ביאור של תפקוד הגן הצמח דרך Genomics, metabolomics משולבים אינפורמטיקה

סיכום

שילוב של הגנומיקה, שיתוף ניתוח Gene הביטוי ואת ההזדהות של תרכובות היעד דרך חילוף החומרים לתת ביאור גן פונקציונלי.

תקציר

בהתחשב במספר ההולך ומתרחב של הצמח מינים מודל עבורו רצף הגנום המלא זמינים שפע של ביו משאבים כגון מוטציות נוקאאוט, ההצטרפויות בר ואוכלוסיות רבייה מתקדמות, יש הנטל הגובר ביאור גן פונקציונלי. בפרוטוקול זה, ביאור של תפקוד הצמח הגן באמצעות ניתוח משולב שיתוף ביטוי גנים, metabolomics ו אינפורמטיקה מסופק (איור 1). גישה זו מבוססת על התיאוריה של שימוש גני מטרה של תפקוד המכונה כדי לאפשר זיהוי של גנים שאינם מועדות צפוי להיות מעורב בתהליך חילוף החומרים מסוים, עם זיהוי של תרכובות היעד באמצעות metabolomics. אסטרטגיות הם העלו על החלת מידע על אוכלוסיות שנוצר על ידי שתי גישות קדימה גנטיקה הפוכה למרות כל אלה הם ללא מאמץ. לפי גישה זו תולדה יכול לשמש גם גישה לאפיין פסגות לא ידועים המייצגים SE חדש או מיוחדמטבוליטים condary ברקמות מוגבלות, מיני צמחים או טיפול מתח, אשר נמצא כעת במשפט חשוב להבנת חילוף החומרים במפעל.

פרוטוקול

1. לדוגמא הכנת

1. חומרים צמחיים נקצרים ולהקפיא מיד.
2. חומרים צמחיים קפואים אבקת ידי טחנת מיקסר (או מרגמה) ומאוחסנים פלקון צינור או צינור Eppendorf ב -80 ° C.

2. הפקת על פרופיל המטבוליט

1. Aliquot קפוא חומר צמחי של צינור 2 Eppendorf מ"ל.
2. הוסף 5 μl מאגר החילוץ מיליגרם של משקל חדש של חומר צמחי קפוא.
3. הוסף 1 מתכת (או gilconia) כדור homogenize של אבקת קפוא עם מיל מיקסר דקות 2 ב 25 ls ^-1.
4. סרכזת 10 דקות 12,000 סל"ד.
5. העברת supernatant כדי NANOSEP מסנן צנטריפוגלי.
6. סרכזת 2 דקות בסל"ד 4000.
7. העברת supernatant לצינור Eppendorf חדש בחנות ב -20 ° C עד השימוש.

3. פרופיל המטבוליט ידי LC-MS

1. הגדרת HPLC ולבדוק הטמפרטורה של התנור עמודה מגש מדגם.
2. הגדרת מצב MS ולבדוק את מצב של ואקום וחימום נימי.
3. בצע מ / ת כיול של גלאי MS.
4. העברה של μl 50 של תמציות כדי בקבוקון זכוכית LC-MS.
5. להזריק 5 μl של תמציות ל LC-MS.

4. ניתוח נתונים

1. להגדיר Xcalibur או Metalign ⁴ ובחר ניתוח נתונים לעיבוד.
2. להכין טבלה של פסגות זוהה עניין שלך לפי סוג מתחם לוח.
3. זהה את פסגות ידי elution עמית של תרכובות סטנדרטיים.
4. ביאורים לאתר פסגות באמצעות MS ² ניתוח, סקר ספרות, חיפוש במסד הנתונים המטבוליט (איור 2, ^12,13).

