איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated

סיכום

שיטה אנקפסולציה, צילום של תאים הידרוג PEG crosslinked מתואר. איתות hypoxic בתוך insulinoma Murine במארז (MIN6) אגרגטים הוא מעקב באמצעות מערכת סמן פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת בחינה סדרתי של תאים בתוך הידרוג הפיגום המתאם של איתות hypoxic עם שינויים פנוטיפ התא.

תקציר

בסוכרת מסוג 1, הרס אוטואימוני של תאי בטא (β-cells) בלבלב מוביל לאובדן ייצור האינסולין ולהיפרגליקמיה שעלולה להיות קטלנית. כאפשרות טיפול חלופית להזרקת אינסולין חיצוני, נבחנה השתלה של רקמת לבלב תפקודית^1,2. גישה זו מבטיחה שחזור טבעי וארוך טווח יותר של נורמוגליקמיה. כדי למנוע דחייה, נדרשת הגנה על רקמת התורם מפני מערכת החיסון של המארח, ואנקפסולציה היא שיטה המשמשת לסיוע בהשגת מטרה זו.

חומרים ממקור ביולוגי, כגון alginate³ ו-agarose⁴, היו הבחירה המסורתית לבניית קפסולות, אך הם עלולים לגרום לדלקת או לצמיחה פיברוטית מוגברת⁵ שעלולה להפריע להובלת חומרים מזינים וחמצן. לחלופין, הידרוג'לים סינתטיים המבוססים על poly(ethylene glycol) (PEG) אינם מתפרקים, ניתנים לפונקציונליזציה בקלות, זמינים בדרגת טהרה גבוהה, בעלי גודל נקבוביות שניתן לשלוט בו, והם בעלי תאימות ביולוגית גבוהה ביותר^6,7,8. כיתרון נוסף, ניתן להיווצר הידרוג'לי PEG במהירות בתגובת צליבה פוטו-כימית (photo-crosslinking) פשוטה שאינה דורשת שימוש בטמפרטורות שאינן פיזיולוגיות^6,7. הליך כזה מתואר כאן. בתגובת הצליבה, פירוק ב-UV של הפוטו-איניציאטור, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), מייצר רדיקלים חופשיים שתוקפים את קשרי הפחמן-פחמן הכפולים של הויניל ב-PEG עם dimethacrylate (PEGDM), ובכך גורמים לצליבה בקצוות השרשרת. ניתן להשיג צליבה בתוך 10 דקות. הוכח כי הידרוג'לי PEG שנבנו באופן זה תומכים בתאים באופן חיובי^7,9, והריכוז הנמוך של הפוטו-איניציאטור והחשיפה הקצרה לקרינת UV אינם פוגעים בחיוניות ובבתפקוד של הרקמה המעטופה¹⁰. בעוד שאנו מבצעים methacrylate ל-PEG שלנו בשיטה המתוארת להלן, ניתן לרכוש PEGDM באופן ישיר מספקים כגון Sigma.

תוצאה מובנית של אנקפסולציה היא בידוד התאים מרשת כלי דם. לכן, אספקת רכיבי תזונה, ובמיוחד חמצן, פסיתה ומוגבלת על ידי דיפוזיה. זמינות חמצן מופחתת זו עשויה להשפיע במיוחד על תאי β, שתפקוד הפרשת האינסולין שלהם תלוי מאוד בחמצן^11-13. הרכב הקפסולה והגיאומטריה שלה ישפיעו גם הם על קצבי הדיפוזיה ומרחקי הדיפוזיה של החמצן. לכן, אנו מתארים גם טכניקה לזיהוי תאים היפוקסיים בתוך קפסולות ה-PEG שלנו. הדבקת התאים באדנווירוס רקומביננטי מאפשרת יצירת אות פלואורסצנטי כאשר מסלולי הגורם המושרה להיפוקסיה (HIF) התאיים מופעלים¹⁴. מכיוון ש-HIFs הם הרגולטורים העיקריים של התגובה השעתוקית להיפוקסיה, הם מהווים סמן מטרה אידיאלי לזיהוי איתות היפוקסי¹⁵. גישה זו מאפשרת זיהוי קל ומהיר של תאים היפוקסיים. בקצרה, האדנווירוס מכיל את הרצף לחלבון פלואורסצנטי אדום (Ds Red DR מבית Clontech) תחת בקרתו של טרימר של רכיב מגיב להיפוקסיה (HRE). ייצוב של HIF-1 בתנאי חמצן נמוכים יניע את השעתוק של החלבון הפלואורסצנטי (איור 1). פרטים נוספים על בניית נגיף זה פורסמו בעבר¹⁵. הנגיף מאוחסן ב-10% glycerol בטמפרטורה של -80° C כמנות רבות של 150 μL במבחנות צנטריפוגה של 1.5 mL בריכוז של 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

