיות שער באיור 2.

דיון

מחקרים עצמאיים אפיינו יכולת התחדשות מוגבלת בתוך שבלול היילודים^2,10,12,13. באמצעות עכברים מדווחים GFP וציטומטריית זרימה, ווייט ועמיתיו בודדו תאים תומכי שבלול ספציפיים ומצאו שיש להם מאפיינים של תאי אב¹².

מסלול Wnt הקנוני הוכח כמסמן אוכלוסיות תאי גזע/אב במערכות איברים מרובות כולל המוח, בלוטת החלב, המערכת ההמטופויאטית, העור וקריפטות המעיים של מערכת העיכול. עבודה אחרונה מצאה איתות Wnt פעיל באוכלוסיית תאים מאופיינת בצורה גרועה בשבלול היילודים⁸. עכבר הדיווח Axin2-LacZ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת פטרי, פוליסטירן, סטרילי Geriner Bio-one 35 x 10 מ"מ	VWR international	82050-540
BD מסנני תאי בז, סטרילי, BD Biosciences, כחול, 40 μ m	VWR international	21008-949
Hanks' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS). תמיסה עם סידן, מגנזיום, וללא פנול אדום, סטרילי	VWR international	45000-456
צינורות צנטריפוגה של Cellstar, פוליפרופילן, סטרילי, גריינר ביו-וואן, 50 מ"ל	VWR international	82050-346
צנטריפוגה של Cellstar, פוליפרופילן, סטרילי, גריינר ביו-וואן, 15 מ"ל	VWR international	82050-278
B-27 תוסף תזונה ללא סרום (50x), נוזל	Invitrogen	17504-044
N-2 תוסף תזונה (100x), נוזל	Invitrogen	17502-048
bFGF, גורם גדילה פיברובלסטי-בסיסי אנושי	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, גורם גדילה דמוי אינסולין-1 מעכבר	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, גורם גדילה אפידרמיס אנושי	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני/חזיר' s F-12 50/50 מיקס: 1X, עם L-גלוטמין ו-15 מ"מ HEPES	VWR international	45000-350
BD צינורות תחתונים עגולים, חד פעמי, פוליסטירן, 12x75	VWR בינלאומי	60819-295
טריפסין, 0.25% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל	Invitrogen	25200-056
ep טיפים לפילטר כפול 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
מעכב טריפסין, פולי סויה, מטוהרים Worthington	ביוכימיה	LS003570
BD מסנני תאים Falcon 40um	BD Biosciences	21008-949
צלחות Multiwell, פוליסטירן, גריינר ביו-וואן, צלחות לא מטופלות, 6 בארות	VWR בינלאומי	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ ערכת זיהוי בטא-גלקטוזידאז	Marker Gene Technologies	M0255