5. התחזית של מסלול מטבולי

1. לבנות מסלול אפשרי עם תרכובות שזוהו. התחזית של מסלול באמצעות הסברים שיא צריכה להיות מבוססת על המבנה הכימי של המתחם לאתרעל ידי קישור של בניבוי פונקציות אנזימטיות על מסלול מטבולי ^13. צעדים ביוסינתטי המבנית צריכה להתנהל עם ביאור לשיא מדויק. אבל קביעת המבנה הכימי המפורט, במשך מחצית הסוכר, למשל, אינה הכרחית בשלב זה, כי התחזית של מחצית הסוכר ואת המיקום adducted קשה מאוד לזהות באמצעות ניתוח MS. קביעת סוג סוכר כגון hexoside ו pentoside יזוהו על ידי assay האנזימטית של התורם סוכר בשלב האחרון של הפרויקט. בעיקר בבניית התחזית של מסלול יש לבצע כמו מולקולה קטנה היא בינונית של מולקולה גדולה יותר חוץ מאשר במקרים מסוימים כגון התגובה התייבשות. רשימת משקל מולקולרי האטום, למשל 16 מ '/ z על ההבדל בין-H ו-OH מחצית (חמצון), 14 מ' / z (Carbon-Atom) על ההבדל בין-OH ו-Ome (מתילציה) ו - 162 מ '/ z ( MW-H ₂ O) עבור hexose (glycosylation), הוא שימושי עבור התחזית. קביעתסוג השינוי עם ניתוח המתאם של רקמות ספציפיות עוזר התחזית של מסלול מטבולי. מאגר המידע של מסלול מטבולי כללי כגון מסד נתונים KEGG ( http://www.genome.jp/kegg/ ) ו PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), הוא יעיל מאוד עבור חיזוי של מסלול מטבולי עניין שלך.

6. הכנת רשימת ג'ין עם ID Gene ארבידופסיס Orthologous

1. הורד מזהה רשימת גן ממסד הנתונים הגנומי.
2. הוספת זיהוי הגן ארבידופסיס של הגן orthologous, במקרה של צמח המטרה שלך היא לא ארבידופסיס.
3. הכן רשימה של גנים עניין של מסלול, שלך. ביאור של נתוני מסלול ארבידופסיס ומשפחה נתונים גנים זמינים באתר האינטרנט תאיר ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). אם הכין רשימה של גנים orthologous ארבידופסיס, אתה יכול כעבור קומבינה אותם.

7. שיתוף הביע ג'ין ניתוח

1. בדיקה תוך שימוש הגן מוכן מזהה רשימת לחפש באתר הטוב ביותר במסלול שלך על ידי בדיקת המתאם באמצעות זוגות גנים ידועים לטובת מסלול, של שלך (לוח ב '). אם שיתוף ביטוי מסד נתונים או ביטוי הגן באתר אינם זמינים במפעל עניין שלך, באתר ארבידופסיס שיתוף הביטוי יש להשתמש עם רשימה של גנים orthologous ארבידופסיס. במקרה של שעורה, אורז, צפצפה, חיטה, סויה ו Medicago, שיתוף הביטוי ניתוח של מיני צמחים יכול לשמש (לוח ב ').
2. לבנות את מסגרת הרשת שיתוף הביטוי היעד מבוסס על קשרים של ידועים גנים עניין של מסלול, שלך.
3. הוסף גנים מועמדים בהתאמה (r <0.4 ~ בתוך הערך המשוער של ערך מקדם בין החיבורים של ידועים גנים עניין של מסלול, שלך, 0.90) ולבדוק ביאור הגן שלהם בתחום יחסי הציבור שלךמשפחות edicted אל החיבורים של רשת זו למציאת גנים המועמד הטוב ביותר (איור 3). סף של ערך מקדם יש לתאם פי מבנה הרשת וצפיפות של גנים מתואמים.
4. לעשות רשימה של גנים שבהם אתה מסוגל לצמצם בתור מתמחה מסלול היעד שלך.
5. בדיקת ביטוי גנים של איברים ספציפיות ותגובות הלחץ של גנים מועמדים שלך.

8. אינטגרציה של כל המידע כדי לחזות מסלולים חדשים

1. הוסף גנים היטב שאפיינו אשר היו בשימוש עבור השאילתה של ניתוח שיתוף ביטוי מסלול מטבולי חזה.
2. בדוק חלקים uncharacterized במסלול זה, למשל uncharacterized צעדים אנזימטיות, חלבונים תחבורה גורמי תעתוק.
3. לחזות ביאור הגן המתאים ביותר עבור הפעולות uncharacterized חסרים.
4. שלב התוצאות של פרופיל המטבוליט ו גנים מועמדים של GE ב סיליקוהביטוי ne מבוסס על מסלול מראש.
5. סידור גנים מועמדים שלך על מסלול חזה על פי תפקוד הגן, למשל, acetyltransferase עבור acetylated המטבוליט, glycosyltransferase עבור גליקוסיד, P450 עבור מתחם מחומצן. ניתוח פילוגנטי העץ של רצפי חומצות אמינו שימושי המשפחה כמה הגן רחב כגון P450 ו glycosyltransferase.
6. לבדוק את העקביות של רקמות ספציפיות או התגובות מתח בין הצטברות המטבוליט ו ביטוי גנים רמת גנים מועמדים.
7. בדוק את חיבורי למטבוליזם אחר למתן המצע ומתח הגנים תגובה.