מחקרים קודמים במעבדה שלנו הראו כי תאי MIN6 המעטפים כאגרגטים שומרים על חיוניותם לאורך 4 שבועות של תרבית ב-20% חמצן. אגרגטים של MIN6 שגודלו ב-2% או 1% חמצן הראו סימנים של תאים נמקרוטיים (עדיין כ-85-90% חיוניים) בצביעה ב-ethidium bromide, וכן שינויים מורפולוגיים ביחס לתאים ב-20% חמצן. הצורה הכדורית החלקה של האגרגטים שנראתה ב-20% אבדה, והאגרגטים נראו יותר כקבוצות תאים לא מאורגנות. בעוד שעקה של רמות חמצן נמוכות אינה גורמת לירידה ניכרת בחיוניות, היא משפיעה בבירור על האגרגציה והתפקוד של MIN6 כפי שנמדד על ידי הפרשת אינסולין מגרת-גלוקוז¹⁵. ניתוח Western blot של תאים מעטפים ב-20% ו-1% חמצן הראה גם עלייה משמעותית ב-HIF-1α עבור תאים שגודלו בתנאי חמצן נמוכים, מה שמתואם עם הביטוי של חלבון DsRed DR.

פרוטוקול

1. PEGDM סינתזה PEGDM photoactive macromer הכנה פתרון

1. לשקול 2g של PEG (ליניארי, 10,000 Da) לתוך בקבוקון זכוכית 40mL עם מכסה פלסטיק קשיח.
2. הוסף כ 308μL של אנהידריד methacrylic ואת כובע רופף את הבקבוקון.
3. מיקרוגל את הבקבוקון על גבוה למשך 2 דקות במיקרוגל ביתי רגיל. חום לבישת כפפות עמידות, מערבולת ביסודיות את הבקבוקון, אז מיקרוגל גבוה עבור 5 דקות נוספות.
4. בקצרה לאפשר הבקבוקון להתקרר מספיק כדי להיות מטופלים עם כפפות. פותח את הפקק לאט להוסיף מתילן כלוריד בעוד מתערבל את הבקבוקון. הוסף מספיק כך שהפתרון נראה ברור ואחיד, vortexing המדגם לפי הצורך. ההיקף הכולל של מתילן כלוריד המשמש צריך להיות 1.5-2 מ"ל.
5. PEGDM המשקע ב 200 מ"ל של קר, עוררה אתר diethyl ידי הוספת dropwise פתרון.
6. אסוף את PEGDM על ידי סינון ואקום ולאפשר לו להתייבש.
7. ממיסים את PEGDM בסכום הולםמים deionized (בדרך כלל 100 -150 מ"ל).
8. Dialyze הפתרון נגד מים deionized במשך 5 ימים בצינור דיאליזה בעל משקל מולקולארי חתך של 1000 Da. החלף את המים פעם ביום.
9. Aliquot הפתרון לתוך מכולות מתאים להקפיא ב -80 מעלות למשך הלילה. Lyophilize הפתרון במשך 4 ימים להניב מטוהרים לבן אבקת PEGDM. אחסן את האבקה על 4 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש.
10. כדי להכין פתרון PEGDM photoactive, תחילה להכין 0.5 אחוזים במשקל photoinitiator פתרון המניות על ידי המסת Irgacure 2959 במים deionized. הפתרון וורטקס ולאחסן אותו בחושך.
11. הכן PEGDM 10 wt% ו 0.025% wt Irgacure 2959 פתרון תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). וורטקס ביסודיות כדי להבטיח פירוק PEGDM. אנחנו בדרך כלל להכין 1mL של פתרון זה בכל פעם.
12. לעקר את הפתרון על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ"ל. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניוםולאחסן ב 4 ° C

