מאמר שיטה

הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

19.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3452

⸱

6 בינואר 2012

 ,  , 
1Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 2Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת culturing תא אוטומטי עם דימות גבוהה תוכן כדי לחזות ולכמת תהליכים תאיים רבים ומבנים, באופן תפוקה גבוהה. שיטות כאלה יכולות לסייע ביאור תפקודית נוספת של הגנום, כמו גם לזהות את הגן למחלה רשתות מטרות סמים פוטנציאליים.

תקציר

הערכה תפקודית (functional annotation) של גנומים, בנייה של רשתות מולקולריות וזיהוי מטרות תרופתיות חדשות, הם אתגרים חשובים הדורשים מענה דחוף1-4. גישות 'אומיקה' (omics) משלימות מרובות סיפקו רמזים לגבי גורמי סיכון גנטיים ומנגנונים פתוגניים העומדים בבסיסן של מחלות נוירודגנרטיביות רבות, אך רוב הממצאים עדיין דורשים תיקוף תפקודי5. לדוגמה, מחקר קישור גנומי רחב (GWAS) שנערך לאחרונה עבור מחלת פרקינסון (PD), זיהה לוקוסים חדשים רבים כגורמי סיכון למחלה, אך הווריאנט (או הווריאנטים) הגורם הבסיסי או המנגנון הפתוגני אינם ידועים6, 7. מאחר שכל אזור מקושר עשוי להכיל מספר גנים, הערכה תפקודית של כל אחד מהגנים על פנוטיפים הקשורים למחלה, תוך שימוש בטכניקות מסורתיות של ביולוגיה של התא, תארך זמן רב מדי.

קיימים גם צרכים להבנת הרשתות המולקולריות הקושרות מוטציות גנטיות לפנוטיפים שהן גורמות להם. הצפי הוא שפנוטיפים של מחלות הם תוצאה של מספר אינטראקציות שהופרו. שחזור של רשתות אלו באמצעות שיטות מולקולריות מסורתיות יהיה תהליך ארך וממושך. יתרה מכך, תחזיות של רשתות המבוססות על מחקרים עצמאיים של רכיבים בודדים, גישת הרדוקציוניזם, יעריכו ככל הנראה בחסר את מורכבות הרשת8. הערכה חסרה זו עשויה להסביר, בחלקה, את שיעור ההצלחה הנמוך של אישור תרופות בשל תופעות לוואי לא רצויות או רעילות. השגת פרספקטיבה רשתית של מסלולים הקשורים למחלה באמצעות גישות סריקה תאית בשיטות HT/HC, וזיהוי צמתים מרכזיים במסלולים אלו, עשויים להוביל לזיהוי מטרות המתאימות יותר להתערבות טיפולית.

סריקה ברגישות גבוהה (HTS) היא מתודולוגיה אידיאלית לטיפול בסוגיות אלו9-12, אך שיטות מסורתיות היו בדיקות תאים בבאר שלמה במימד אחד, אשר השתמשו במדדים פשוטים לתהליכים ביולוגיים מורכבים. הן לא היו מסוגלות לכמת בו-זמנית את הפנוטיפים הרבים הנצפים במחלות נוירודגנרטיביות, כגון ליקויים בהובלה אקסונלית או שינויים בתכונות מורפולוגיות13, 14. גישה זו לא יכלה לשמש לחקר הטבע הדינמי של תהליכים תאיים או אירועים פתוגניים המתרחשים בתת-אוכלוסייה של תאים. כדי לכמת מאפיינים כאלה, יש לעבור לפנוטיפים רב-מימדיים המכונה סריקה בעלת תוכן גבוה (HCS)4, 15-17. HCS היא כימות מבוסס-תאים של מספר תהליכים בו-זמנית, המספק ייצוג מפורט יותר של התגובה התאית להפרעות שונות בהשוואה ל-HTS.

ל-HCS יש יתרונות רבים על פני HTS18, 19, אך ביצוע סריקת תוצריות גבוהה (HT)-תוכן גבוה (HC) במודלים עצביים הוא בעייתי בשל עלות גבוהה, שונות סביבתית וטעויות אנושיות. כדי לזהות תגובות תאיות במقياس של 'פנומיקה' באמצעות דימוי HC, יש להפחית את השונות והטעויות, תוך הגברת הרגישות וההדירות.