9. ניסויים לזיהוי גנטי באמצעות ביו משאבים

1. לבירור הזמינות של bioresources עבור סיוע של הניסוי לזיהוי הגן המועמד.
2. בצעו את הניסוי לזיהוי של תפקוד הגן באמצעות ביו משאבים, כגון ספרייה מוטציה KO ו באורך מלא ספריית cDNA. Tהוא ניסויים לזיהוי תפקודי של הגנים עם הכנת צמחים מוטנטים overexpression ו בנוקאאוט, assay assay האנזימטית מקדם מחייב, צריך להתבצע על גנים מועמדים הטובים ביותר התחזית שלך. חלבון רקומביננטי assay לאפיון של נכסים חלבון והכנת צמחים overexpression טוב יותר להתבצע לאחר אישור של הפרופיל המטבוליט באמצעות KO מוטציה מאז זה לוקח הרבה יותר זמן להכין את חלבון רקומביננטי ו שיבוט הגן לשינוי.

10. נציג תוצאות

הליך של ניתוח משולב תיאר בפרוטוקול זה יש אפשרויות רבות בהתאם לצורך הניסוי מוגדר ובחירת שילובים ביולוגיים אנליטית. הבחירה של הנהלים מערך הניסוי צריך להתבצע כראוי על בסיס מסלול היעד שלך, תרכובות צמחים. אסטרטגיית שילוב המתואר בפרוטוקול זה foc בשימוש ביאור של תפקוד הצמח גנים גילוי גנים חדשים עם פונקציות שימוש יעיל של כמה משאבים נתונים ביו ו. התוצאה הצפויה היא הבטיחה לספק את המקרה היחיד של התחזית סופית. עובדה זו מצביעה על כך, אם מספיק ראיות לא יכול להינתן על ידי שילוב פרופילים, ניסוי לא צריך להתחיל. מסיבה זו, במקרים כלשהם, ניסויים ראשוניים נוספים, כגון פרופיל גנטי ממוקד ביטוי על ידי RT-PCR, יכול לתמוך התחזית שלך של תפקוד הגנים. דיוק נכונות התחזית בקורלציה גבוהה בהתאם ההבדל במספר איכותית של שונות של שילוב. בנוסף, מועמדים טובים ותוצאות תקפים יכול לבוא רק חיזוי מדויק של מסלולים. ביאור שיא צריכה להתנהל על ידי שילוב של מספר גישות, על סקר ספרות למשל, תמצית התייחסות המפעל, ניתוח MS ^n, סגוליות איברים ניתוח מוטציה ^13.

1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/>
באיור 1. סקירה כללית של זרימת ניסיוני של ביאור הגן באמצעות גישה משולבת. בחלק מהמקרים, פרויקטים להתחיל עם גילוי שיא הרומן אשר מזוהה בתנאים או רקמות מיוחדות, והרצון להבין את תפקידו בתוך חילוף החומרים שלו. במקרים אחרים מטרת הפרויקט היא זיהוי הגן או גילוי של גורמים רגולטוריים מרכזיים, כגון גורמי תעתוק. תכנון הניסוי צריך להיות מהוקצע עם סט נתונים אשר מראה הבדלים ברורים של רמות מטבוליט במסלול היעד שלך, תוך שימוש במגוון רחב של דגימות רקמה מאיברים שונים, על צמחים או צמחים הגדלים באופן דיפרנציאלי החשופים למצבי לחץ, חשיפת החומר המטבוליט פרופיל. צמחים מוטנטים ו מהונדס, כמו גם חומר QTL גידול מחסה מייצגים גם חומר גנטי מתאים ללימודים אלה. התחזית של מסלול הרומן יש לבצע בזהירות מדויקביאור שיא הגישה בשילוב עם סוג אחר של metabolotype כגון ניירות ערך איברים ותגובות הלחץ על פי נתוני ביטוי גנים של עניין, מסלול של שלך. בשלב האחרון, פרופיל המטבוליט ואת התמליל יש לבצע אשר בסופו של דבר, בשילוב עם ניתוח של סיליקו אינטרנט משאבים באפיון חוץ גופית של ביטוי גנים דרך ביטוי Heterologous, להביא אישור של המועמד גנים המבהיר את תפקידו ואת המיקום בתוך מסלול מטבולי. קיצורים: QTL, לוקוסים תכונה כמותית.