2. תרבות, זיהומים, הצטברות של תאים MIN6

1. MIN6 תאים בתרבית בינוני 1640 RPMI בתוספת 10% FBS, גלוקוז 7mm, 100 יחידות / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, ועל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotercin B בסביבה humidified ב 37 ° C ו 5% CO _2.
2. כדי לשחרר את התאים מן השטח טופלו בקבוק תרבות, לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם 37 ° C סידן / מגנזיום ללא HBSS, לשאוב HBSS, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של 37 ° C-EDTA טריפסין פתרון ולאפשר לתאים דגירה במשך 3 דקות.
3. היטב בצנצנת את הצד של הבקבוק כדי להפיל את התאים ללא תשלום, ולאחר מכן להוסיף 8 מ"ל של 37 ° C ו-בינוני במרץ פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה מקפיד שלא להכניס בועות.
4. פיפטה את התאים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer או תאים אחרים ספירת ההליך.
5. בהכנת להדביק את התאים עם יצרניתהנגיף, תחילה לקבוע את המספר הכולל של תאים להיות נגוע לחשב את עוצמת הקול של השעיה וירוס הנדרש כדי להשיג את הרצוי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) (5-10 חלקיקים זיהומיות לכל תא).
6. לדלל את הנגיף HBSS בקפידה על ידי pipeting את הכמות הנכונה של השעיה וירוס לתוך נפח טרום aliquoted של HBSS בתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ"ל. 50 μL של HBSS לכל טוב של תאים צבירה המתאים.
7. לפזר את התאים על ידי pipeting אותם למעלה ולמטה הצינור שלהם, אז pipet נפח הדרושים כדי להשיג 400,000 תאים לכל גם לתוך הבארות של צלחת 6-היטב בתרבות ההשעיה.
8. הוספת נפח מתאים של הנגיף מדולל היטב כל אחד כדי להשיג את הרצוי משרד הפנים.
9. הוסף בינוני עד טוב כל כדי להביא את הנפח הכולל של עד 1.7 מ"ל.
10. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית בתוך האינקובטור. הגדר את שייקר על הגדרה נמוכה, כך המדיום בעדינות שוטף סביב בארות (~ 100 סל"ד). אפשר את התאים aggregate עבור 24-36 שעות. המצרפים בקוטר משוער של 75-175 מיקרומטר צריך להיווצר.

3. Encapsulation של תאים PEGDM

1. תאים עשויים להיות במארז כמו פיזור (שלב 2.4) או צבירת הבא (שלב 2.10). מאז מבשר הידרוג פתרון PEGDM הוא נוזל, תאים נוטים להתיישב לפני crosslinking היווצרות הידרוג'ל. אם ליישוב צפויה להתרחש במהירות, כגון עם אגרגטים גדולים יותר, זה עשוי להיות מועיל כדי לייצר את הידרוג בשני שלבים, כך התאים ליישב למישור המרכזי של הג'ל. צעד אחד סינתזה הידרוג הליך מתאים תאים מפוזרים מוצג (איור 2) ואת הליך בן שני שלבים מוצג היטב (איור 3) ו המפורטים להלן (3.2-3.9).
2. יצירת כלי שבו הידרוג תוקם על ידי חיתוך קצה נמוגו של מזרק פלסטיק 1 מ"ל ו הצבתו לפתוח בסופו של דבר במעמד.
3. 20 Pipet μL של PEGDM photoactive כךlution אל הקצה הפתוח של המזרק על הבוכנה לוודא נפח מכסה את פני הבוכנה כולה. התאם את הבוכנה במרווחים קטנים על מנת להשיג משטח שטוח נוזל.
4. מניחים את pipet במעמד ולמקם את מתלה מתחת מנורת UV (365nm, ~ 7 mW / cm ²⁾ למשך כ 8 דקות, כדי לאפשר crosslinking הידרוג'ל. במהלך תקופה זו, הכנה של תאים עשויה להיות החל
5. נפח Pipet המכיל את המספר הרצוי של תאים / אגרגטים לתוך צינור 1.8 microcentrifuge מ"ל, כובע, ו צנטריפוגות התחתית 130 גרם במשך 5 דקות.
6. שימוש micropipettor, להסיר בזהירות את התקשורת מבלי להפריע לתא גלולה בקצה הצינור. כאשר ראש התקשורת מתקרב גלולה, זה עשוי להיות מועיל להשתמש עדינה, 10 טיפ pipet μL.
7. בעדינות resuspend התא גלולה ב 20 μL של פתרון photoactive PEGDM (משתמש קצה פעורת פה pipet אם עובדים עם אגרגטים) ולהוסיף את ההשעיה התא המזרק על גבי הדואר crosslinked בעבר חלק הידרוג'ל.
8. לחשוף את המזרק עד 8 דקות נוספות של אור UV להשלים את הבנייה של הידרוג. בסיום, התאים צריכים להיות במארז מלא בתוך הידרוג גלילית (איור 3).
9. הוצא את הידרוג מן המזרק לתוך 1 מ"ל של HBSS היטב הצלחת 24 באר בקצרה לשטוף את הג'ל. מעבירים את הג'ל על 1 מ"ל של התקשורת גם הצלחת 24 באר ותרבות בתנאים הרצוי.