כאן אנו מתארים שיטה לביצוע מדויק ואמין של סריקות shRNA באמצעות תרבית תאים אוטומטית20 והדמיית HC במודלים תאיים עצביים. אנו מתארים כיצד השתמשנו במתודולוגיה זו כדי לזהות מווסתים עבור חלבון ספציפי, DJ1, אשר מוטציה בו גורמת למחלת פרקינסון אוטוסומלית רצסיבית21.

על ידי שילוב הרב-גוניות של דימות HC עם שיטות HT, ניתן לכמת במדויק מגוון רחב של פנוטיפים. ניתן יהיה להשתמש בכך בהמשך כדי להוסיף להבנתנו את הגנום, את המסלולים המעורבים בפתוגנזה של מחלות, וכן כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

פרוטוקול

1. תרבות אוטומטי חסיד תא התהליך (איור 1) 20

  1. הכן את המערכת האוטומטית תרבית תאים עבור קלט של צלחות תרבית תאים. טען מתכלים (כגון: טיפים פיפטה, תרבות צלחות התא, צלחות assay) לתוך המערכת באמצעות ממשק המשתמש הגרפי (GUI). ודא שיש מספיק בתרבות התקשורת הסלולרי, פוספט בופר סליין (PBS) וכן טריפסין במערכת רובוטית.
  2. ידנית two זרע omnitray צלחות עם 2 x 10 6 תאים לכל צלחת, של קו SH-SY5Y תא נוירובלסטומה. שמרו על התאים Opti-ממ עם סרום 10% שור עוברית (FBS). שים את הצלחות לתוך הרובוט הנייד תרבות באמצעות GUI. התאים יהיה מודגרות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
  3. בחירת תא פרוטוקול תרבות צריך להיות יזם 20. אפשר לבחור מתוך תהליך התרבות חסיד תא 22, culturing והרחבת גזע עובריים (ES) מזין תאים תאים העכבר או 23 culturing ההשעיה cells 22.
  4. בחר את התא חסיד התרבות פרוטוקול (איור 1) ולהבטיח חסיד קו תא קבצים ספציפיים פרמטר מותאמים כך את הסף מפגש (אזור הצלחת omnitray המכילה תאים) מוגדר על 70%. הגדרת זמן trypsinization הכולל שתי דקות.
  5. הדריכו את הרובוט כדי להכין צלחות omnitray החדש, עם מספר זריעת תאים של 2 x 10 6 תאים לכל צלחת.
  6. Omnitray קלט צלחות למערכת התא התרבות באמצעות תרבות אוטומטיות חסיד תא פרוטוקול (איור 1). פרוטוקול זה כולל את השלבים הבאים: צלחות מודגרת הדמיה עד שהם מגיעים לסף מוגדרים מראש מפגש. אם התאים אינם מגיעים לסף מפגש בתוך 5 קריאות, צלחות יוסרו מהמערכת. לאחר שהגיע לסף מפגש המוגדרים על ידי המשתמש, תאים נשטפים, trypsinized וספר. מספר מוגדר מראש של תאים מתווספים צלחות omnitray חדש ואם יש מספר מספיק של תאים, תחושה שצויןאה צלחות assay מועברים הסיפון מספר מוגדר של תאים לוותר לבאר כל אחד. צלחות Assay ניתן הדמיה ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלט משולב או ממערכת לעיבוד נוסף.
  7. הדריכו את המערכת להכין 4 צלחות assay לכל צלחת omnitray, עם סך של 5,000 תאים לכל טוב.

2. shRNA הייצור וירוס ציפוי לתוך צלחות assay (הזמן הנדרש: 6 ימים)

  1. לגדול מניות גליצרול בקטריאלי המכיל וקטורים shRNA (פתח Biosystems, TRC1) לילה 2ml של לוריא-Bertani התקשורת בינוני המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ampicilin (Sigma-Aldrich).
  2. חלץ פלסמידים הבאים פרוטוקול של היצרן (Promega אשף MagneSil Tfx).
  3. תוצרת וירוס באמצעות קונסורציום RNAi תפוקה גבוהה הפקה lentiviral (96 צלחת יפה) פרוטוקול 24. עבודה עם lentivirus הוא בטוח יחסית מפני הווירוס החלקיקים המשמשים התמרה הם השכפול לקוי מפוצלאריזה אסטרטגיות הגן משמשים הייצור שלהם. עם זאת, כאשר עובדים עם lentivirus, נהלים נוספים biosafety נחוצים כדי למזער את הסיכון לעצמו ולאחרים 25. כל הניסויים חייבים להתנהל מעבדה MLII או BSL2 רמת הבטיחות. כל פלסטיק (טפטפות, צלחות פלסטיק, התקשורת) כי היה במגע עם חלקיקים lentivirus צריך להיות מודגרות עם אקונומיקה למשך 24 שעות לפני סילוק.
  4. חישוב ריבוי זיהום (משרד הפנים) של lentivirus על ידי קביעת אחוז התאים ה-GFP חיובי באמצעות GFP pLKO.1 פלסמיד (Sigma-Aldrich).
  5. פלייט lentivirus לתוך צלחות assay, עם משרד הפנים של 3.