איור 2. זרימת העבודה של גישה קומבינטוריים עבור ביאור שיא. הליך זיהוי ביאור שיא של המתחם רגיל, השוואה מסוג פרוע לדפוק את מוטנטים, רב מימדי ספקטרומטריית מסה של הפסגה היעד מתייחס ספקטרה המונית של com טהורקילוגרמים של מאגרי ^12. קיצורים: DB, מסד נתונים, KO, עקום מתוך: 1-D, חד ממדית, 2-D, דו מימדי, תמ"ג, תהודה מגנטית גרעינית, אינפרא אדום, אינפרא אדום, MS ^n, המוני המונים spectrometries.

איור 3. שיתוף תקנה דוגמה לרשת ניתוח של מסלול anthocyanin. Coexpression ניתוחים בוצעו באמצעות הממשלה ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) מבוסס על נתונים שנקבעו על גרסה 3 ATTEDII ^8,2 עם Pajek התוכנית ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). מתאמים חיוביים (r <0.5) משמשים כדי להפוך את חיבורי הרשת. אדום הצומת: שנים עשר גנים anthocyanin אנזימטיות (At5g13930, CHS, TT4, synthase chalcone; At3g55120, Cהיי, TT5, chalcone isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-hydroxylase, At5g07990, F3'H, TT7, פלבונואידים 3'-hydroxylase, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, פלבונואידים 3 - O-glucosyltransferase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol רדוקטאז, At4g22880, Ans / LDOX, TT18, synthese anthocyanidin; At4g14090, A5GT, anthocyanin 5 - O-glucosyltransferase; At5g54060, A3G2 "XT, anthocyanin המשוערת 3 - O-glucoside 2" - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyanin 5 - O-glucoside 6'' '- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, anthocyanin 3 - O-glucoside 6 "- O - P-coumaroyltransferase) ושני גורמי תעתוק לייצור anthocyanin (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) שימש לחיפוש גנים מועמדים גנים מועמדים נמצאו על ידי "צומת של מערכות" חיפוש עם ערך סף של עם מקדם R <./ Em >> 0.50 שאילתה ידי הצטלבות של מערכות על ידי כל הגנים שאילתות (ארבע עשרה ביוסינתטי גנים anthocyanin). רשת שיתוף הביטוי, כולל גנים מועמדים בהתאמה (68 גנים) וגנים שאילתות (14 גנים), היה בנה מחדש על ידי "חיבור של מערכות" חיפוש עם r> .50 שימוש באתר הממשלה. קבצי פלט שהיו מעוצבים עם קובץ ". נטו" ממסד הנתונים ורשתות ראש נמשכו באמצעות תוכנת Pajek. הצומת כחול מצביע על גנים מועמדים אשר מתואמים עם גנים anthocyanin.

מין	סרן המטבוליט המשני
ארבידופסיס thaliana	Glucosinolate, flavonol, anthocyanin, נגזרת sinapoyl
Populus trichocarpa	Flavonol, anthocyanin, נגזרת סליצילט
ויטיס vinifera	Flavonol, anthocyanin, טאנין, stilbene
Solanum lycopersicum	Flavonol, anthocyanin, glycoalkaloid, chrologenate בנושא,
ניקוטיאנה tabacum	Flavonol, anthocyanin, nicotianamide, chrologenate בנושא, acylsugar
Oryza Sativa	Glycoflavone, anthocyanin, נגזרים sterol
Zea מאי	Glycoflavone, anthocyanin, benzoxazinone, נגזרים sterol
Medicago truncatula	Isoflavone, anthocyanin, saponin,
Japonica לוטוס	Isoflavone, flavonol, anthocyanin, saponin,

לוח ט מטבוליטים משניים מרכזיים מיני צמחים המודל.

שיתוף הביטוי באתר	כתובת
הצמח חוצה specIES
COP	http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V
Planet	http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/
צמחים מינים
ATEED-II	http://atted.jp/
בר	http://142.150.214.117/welcome.htm
COP	http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop
GeneCAT	http://genecat.mpg.de/
ארבידופסיס
מערכה	http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser
AthCoR@CSB.DB	http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html
CressExpress	http://cressexpress.org/~~V
ראש	http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index
Oryza Sativa
RiceArrayNet	http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V
מערך אורז מסד נתונים	http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml

לוח ב. הגן זמין ביטוי מסד הנתונים בניתוח שיתוף הביטוי סיליקו.

