מאמר שיטה

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

DOI:

10.3791/3473

⸱

16 בספטמבר 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Western Ontario, 2Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו טכניקה BiFC לבחון את האינטראקציה בין שני חלבונים in vivo. מטרה זו מושגת על ידי פיצול חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לשני שברים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן של עניין. מבנים אלה אז יכול להיות שותף להפוך ניקוטיאנה benthamiana דרך טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium, המאפשר ביטוי במעבר של חלבונים היתוך. הכינון מחדש של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה 1-7. כדי לבדוק ולאמת את חלבונים אינטראקציות, BiFC ניתן להשתמש יחד עם שני assay שמרים (Y2H) היברידית. זה יכול לזהות אינטראקציות עקיף אשר ניתן להתעלם ב Y2H. הטכנולוגיה Gateway היא פלטפורמה אוניברסאלית המאפשרת לחוקרים המעבורת הגן של עניין (GOI) לתוך כביטוי רבים מערכות אנליזה פונקציונלית כמו 8,9 אפשרי. גם הכיוון ואת מסגרת הקריאה יכול להישמר ללא שימוש אנזימי הגבלה או קשירת להפוך מוכנים ביטוי שיבוטים. כתוצאה מכך, אפשר לחסל את כל סידור מחדש של צעדים כדי להבטיח תוצאות עקביות לאורך הניסויים. יצרנו סדרה של וקטורים BiFC תואם Gateway ו Y2H אשר לספק לחוקרים עם קל להשתמש בכלים כדי לבצע מבחני הן BiFC ו Y2H 10. כאן, אנו להדגים את קלות השימוש במערכת BiFC שלנו לבדוק חלבונים אינטראקציות נ benthamiana צמחים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תרבות Agrobacterium

  1. Agrobacterium זן GV3101 שינתה בעבר עם Gateway תואם BiFC וקטור pEarleyGate201-י"ס pEarleyGate202 ו-YN, שכל אחת מהן מכילה היתוך לבנות של GOI.
  2. לחסן 5 מ"ל ייב (5 גרם ל -1 תמצית בשר בקר, 1g ל -1 תמצית שמרים, 5 גרם ל -1 Peptone, 5g סוכרוז ל -1, 2 מ"מ MgSO 4, pH 7.2) תרבות של חלבון היתוך BiFC בונה הפך Agrobacterium עם מבחר אנטיביוטי מתאים. לגדול בתרבות לילה בשעה 28 ° C רועד ב 200 סל"ד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay BiFC הוא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון. בניגוד assay Y2H המסורתית, BiFC לא רק מאפשר הדמיה של חלבונים אינטראקציות, אלא גם מספק מידע יותר מורכב החלבון כגון בלוקליזציה המשנה הסלולר. כמו כן, ניתן לזהות אינטראקציות עקיפה, כל עוד שני חלבונים מועמד אפשר להביא מספיק קרוב על ידי שותף שלישי. כמו כל טכנולוגיה, BiFC יש מגבלות. בשל הדרישה של חמצן מולקולרי ליצירת fluorophore, BiFC לא ניתן להשתמש אנאירוביים לחייב, אשר לא יכולים לשרוד בנוכחות חמצן. זה מגביל את השימוש BiFC אורגניזמים א.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים וי נגוין לקרוא את כתב היד וסיוע מעבדה כללית.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוסירינגוןסיגמא-אולדריץ'D134406
MES הידראטסיגמא-אולדריץ'M2933
1 מ"ל מזרק טוברקולין עם קצה החלקהBD Biosciences309602

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
  2. Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging as....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationGateway CompatibleAgrobacterium Mediated TransformationNicotiana BenthamianaYeast Two HybridConfocal MicroscopyCo ImmunoprecipitationFluorescent Protein ReconstructionPlant Expression System

מאמרים קשורים