3. התמרה lentiviral והבחנה עצבית של SH-SY5Y תאים (זמן נדרש: 6 ימים)

  1. תאים מתווספים צלחות assay (ראה שלב 1.7). טען צלחות assay המכיל lentivirus shRNA לתוך מערכת תא אוטומטיות תרבות.
  2. לאחר 24 שעות, התקשורת עלצלחות assay ישתנו Opti-ממ המכיל 0.5% FBS ו 0.1 החומצה הרטינואית מיקרומטר כדי להתחיל את תהליך הבידול. דיפרנציאציה של SH-SY5Y תאים מאפשר הדמיה של מבנים מדלקת עצבים ומסנכרן חלוקת התא.
  3. המשך דגירה של צלחות assay בתקשורת בידול במשך 5 ימים. זה מבטיח מציאה מקסימלי של ביטוי גנים היעד.
  4. ביום 5, להוסיף 50 מיקרומטר H 2 O 2 למחצית צלחות assay למשך 24 שעות כדי לעורר טרנסלוקציה של DJ1 אל המיטוכונדריה.
  5. ביום 6, להוסיף CmxROS Mitotracker (Invitrogen) אל התאים, בריכוז הסופי של 200 ננומטר לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  6. אפשר להנחות את המערכת צלחות התמונה ישירות באמצעות imager HC או צלחות ניתן לייצא מהמערכת לעיבוד נוסף.

4. Immunostaining אוטומטי של לוחיות assay (הזמן הנדרש: 2 ימים)

איכות התמונה היא paramount לניהול HCS רגיש ואמין. נזק monolayer הסלולר בשל pipetting מדויק יכול להוביל איכות התמונה ירודה תוצאות irreproducible. כדי למזער את שכבת נזק לתאים, immunostaining נערך באמצעות תחנת רובוטית. הליך זה דומה לזה אשר תוארה קודם לכן 26 אך הותאם אישית כדי להגדיל את התפוקה ולצמצם את השימוש מתכלים.

  1. תקן תאים עם μl 100 paraformaldehyde של 4% טרום חימם עד 37 ° C. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
  3. דגירה צלחות assay עם 200 μl של PBS המכיל טריטון 0.1% (PBST) במשך 10 דקות.
  4. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
  5. דגירה צלחות assay עם 200 μl של חיץ לחסום (PBST עם 5% FBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  6. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
  7. דגירה עם follנוגדנים העיקרי בשל לילה ב 4 ° C:
    1. עיזים DJ1 N20 (סנטה קרוז, 5 מיקרוגרם / מ"ל)
    2. Β-III הארנב טובולין (Sigma-Aldrich, 1 מיקרוגרם / מ"ל)
  8. למחרת, לשטוף תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
  9. דגירה צלחות assay עם שעה לאחר 1 נוגדנים משני בטמפרטורת החדר:
    1. AlexaFluor 488 חמור נגד עז (Invitrogen, 2 מיקרוגרם / מ"ל)
    2. AlexaFluor 647 עיזים נגד ארנב (Invitrogen, 2 מיקרוגרם / מ"ל
  10. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
  11. תאים דגירה עם Hoechst (Invitrogen; 1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 10 דקות.
  12. שטפו תאים עם 200 PBS μl במשך 5 דקות, 3 פעמים.
  13. צלחות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם יכולים להיות הדמיה.