דיון

בהתחשב בכך transcriptomics וטכנולוגיות metabolomics שימשו במשך מספר שנים, תהליך של שילוב נתונים עבור metabolomics סייעו ביאור הגן בדרך כלל מתחיל עם זיהוי של שיא רומן המייצג המטבוליט ידוע. עובדה זו מובילה לשלב הבא שבו הוא להעריך שונות כמותי פסגות מטבוליט או גנים מועמדים חדשים חשב להיות אחראי על ביוסינתזה שלהם. האסטרטגיה תיאר בפרוטוקול זה, עם זאת, יש שלוש בעיות עיקריות א) הקושי של ביאור שיא, II) המורכבות של חיזוי מסלול, III) ברזולוציה של מידע גנטי ואיכות נתונים ביטוי גנים. כדי להתמודד עם הבעיה הראשונה, ביאור שיא צריכה להתבצע עם elution משותפת של תרכובות סטנדרטיים או מידע גישה קומבינטורית ניצול מ-MS ⁿ ניתוח, תמצית התייחסות, ניתוח מוטציה, חיפוש במסד הנתונים המטבוליט סקר ספרות (איור 2, ^12). עבור sהבעיה econd, חיזוי מסלול ניתן להשיג רק על ידי ביאור שיא הנכון. עם זאת, פרופיל מטבוליט של רקמות ספציפיות גם יכול להיות שיא ביאור תמיכה, בגלל הצטברות המטבוליט צריך להיות מתואם עם ביטויים של גנים הקשורים גנים. לכן פרופילים שילוב של רקמות שונות ותנאי גידול יכול להיות מועיל עבור בעיה זו 2. הבעיה השלישית בדבר ברזולוציה של מידע גנטי תלוי בהתקדמות של הנתונים רצף. במקרה של צמח המודל, ללא השלמת רצף הגנום, שיתוף ניתוח ביטוי גנים באמצעות orthologous בצמחים המודל השני הוא שימושי. השוואה יישור מפורט עץ ניתוח פילוגנטי של רצף החומצות האמיניות יכול לתמוך להתחבר מודל אורגניזמים למינים אחרים.

פרוטוקול זה הוא מתאים את כל חילוף החומרים. היא יעילה ביותר ניתוח של חילוף החומרים חטיבת ביניים ותיכון, אשר מאופיינים גם להיות כפופים ג תעתיק חזקהontrol ^1,5,11,16. כמה דוגמאות, שיתוף הביטוי ניתוח הצליח לבצע בהטמעת גופרית, גנים עבור חמצון β, מסועפת שרשרת השפלה חומצת אמינו, פירוק כלורופיל, ואת ירידת חמרים ליזין ^3, התא הקיר חילוף החומרים ^10,7 ואור איתות מפל ^14. ביאור של תפקוד הגן באמצעות גנומיקה, metabolomics משולבים אינפורמטיקה היא לא רק הגן ביוסינתטי ו הרגולטור ישירה של גורם שעתוק, אלא גם להבנת התהליך תגובה פיזיולוגית (ראה איור 3 למשל. ^14).

כדי לפתח את הגישה הזו מצמחים מודל למינים הצומח, השוואה חילוף החומרים של פני מיני צמחים היא גישה חזקה בחלק חילוף החומרים הכללי. לדוגמה, אם באותו מתחם מתגלה מיני צמחים שונים, ועוד כמה גנים orthologous נמצאים אלה מיני צמחים, חוצה מינים שיתוף הביטוי באמצעות ניתוח orthologous גנים יכולים לספק stronג'ראיות לסברה שלך. גישה זו יכולה להתבצע ארבידופסיס, צפצפה, Medicago, בנוסף גידולים חשובים כגון חיטה, שעורה, אורז, סויה, על ידי ניתוח שיתוף ביטוי של מיני צמחים ^(6, כדור הארץ: http://aranet.mpimp-golm.mpg . דה / ,, ^9, שוטר: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ , ראה למשל, ^15).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
מזוקקים ULC / MS מים גראד	BIOSOLVE	23214102
(ACN) אצטוניטריל ULC / MS כיתה	BIOSOLVE	01204102
(MeOH) מתנול ULC / MS כיתה	BIOSOLVE	13684102
חומצה פורמית (HCOOH) ULC / MS כיתה כרומטוגרפיה נוזלית	BIOSOLVE	06914131
תקן תרכובות	EXTRASYNTHESE
מלכודת יונים לינארית (IT) ESI-MS מערכת פיניגן-LTQ	Thermo פיניגן
HPLC Surveyor מערכת	Thermo פיניגן
אנליטית לונה טור C18 (2), בקוטר 2.0 מ"מ, אורך 150 מ"מ, 100 נקבוביתגודל חלקיקים כדוריים של 3 מ"מ	Phenomenex	00F-4251-B0
Xcalibur תוכנה	Thermo פיניגן