פרוטוקול שלנו מדגים כיצד למזוג ג 'ל חלבון מרובים בכל פעם על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel וחומרים זולים שנרכשו בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג'לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג'ל פלסטיק של ג'ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג'ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הערכה של חלבונים באמצעות סולפט dodecyl נתרן polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ניתוח היא טכניקה נפוצה בשימוש על ידי חוקרים לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית 1-4. עבור מעבדות המבצעות בדיקות יומיות של חלבונים, העלות של ג'ל polyacrylamide זמינים מסחרית (~ $ 10/gel) יכול להיות משמעותי לאורך זמן. כדי להקטין את העלות, כמה חוקרים להכין ג'ל שלהם polyacrylamide. השיטות המסורתיות של לשפוך את הג'לים בדרך כלל לנצל ציוד מיוחד ו ג 'ל זכוכית צלחות כי יכול להיות יקר למנוע לשפוך ג'ל רבים ואחסונם לשימוש עתידי. יתר על כן, טיפול של לוחות הזכוכית במהלך ניקוי או ג'ל לשפוך יכול לגרום שבירה בשוגג יצירת מפגע בטיחותי, אשר עשוי למנוע את השימוש בהם בשיעורי מעבדה לתואר ראשון. פרוטוקול שלנו מדגים כיצד לשפוך ג'ל חלבונים רבים בו זמנית על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel, ותואר שני זולterials לרכוש בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג'לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג'ל פלסטיק של ג'ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג'ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה. בנוסף, קלטות ג'ל פלסטיק עמידים מאוד שבירה, מה שהופך אותם אידיאליים עבור כיתות מעבדה לתואר ראשון.
פרוטוקול
1. הכנת קלטות
- מול נקי ובחזרה צלחות קלטת שימוש Invitrogen Nupage minigel Novex או minigel אחר קלטת מסחרי.
- להכין 1-3 מ"ל של כ אפוקסי פלסטיק ומערבבים היטב על פי הוראות היצרן.
- החל אפוקסי לקצה בתוך צלחת הקדמי, שבו שני לוחות יבוא במגע כאשר את הקלטת מורכבת.
- החלק פיסת נייר קרטון פילטר או דרך החריץ התחתון של הלוח האחורי כאשר הרכבת את הקלטת כדי למנוע אפוקסי עודפי איטום הפתיחה. הסר את הנייר מסנן מיד את שני לוחות מורכבים.
- מניחים מהדקים יחד את הקצוות של חותם חזק, ולתת קלטות יושבים לילה עבור אפוקסי באופן מלא לרפא.
- לאטום את החריץ בחלק התחתון של הלוח האחורי עם הקלטת חשמל.
2. לשפוך ג'ל לפתרון
- כדי בקבוק 125 מ"ל בצד הזרוע, להוסיף את הדברים הבאים:2.25 מ"ל של 4X-טריס בסיס פתרון של ג'ל חיץ pH 8.70, 3.50 מ"ל של acrylamide 30.8% / bisacrylamide, 3.25 מ"ל של מים סוג אני מגיב כיתה (IRG-H 2 O) על בהיקף כולל של 9 מ"ל.
- דה גז פתרון 10 דקות על ידי הצמדת היד בצד של הבקבוק למכשיר ואקום, והנחת פקק הפוך על החלק העליון של הבקבוק.
- להעביר 9 מ"ל של פתרון דה הגזים כדי 50 מ"ל הפנויה צינור פוליפרופילן צנטריפוגות ולהוסיף 30 μl של persulfate ammounium 10% (APS) ו 6 μl של N, N, N ', נ',-tetramethylethylenediamine (TEMED) ומערבבים היטב על ידי מתערבל פתרון כדי למנוע החדרת בועות.
- יוצקים מיד את הפתרון אל תוך קלטת, הפעלתו את הצד של הקלטת למנוע בועות מ טביעה בין צלחות ג'ל. למלא את הקלטת של כ 2 ס"מ מהקצה העליון של הלוח (קצר) הקדמי.
- בעדינות להוסיף 0.5 מ"ל של butanol-1 רווי חיץ 1X ג'ל לפתרון ולתת ג'ל לפלמר עבור 1שעה.
3. לשפוך ג'ל לערום
- להוסיף את הדברים הבאים בקבוק 125 מ"ל לצד הזרוע: 0.75 מ"ל של pH טריס 4X-Base הערמה ג'ל חיץ 6.80, 0.40 מ"ל של acrylamide 30.8% / bisacrylamide, 1.85 מ"ל של IRG-H 2 O על בהיקף כולל של 3 מ"ל.