5. תוכן תמונה גבוהה ניתוח הרכישה התמונה (הזמן הנדרש: 5 ימים)

  1. תמונה כוללת של 30 שדות לכל גם באמצעות עדשה 20x אובייקטיביות. דמיינו DJ1 עם FITC להגדיר מסנן, המיטוכונדריה עם להגדיר את מסנן TRITC, β-III טובולין עם סט Cy5 המסנן את הגרעינים באמצעות מערכת סינון UV (איור 3).
  2. לנתח את התמונות באמצעות Bioapplication ניתוח Compartmental (Cellomics, ThermoFisher) כדי לקבוע את עוצמת הממוצע של האות Mitotracker בתוך המיטוכונדריה. (איור 4B, F).
  3. כדי לקבוע את החפיפה הממוצע בין מקדם DJ1 ואת המיטוכונדריה, לנתח את התמונות באמצעות bioapplication Colocalisation Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). הגדרת אזורים של עניין (ROI) כדלקמן: ההחזר על ההשקעה - גרעין (איור 4 א, ה), ההחזר על ההשקעה ב - המיטוכונדריה (איור 4 ב ', ו). תכלול את ההחזר על ההשקעה ROI של B כדי להבטיח ניתוח של הציטופלסמה בלבד. מגדירים את המיטוכונדריה כאזור היעד ואני DJ1 כמטרה באזור II (איור 4C, G).
  4. לנתח את התמונות באמצעות bioapplication פרופיל עצבי (Cellomics, Thermofisher) לאתר את אורכי הממוצע של neurites מן מכתים β-III טובולין (איור4D, ח).
  5. תמונה צלחות באמצעות LX האופרה אוטומטיות confocal הקורא (פרקין אלמר-). תמונה כוללת של 30 שדות לכל גם באמצעות העדשה אובייקטיבי 60x עם טבילה במים. דמיינו המיטוכונדריה עם לייזר 561 ננומטר גרעינים עם עירור UV.
  6. לנתח את התמונות באמצעות Spot-Edge-Ridge (SER) תכונות אלגוריתם מרקם. SER-Ridge מסנן מעביר עוצמת בפיקסלים להרכיב הרכס כמו דפוסים. מקוטעת יותר המיטוכונדריה, ככל שהציון גבוה יותר SER-Ridge (איור 8).

6. נתונים נורמליזציה ניתוח

  1. ייבוא ​​נתונים מתוך התוכנה ניתוח התמונה לתוך החבילה BioConductor CellHTS2 לסביבה תוכנה R (R גרסה 2.11.1, הגירסה BioConductor 2.6).
  2. בסיס לוגריתם (2) להמיר את הנתונים לפני נורמליזציה לכל צלחת החציוני מבוסס 27, 28. אין ליישם את ההתאמה השונות לכל צלחת.
  3. כדי לזהות מכפילי של פנוטיפ, השתמש ANOVA שני בדרך בין different קבוצות הטיפול כלומר מקושקשות בתאים שלא טופלו נגועים לעומת מקושקשות תאים שטופלו נגד הרעלן הגן היעד בתאים שלא טופלו מול גן היעד תאים שטופלו (איורים 5-7).

7. נציג תוצאות

מוטציות בתוך DJ1 להצמיח מוקדם התפרצות-רצסיבי פרקינסון 21, אך לא ברור איך אובדן DJ1 מעורר פנוטיפ המחלה. ידוע כי התאים לקוי של DJ1 רגישים יותר מוות שנגרמו עקב מתח חמצוני התא בתגובה סטרס חמצוני, DJ1 translocates מן הציטופלסמה של המיטוכונדריה 29, 30. על ידי בניית מבחני בג"צ לפקח פנוטיפים אלה, אנו יכולים לזהות גנים המווסתים או להשפיע על פנוטיפים הקשורים DJ1. גישה זו יכולה לעזור לפענח את המסלולים שבתוכה DJ1 פונקציות וזה יכול להיות מעורב בהיווצרות המחלה.

דוגמה של אינטראקציה עם epistatic DJ1 (איור 5): מציאה של DJ1 בתאים שנחשפותוצאות רעלן לאובדן גדול יותר של כדאיות התא (BAR-B: image-B), לעומת תאים נגועים עם מקושקשות lentivirus (בר: image-A). מציאה של גן המטרה יש השפעה דומה לזו שנצפתה תאים עם מציאה DJ1 (BAR-C: image-C). מציאה של DJ1 וגם גן היעד התוצאות הפסד גדול משמעותית של כדאיות התא מאשר אובדן של גן אחד בלבד (BAR-D: image-D). הדבר מצביע על אינטראקציה בין epistatic DJ1 היעד גנים א