4. היפוקסיה מעקב

1. בשלב כלשהו במהלך התמונה תרבות, התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר תחילת איתות hypoxic. תלוי מה נעשה הדמיה ניתן התמונה צלחת רב היטב או להעביר את הג'ל אל המיקרוסקופ שקופית לפני ההשמה על הבמה מיקרוסקופ. עירור שיא של Ds האדום מושגת ב 556nm ופליטה השיא מתרחש 586nm. פליטה חזקה למדי ולכן photobleaching לא היה observאד להיות בעייתי. זמן השהיה בין תחילת ייצור החלבון וזיהוי האות הראשונה היא כ 12 שעות. אות הוא ספציפי מספיק כדי לזהות תאים איתות בודדים, אבל ההחלטה עשויה להיות מספקת לצורך קביעת לוקליזציה אותות תאיים. בתאים איתות, אות הוא נצפה בדרך כלל בצורה אחידה בכל בציטופלסמה. עוצמת האות ניתן גם להגדיל את החשיפה המורחבת היפוקסיה, למרות שאנחנו עדיין לא נקבע באופן מלא אם זה נובע ביטוי חלבון מוגברת, הצטברות חלבון הכוללת, או חלבון התבגרות מאוחרת.

5. נציג תוצאות

למשל נציג MIN6 אגרגטים הגלום הידרוג PEG מוצגת באיור 4. ג'ל crosslinked יהיה מוצק לאורך, לוקח את הצורה של הכלי שבו התגובה בוצעה. ג'ל עם המשטחים החיצוניים חלקים עדיפה להשתלה כדי לסייע למניעת מחדש גוף זרsponse. בתוך הג'ל, אגרגטים התא צריך להיות סגור לגמרי במטריצה ​​ומופץ homogenously כדי לאפשר תחבורה מזין יותר.

תמונות נציג איתות hypoxic ב MIN6 אגרגטים הם בתמונה באיור 5. זהים MIN6 אגרגטים נגוע בווירוס סמן היו בתרבית או 20% O ₂ (5 א) או 1% O ₂ (5 ב) עבור 44 שעות לפני לכידת תמונה.

באיור 1. סכמטי של פעילות של מערכת סמן היפוקסיה שלנו. הכניסה adenoviral של האדום Ds DR גנים האמרגן הזרם HRE מאפשר ייצור היפוקסיה-Induced של חלבון פלואורסצנטי תחת שליטה של ​​HIF-1.

באיור 2. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה צעד יחיד של התפזרו MIN6 תאים CRosslinked הידרוג PEGDM. עבור כל ג'ל, התאים מפוזרים הם תלויים 40μL של הפתרון PEGDM photoactive macromer. זה ממוקם מזרק 1mL ערופה לבין הידרוג נוצר תחת אור UV 365nm לאחר 10-12 דקות. בסיום, הדיסק הידרוג יוסר המזרק, שטף והניח בצלחת בינוני מלא גם עבור הדגירה.