- דה גז פתרון דקות 10 כמתואר בשלב 2.
- בעוד הפתרון ג'ל לערום הוא degassing, יוצקים מעל 1-butanol רווי חיץ פתרון של 1X ג'ל מהחלק העליון של ג'ל לפתרון. יש לשטוף את החלק העליון של ג'ל לפתרון פעם אחת עם IRG-H 2 O. יוצקים את המים ולהשתמש נייר bibulous או Whatman מסנן לספוג כל נוזל הנותר.
- הסרה של 3 מ"ל של תמיסת degassed ולהוסיף 9 μl של APS 10% ו 2 μl של TEMED ומערבבים היטב.
- במהירות יוצקים את הפתרון קלטת, הפעלתו את הצד של הקלטת עד קרוב לקצה העליון של הצלחת קצר ג'ל הקדמי.
- הכנס מסרק ג'ל נקי לתוך החלק העליון של קלטת ג 'ל,למקם קליפ קלסר על קלטת על מסרק להחזיק אותו במקום. בואו ג'ל לערום לפלמר שעה 1 עד לילה.
4. אחסון ג'ל
- כאשר ג'ל יש מפולמר לגמרי, להסיר את הסרטונים בינדר למקם את הקלטת בנרתיק חום רב סגר פלסטיק או שקית מחדש סגר פלסטיק.
- יוצקים 20 מ"ל של חיץ 1X לערום ג'ל המכיל אזיד הנתרן 0.1% בתוך כיס.
- מחממים לאטום את הכיס עבור 5 שניות כדי לוודא שאין נזילות בתיק.
- לאחסן את הג'ל על 4 ° C.
5. הכנת דוגמאות
- בצינור דק דופן microcentrifuge, מסתכמים μl 6.5 המדגם חלבון, 7.5 μl של חיץ 2x Novex SDS טריס-גליצין המדגם, 1 μl של 100 mM dithiothreitol (DTT) וכן IRG-H 2 O (במקרה הצורך) על הנפח הכולל של μl 15.
- מערבבים את המדגם על ידי vortexing, ובקיצור צנטריפוגות מדגם להביא התוכן לחלק התחתון של הצינור.
- לפגל את המדגם על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
6. הרצת ג'ל
- הגדרת מנגנון ג'ל Novex.
- הוסף 200 מ"ל של חיץ טריס-גליצין ריצה המכיל 500 μl של נוגדי חמצון Nupage לחדר הפנימי, 300 מ"ל של טריס-גליצין הפעלת המאגר אל החדר החיצוני.
- לטעון את דגימות חלבון מפוגל (15 μl) לתוך הבארות באמצעות טעינת ג'ל עצה פיפטה.
- הפעל את הג'ל על V 200 דקות 60-70.
7. מכתים ג'ל
- הסר את הקלטת מן המנגנון ג'ל ולשבור את החותם אפוקסי ידי חטטניות שתי צלחות פלסטיק ג'ל זה מזה באמצעות סכין ג'ל או סכין מרק נוקשה. בזהירות להפריד ג'ל מן הצלחות, נזהרת שלא לקרוע את הג'ל.
- שוטפים את הג'ל עם IRG-H 2 O שלוש פעמים עם תסיסה עדינה.
- כתם ג'ל עם Invitrogen SimplyBlue SafeStain שעה 1 עם תסיסה עדינה.
- יוצקים את הפתרון מכתים וdestain ג'ל עם IRG-H 2 O.
8. ניקוי קלטות
- השתמש מרית מתכת לגרד או לקלף אפוקסי על כל הקלטות, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר שוב.
- לשטוף את כל הצלחות ג'ל פלסטיק עם פתרון חומר ניקוי עדין, ולשטוף היטב במי ברז לאחר מכן במים מזוקקים.
9. נציג תוצאות
בגלל אפוקסי יהוו חותמת מים חזק, (איור 1), קלטות לא ידלפו כאשר הפתרון acrylamide הוא שפך לתוכם. בנוסף, קלטות הג'ל ניתן לפתוח בקלות כדי לאחזר את הג'ל על מכתים, ו אפוקסי ניתן קילף של הקלטות, כדי לאפשר המשך שימוש חוזר שלהם. כפי שניתן לראות בתרשים 2, ג'ל מראה הפרדה ברורה של סמנים חלבוניים ולהקות מדגם מתאים אלקטרופורזה חלבון שגרתית.