דוגמה של גן ויסות DJ1 טרנסלוקציה (איור 6): כאשר תאים נחשפים רעלן, DJ1 translocates מן הציטופלסמה של המיטוכונדריה, אשר לכמת במקדם חפיפה גבוהה בין DJ1 ואת בר המיטוכונדריה (: תמונה לעומת BAR-C: תמונה ג'). בתאים שבהם הגן B היעד הושתק, פחות DJ1 translocates את המיטוכונדריה כאשר תאים נחשפים הרעלן. הדבר מצביע על כך הגן B היעד הוא מעורב להובלת DJ1 אל המיטוכונדריה. (BAR-B: תמונה B ו-BAR-D: D תמונה)

דוגמה של גן מעורב תולדה העצבית (איור 7): מציאה של C היעד גנים בר SH-SY5Y סוג התוצאות תאים לגידול משמעותי באורך neurite (BAR-B: image-B), לעומת תאים נגועים עם lentivirus להביע מקושקשות shRNA (בר: תמונה א '). אפקט זה הוא איבד בתאים מודגרות עם רעלן (BAR-C ו-D).

דוגמה של גן מעורב מורפולוגיה המיטוכונדריה (איור 8): זיהום של בר SH-SY5Y תאים סוג עם shRNA גן מיקוד תוצאות D לירידה בשווי SER-Ridge המיטוכונדריה פילוח (איור 8, תמונה C ו-D), כאשר בהשוואה ל תאים נגועים עם מקושקשות lentivirus (איור 8, תמונה A ו-B).

איור 1.
איור 1 מתאר פרוטוקול תא אוטומטיות תרבות.:

ntent "> איור 2.
איור 2 סקירה סכמטי של תהליך המיון, ניתוח התמונה שיטות סטטיסטיות נעשה שימוש במהלך תהליך המיון:. I) הם תאים בתרבית עד שהם ומחוברות ו מצופה לאחר מכן לתוך צלחות assay המכיל את lentivirus shRNA. תאים הם מובחנים במשך 5 ימים ו הרעלן הוא הוסיף לאחר מכן את הצלחות למשך 24 שעות. צלחות Assay הם פלט מהמערכת immunostained. משך הזמן שנדרש לכל אחד התהליכים מצוין בסוגריים. ii) נתונים נרכש באמצעות imager HC (כדאיות התא, טרנסלוקציה חלבון תולדה נוירונים) ו imager אוטומטיות confocal (מורפולוגיה המיטוכונדריה). נתונים מיוצאים חבילת CellHTS2 בתוך R, בסיס (2) יומן טרנספורמציה מנורמל. דו כיוונית ANOVA משמש לזיהוי אינטראקציות משמעותיות בין משתנים שונים.

ילדה = "jove_content"> איור 3.
באיור 3. Composite תמונות של תאים נרכשה על ידי בג"צ הדמיה. א) בתאים שלא טופלו, ב) תאים שטופלו H 2 O 2. DJ1 מסומן בירוק, המיטוכונדריה באדום הגרעינים בכחול. מכתים Neurite לא מסומן.

איור 4.
איור 4. כימות של תכונות הסלולר מספר המתקבלים HCS. לספירה) מטופל SH-SY5Y תאים. EH) H 2 O 2 שטופלו SH-SY5Y תאים. A, E) פילוח גרעינים ההגדרה של ROI, B, ו) זיהוי וכימות של המיטוכונדריה, ההחזר על ההשקעה ב: C, G) זיהוי DJ1, יעד הערוץ השני; D, G) זיהוי חישוב אורך neurite הממוצע. תאים קרוב לקצה של התמונה אינם נכללים בניתוח. תמונות הבלעה הם תמונות לפני ניתוח.

figure-protocol-5 איור 5. זיהוי של גן ב epistasis עם DJ1 (אותיות על הסורגים מתאימות האותיות על התמונות). תמונות A עד D הם SH-SY5Y תאים שכותרתו עם Mitotracker CMXRos (אדום) ששימש כימות של בריאות התא.

איור 6.
איור 6. זיהוי של גן ויסות DJ1 טרנסלוקציה (אותיות על הסורגים מתאימות האותיות על התמונות). תמונות A עד D הם SH-SY5Y תאים שכותרתו עבור DJ1 (ירוק), מיטוכונדריה (אדום) גרעינים (כחול) ששימשו כימות של טרנסלוקציה DJ1 אל המיטוכונדריה.