באיור 3. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה כפול צעד של MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM crosslinked. עבור ג'ל כל חצי ג'ל נוצר לראשונה על ידי crosslinking UV של 20μL של הפתרון PEGDM macromer photoactive במשך 8 דקות. MIN6 אגרגטים מושעים בקפידה 20μL נוספת של פתרון photoactive macromer אשר מתווסף על גבי ג'ל וחצי מראש יצרו. הג'ל מלא נוצרת על ידי 8 דקות נוספות של חשיפה UV עם אגרגטים במארז מלא המדיאלימטוס של הג'ל.

איור 4. מקדימה של הידרוג 40μL בהגדלה 20X. MIN6 אגרגטים (~ 400,000 תאים בסך הכל) נראים בבירור בתוך הג'ל. קוטר Hydrogel הוא כ 6 מ"מ (בר = 1mm).

איור 5. היפוקסיה פלורסנט איתות MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM. תאים שהיו במארז והניח אז הדגירה 20% O ₂ במשך 44 שעות לא יוצגו איתות היפוקסיה (א) תוך התאים היו ארוזים אז מודגרות ב 2% O ₂ במשך 44 שעות להציג איתות ברור, בכל מקום. (בר = 100μm) (ב).

דיון

השיטה המוצגת כאן מציעה שיטה מהירה ופשוטה אנקפסולציה תא הידרוג PEG עם שימוש מינימלי ללא תנאים פיזיולוגיים. PEG מהווה חומר אנקפסולציה מאוד שימושי עבור biocompatibility שלה וקלות שינוי. וריאציה פשוטה של ​​אחוז PEG בפתרון photoactive, למשל, ניתן להשתמש כדי להתאים את תכונות מכניות, כגון מודולוס דחיסה, ומאפיינים הובלה באמצעות גודל הנקבוביות. כמו כן, PEG הוא לשנות בקלות על ידי תוספת של שרשראות צד. הידרוג PEG, אם כן, מייצגים הן מכשיר קליני מבטיח פלטפורמה גמישה עבור במבחנה מחקר

שיטה למעקב אחר היפוקסיה ב-PEG הגלום בתאים יש גם הציג. שיטה זו שימושית עבור הפשטות של זיהוי היפוקסיה ועל נמנע הצורך להקריב את התאים של עניין. הטכניקה ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים מגוון רחב של מצבים שהופך אותנו שלהefulness רחב. למשל, היפוקסיה כרמז על התמיינות בתאי גזע עשוי להיות במעקב בתא תרבויות גזע micromass. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת רק כדי לפזר מערכות תא או מערכת שבה פזורים תאים מצטבר מאוחר יותר. כמו כן, זיהוי של אות ניאון עלול להיות קשה ברקמות גדול יותר או צפופים.

חומרים

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות (אופציונלי
PEG	Sigma-Aldrich	309,028, 500 גרם
Methacrylic אנהידריד	Sigma-Aldrich	276,685, 100 מ"ל
מיקרוגל	אמרסון	MW8784SB
Vortexer	תעשיות מדע	Si-A236
מתילן כלוריד	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136-1L
דיאליזה Tubing	ספקטרום	132640
	מעבדות
מקפיא
Lyophilizer	Labconco	7670521
משאבת ואקום	וולש	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
מזרק Filter	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* מנהג ניסוח
FBS	PAA מעבדות	ת 15-351
פניצילין, סטרפטומיצין	Mediatech	30-002-CI
Amphotericin B	Mediatech	30-003-CF
מדגרה	Thermo Scientific	3597	NAPCO סדרה 8000 WJ w / O2 דיכוי
טריפסין EDTA	Mediatech	25-052-CI
Orbital שאכר	VWR	12620-926
מנורת UV	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	מחזיק בשתי 40W, 365nm כחול blacklight נורות UV
סרכזת	Eppendorf	5811 000.010 *	* סדר מספר. דגם R 5810
מיקרוסקופ	ניקון	TI-ND6-PFS	עם filterset עבור עירור 556nm / פליטה 586nm