באיור 1. Appliקטיון של אפוקסי לאטום קלטות minigel. בשכבה דקה של אפוקסי מוחל על קצה 1 של הקלטות לקראת האסיפה. כדי להדגיש את אפוקסי, זה היה שקר בצבע אדום בתמונה זו.
איור 2. הפרדת חלבונים על ג'ל SDS-טריס-גליצין מזג באמצעות שימוש חוזר קלטות minigel. SDS-PAGE בוצע כפי שתואר לעיל. אלקטרופורזה הבאה ג'ל הוסרה קלטת minigel, מוכתם ב SimplyBlue SafeStain לפי הוראות היצרן, וצילם באמצעות אור לבן מועבר. ליין M מכיל SeeBlue Plus2 מראש מוכתמים סטנדרטים חלבון. משקל מולקולרי של חלבונים במסלול M מצוינים בצד ימין של ג'ל ב kiloDaltons (KDA). בסמטאות אחרים מראים חלבונים מן lysate פינה מחיידקים המבטאים גלוטתיון-S-transferase (GST), מתויג חלבון. החלבונים הם אלה המוצגים שטף מ glutathione חרוזים שקדמו elution של חלבון GST-מתויג.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ג'ל אלקטרופורזה חלבון היא שיטה הכרחית עבור מעבדות ביולוגיה מולקולרית ביותר. Minigels זמינים מסחרית לספק רמה גבוהה של נוחות, אבל יכול להיות יקר. כאן אנו מראים כיצד לעשות שימוש חוזר בקלטות minigel של המותג הפופולרי של minigels זמינים מסחרית. שיטה זו שומרת על הנוחות של בעל מקור המוכן של ג'ל, אבל בכל חלק של העלות של minigels זמינים מסחרית. צעד מרכזי בהליך זה מיישמת את הסכום הנכון של אפוקסי לחלוטין לאטום את קלטות לפני הוספת acrylamide unpolymerized כדי למנוע דליפה. השתמש אפוקסי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
המחברים מודים הווארד יוז רפואי במכון למדע UF לפרס החיים על AH
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel קלטת (1.0 מ"מ) | Invitrogen | NC2010 | ניתן להשיג 2, 5, 10, 12, 15 ו - 2 ד בארות |
| פלסטיק אפוקסי | Loctite | 108771 | |
| חשמל Tape | סקוטש | ||
| 125 מ"ל הזרוע בצד הבקבוק | פיירקס | 5360 | |
| 4X-טריס בסיס פתרון של מאגר ג'ל | 1.5 מ 'טריס בסיס pH 8.7 | ||
| acrylamide | פישר סיינטיפיק | 01065-500 | |
| BIS-acrylamide | Biomedicals מגה פיקסל, Inc | 800173 | |
| Acrylamide 30.8% הפתרון | 30:0.8 acrylamide: BIS-acrylamide ב IRG-H 2 O | ||
| 10% APS | פישר סיינטיפיק | BP179-25 | 0.1 persulfate גרם אמוניום ב 1 מ"ל IRG-H 2 O, מוכנים מיד לפני השימוש |
| TEMED | Arcos Organics | 138450500 | |
| 1-butanol רווי חיץ ג'ל פתרון של 1X | 05:02 1-butanol למאגר 1X ג'ל פתרון של | ||
| ג'ל טריס 4X-Base לערום חיץ | 1.5 מ 'טריס בסיס pH 6.8 | ||
| ג'ל מסרק | Invitrogen | NC3015 | 15 ובכן, 1.0 מ"מ עובי |
| הדחף אוטם | TEW אלקטריק ציוד חימום | ||
| פאוץ סגר חום | Kapak / Scotchpak | 1 ליטר בגודל (6.5 "x 8") | |
| ג'ל למאגר אחסון | 1X לערום חיץ ג'ל עם אזיד הנתרן 0.1% | ||
| Novex SDS טריס-גליצין מדגם חיץ (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | FisherBiotech | BP172-5 | |
| ריצה 10X טריס-Gylcine חיץ | Invitrogen | LC2675 | 1 ליטר של המניה 10X: 29.0 גרם טריס-Base, 144.0 גרם גליצין, 10.0 גרם SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| ג'ל סכין | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue בטוח כתמים | Invitrogen | LC6065 |
מקורות
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