איור 7.
איור 7. זיהוי של גנים המעורבים תולדה העצבית (אותיות על הסורגים מתאימות האותיות על התמונות). תמונות A עד D הם SH-SY5Y תאים שכותרתו עבור טובולין β-III (ירוק) גרעינים (כחול) אשר שימשו כימות אורך neurite.

איור 8.
איור 8. זיהוי של גנים המעורבים בוויסות מורפולוגיה המיטוכונדריה. תמונה A ו-C הם תמונות המשולב של SH-SY5Y תאים נגועים עם shRNA מקושקשות או מיקוד shRNA גן D בהתאמה. המיטוכונדריה הם בצבע אדום בעוד הגרעינים נצבעים בכחול. תמונה B ו-D הם חזותיים של כימות SER-רכס.

דיון

עם הפחתת עלויות של HT / HC מערכות הסלולר ההקרנה, בשילוב עם הזמינות של הגנום כולו כלים חזקים כדי לשנות את תפקוד הגן, HT / HC המסכים הופכים דבר שבשגרה באקדמיה. הגישה כבר הותקן בהצלחה בתחומים מגוונים של מחקר כגון זיהוי של מטרות התרופה לסרטן 9, 31-33 ו - 34-36 התפתחות עוברית ואפילו יש פוטנציאל ליישום בפענוח המסלולים המעורבים הפרעות נוירופסיכיאטריות 37,38. עם זאת יישום של מערכת כזו דורשת השקעה משמעותית של זמן ומאמץ עם אופטימיזציה של תהליך לעתים קרובות לקחת מינימום של 6 חודשים. כל השלבים, כמו פעמים trypsinization, מהירויות pipetting וצפיפות זריעת צריך להיות מותאם, על מנת להבטיח כי תאים בריאים לצמוח בעקביות. מניעת זיהום חיידקי הוא אחד האתגרים הקשים ביותר מול תרבית תאים אוטומטית עם פרוטוקולי ניקוי שבועי גombination עם שטיפה מתמדת של כל הקווים נושאות נוזל עם 70% אתנול להיות הכרחי תרבויות זיהום בחינם. זה יהיה גם צורך לשפר את הרובוטיקה, כך מכשירים נוספים, כגון מיקרוסקופים confocal עבור רזולוציה גבוהה יותר ו -80 ° C מקפיאים לאחסון המתחם יכול להיות משולב.

יש גם מגבלות צורך לטפל על מנת לשפר את מהירות רגיש, השירות של שיטה זו ללמוד רשתות גנים ולזהות גנים המעורבים מסלולים מולקולריים פתוגניים.

כדי לנהל מסך HT / HC ולהבטיח כי נתונים אמינים נאסף, כמה היבטים צריך להיות מותאם. ראשית, אמינות המדידה היא מעל לכל תלוי חוסנו ואת הרגישות של assay. למשל, מבחני המתוארים לעיל מתאימים המסכים קטנים יותר, אבל קשה ליישם בקנה מידה רחב הגנום, בשל עיבוד מספר צעדים נדרשים לפני רכישת התמונה.לפיכך, אפשר היה לבנות שורות תאים יציבות לבטא את הגן הכתב, אשר יאפשר הדמיה ישירה להוביל וריאציה ירד בשל מספר מופחת של מדרגות עיבוד. נכון לעכשיו, תכנון assay מתאר במדויק ובאמינות מכמת פנוטיפ של עניין הוא צוואר הבקבוק העיקרי בתהליך המיון HC.

מסכי רבים שנערכו בתאי יונקים שונים באמצעות ספריות RNAi, אשר כולם סובלים מחוץ יעד אפקטים, יעילות מוגבלת להשתקת גנים בגנום כיסוי שלם. לפיכך ספריות צריך להתבצע אשר הם ספציפיים יותר, חזק ויש לי כיסוי טוב יותר. נערכים מאמצים ליצור כזה הוא קיווה במאמצים כזה ישפר את שחזור של HT / HC scre en להיטים.

הגבלה של רבים בקנה מידה גדול תא מסכי מבוססות כי הם נערכים בתאי נוירובלסטומה כי הם יכולים להיות מניפולציות גנטיות ותרבותי על מספרים גדולים בקלות יחסית. עם זאת, את הרלוונטיות של "להיטים" מזוהה לשעבר התרבות מודלים vivo תא בתפקוד vivo מוטלת בספק, במיוחד כאשר המוח מורכב של סוגי תאים מאוד מיוחדים אשר יוצרים רשת צפופה ומסובכת של קשרים סינפטיים לתפקד כיחידה משולבת מאוד. כתוצאה מכך, מקובל שפוגע מזוהה באמצעות גישה ההקרנה שתוארו לעיל, הן תוקף משני מסכי שימוש בטכניקות נוספות של מודלים רלוונטיים יותר פיזיולוגיים 39. כדי לשפר את בתרגום של להיטים המזוהים במהלך HCS, נציג מודלים מתוחכמים יותר, כגון תאים ראשוניים התמיינות בתאי גזע או תרבות משותפת מערכות צריך להיות מפותחות המותאמות HT / HC גישות.

"ntent> עם שילוב של culturing תא אוטומטיות HC הדמיה אחד יכול במהירות לקבל תובנות חדשות על איך הנוירונים פונקציה ולקבוע אילו מסלולים חשובים להתפתחות המחלה. שילוב HCS / HTS נתונים עם מידע המופק גישות אחרות" omics ', זה יהיה אז ניתן יהיה לבנות סקירה מערכות הביולוגיה של מחלות במוח, ובכך להקל על התפתחות טיפולית.

גילויים

אין לנו שום דבר לגלות

תודות

אנו מודים המילטון מתכנתים ומומחי תמיכה מתמשכת Blaas אווה לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי שני מענקים NWO השקעה (911-07-031 ו 40-00506-98-10011), ביאטריקס Prinses Fonds Wetenschapsprijs 2009 ואת קמפוס Neuroscience אמסטרדם; ש"י נתמך על ידי TI-פארמה: T5-207.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי
AI.CELLHOST המילטון http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/
OPTI-ממ Invitrogen 31985-054
Retinoic חומצה Sigma-Aldrich R2625
OMNITRAY צלחות NUNC 465219
96 תרבות צלחות WELL גרנייה 655086
DJ1 N20 נוגדן סנטה קרוז SC27004
BETA-III טובולין נוגדן Sigma-Aldrich T3952
MITOTRACKER CMXROS Invitrogen M-7512
Hoechst-33342 Invitrogen H1399
מי חמצן Sigma-Aldrich 216,763, 100 מ"ל
טריפסין Invitrogen 25050014
פוספט'S DULBECCO בופר Invitrogen 14190086
PROMEGA אשף MAGNESIL TFX PROMEGA A2380
SHRNA שיבוטים OPEN BioSystems http://www.openbiosystems.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails /
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS תרמו פישר http://www.thermo.com/hcs

מקורות

  1. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461, 908-915 (2009).
  2. Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology. Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).
  3. Zhu, H., Snyder, M. 'Omic' approaches for unraveling signaling networks. Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).
  4. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68, 207-217 (2010).
  5. Manolio, T. A. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 461, 747-753 (2009).
  6. Nalls, M. A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377, 641-649 (2011).
  7. Simon-Sanchez, J. Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch. Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).
  8. Van Regenmortel, M. H. Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism. EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).
  9. Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health. Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).
  10. An, W. F., Tolliday, N. J. Introduction: cell-based assays for high-throughput screening. Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).
  11. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).
  12. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).
  13. Conrad, C., Gerlich, D. W. Automated microscopy for high-content RNAi screening. J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).
  14. Thomas, N. High-content screening: a decade of evolution. J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).
  15. Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).
  16. Dragunow, M. High-content analysis in neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).
  17. Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).
  18. Durr, O. Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay. J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).
  19. Miller, J. Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis. J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).
  20. Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. The Complete Automation of Cell Culture. Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).
  21. Bonifati, V. Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science. 299, 256-259 (2003).
  22. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).
  23. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  24. Moffat, J. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124, 1283-1298 (2006).
  25. Volksgezondheid, M. V. Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde. Organismen. , (2004).
  26. Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).
  27. Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme. J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).
  28. Canet-Aviles, R. M. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).
  29. Blackinton, J. Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1. J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).
  30. Gupta, P. B. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138, 645-659 (2009).
  31. Luo, J. A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene. Cell. 137, 835-848 (2009).
  32. Mouchet, E. H., Simpson, P. B. High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges. IDrugs. 11, 422-427 (2008).
  33. Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).
  34. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  35. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).
  36. Ross, P. J., Ellis, J. Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells. F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).
  37. Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).
  38. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

shRNASER

מאמרים קשורים