מאמר שיטה

שב וקיפל תאיים Assay

DOI:

10.3791/3540

⸱

24 בינואר 2012

 , 
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של מלווים מולקולרית במערכת התא מבוסס ואת ההשפעות האפשריות של תרכובות בעלות פעילות המעכבת / מגרה. מלווים מולקולרית הם חלבונים המעורבים בוויסות של החלבון המתקפל 1 יש תפקיד מכריע בקידום ההישרדות תא הלחץ על עלבונות כמו מכת חום 2, רעב מזין וחשיפה לכימיקלים / רעלים 3. מסיבה זו מלווים הם מצאו להיות מעורבים באירועים כמו התפתחות הגידול, chemioresistance של 4 תאים סרטניים, כמו גם ניוון מוחיים 5. עיצוב של מולקולות קטנות מסוגל לעכב או להמריץ את הפעילות של אנזימים אלה ולכן הוא אחת האסטרטגיות ביותר למד לטיפול בסרטן ומחלות ניווניות 7 9. Assay המתואר כאן מציע את האפשרות למדוד את פעילות refolding של המלווה מולקולרי מסוים ללמוד את ההשפעה של compounds על פעילותה. בשיטה זו הגן של המלווה המולקולרי הוא נחקר transfected יחד עם קידוד ביטוי עבור וקטור הגן בלוציפראז גחלילית. היא תוארה כבר denaturated בלוציפראז גחלילית ניתן וקיפלתי על ידי מלווים מולקולרית 10,11. כמו נורמליזציה מלאה transfection, קידוד וקטור עבור הגן בלוציפראז renilla הוא transfected. Transfections כל המתואר בפרוטוקול זה מבוצעות עם X-treme ג'ין 11 (Roche) ב HEK-293 תאים. בשלב הראשון, סינתזת החלבון היא מעוכבת על ידי טיפול בתאי עם cycloheximide. לאחר מכן חלבון התגלגלות הוא המושרה על ידי הלם חום 45 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר התאוששות ב 37 ° C, חלבונים מחדש מקופל לתוך קונפורמציה פעילה שלהם את הפעילות של בלוציפראז גחלילית משמש לקריאה מתוך: האור יותר יופק, החלבון יותר יהיה מחדש זכתה קונפורמציה המקורי. ללא חום תאים בהלם מוגדרות כנקודת התייחסות (100% מכלל וקיפלתיבלוציפראז).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מתזמן את התאים

  1. לפני שמתחילים, לחמם את המדיום תרבות, 1X PBS ואת טריפסין באמבט מים 37 ˚ C
  2. קח את התאים מתוך החממה לשאוב את המדיום.
  3. בעדינות להחיל 5 מ"ל של PBS 1X על התאים כדי לשטוף אותם.
  4. לשאוב 1X PBS וליישם 1 מ"ל של טריפסין המכיל 0,025% EDTA.
  5. לסובב בעדינות את הצלחת יש חלוקה שווה של טריפסין.
  6. המקום התאים החממה ב 37 ˚ C למשך 5-10 דקות (תלוי בסוג התא). מדי פעם לבדוק אם התאים מנותקים על ידי רועדת את הצלחת.
  7. Resuspend התאים 10-20 מ"ל של מדיום ולאסוף אותם צינור בז 50 מ"ל.
  8. ספירת התאים באמצעות דלפק Beckman. מספר תאים צריך להיות מספיק כדי להבטיח מפגש של כ 60-70%.
  9. פלייט את התאים ולאפשר להם זרע במשך 6-8 שעות.

2. טרנסfection

  1. לפני transfection, להתחמם aliquot של המדיום בסרום ללא באמבט מים ב 37 ˚ C.
  2. תביאו את X-treme ג'ין 9 לטמפרטורת החדר.
  3. Pipet המדיום החופשי בסרום 2 צינורות Eppendorf (1 שפופרת = 1 transfection).
  4. Pipet X-treme ג'ין 9 תשומת לב בינוני בסרום החופשי משלמים כי טיפ אינו נוגע בקיר הפלסטיק של Eppendorf ו דגירה במשך 5 דקות. בינתיים להכין שתי תערובות DNA: בתוך הגליל האחד לערבב יחד את פלסמידים עבור renilla, גחלילית ואת פקד וקטור ריק, ב renilla עוד צינור, גחלילית ואת המלווה מולקולרית.
  5. מוסיפים את תערובת DNA זה Eppendorf המכיל מדיום חופשי בדם + X-treme ג'ין 9, מערבולת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  6. הוסף dropwise כל תערובת לצלחת כל דגירה למשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2

3. פיצול תאים

  1. 24 שעות אחרי, tryps transfectioninize התאים כמתואר 1.4-1.6 ו לדלל אותם confluency סופי של 60-70% על צלחת 6 באר.
  2. הכינו צלחת אחת על השליטה הלא בהלם וכפי הצלחות רבות ככל הפעם נקודות שחזור כי צריך להיות מנותח, כמו הראו באיור. 2.

4. מחממים הלם

  1. עבור הלם חום, טרום חם סרום המכיל בינוני באמבט מים ב 37 ˚ C.
  2. הכן "הלם החום חיץ" על ידי דילול ב cycloheximide בסרום בינוני המכיל ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - מגבים ל 20 מ"מ.
  3. כעת מוציאים את הצלחות מן החממה לשאוב את המדיום.
  4. הוסף 1 מ"ל כל טוב של "חיץ הלם חום", ו דגירה במשך 30 דקות ב 37 ˚ C ו 5% של CO 2 (כוללים גם את הצלחת הפניה לטיפול זה). זה יעצור דה נובו סינתזת החלבון.
  5. ב לעבור בינתיים על אמבט מים ולהגדיר את temperature ב 45 ˚ C.
  6. לאחר דגירה, לאטום את המכסה של צלחות עם Parafilm בעבר לחתוך פסים. צלחת ההתייחסות (100% מכלל refolfed גחלילית) נשאר בחממה.
  7. דגירה צלחות ב 45 ˚ C במשך 30 דקות.
  8. הסר את הצלחות מן האמבטיה במים, להסיר את parafilm ולשים את הצלחות בחזרה בחממה כדי לאפשר התאוששות.
  9. בשלב הקציר בכל פעם לנקודה תאים לשטוף אותם PBS 1X ידי centrifuging ב 2000Xg דקה 1 בשעה 4 ˚ C.

5. תא תמוגה ו assay בלוציפראז

  1. עבור תמוגה תא יעיל, הצמד להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי.
  2. הוסף 200 μl של חיץ תמוגה פסיבי בדילול 1:05 במים מזוקקים כפול בתוך שפופרת זכוכית.
  3. הוסף 30 μl של lysate התא בצלחת 96 באר. מדגם כל pipetted בשלושה עותקים.
  4. רק "לא מזועזע" דגימות התייחסות ישמשלקרוא את פעילות בלוציפראז renilla, שכן צעד זה נעשה שימוש כדי לבדוק יעילות transfection שווים.
  5. הכן את פתרונות assay. עבור הפתרון luciferin לדלל luciferin לריכוז סופי של mM 0.2 במאגר גלאי, גלאי. עבור למאגר התגובה לדלל DTT ו-ATP ריכוז 1mm הסופי חיץ גלאי, גלאי. בשביל חיץ התגובה coelenterazine, לדלל coelenterazine לריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר במאגר coelenterazine. שמור על פתרון luciferin והתגובה coelenterazine חיץ אור מוגן.
  6. עכשיו במקום צלחת 96-היטב luminometer ועל להפעיל את תוכנית 'Wallac 1420 תחנת עבודה ".
  7. להציג את Pump1 לתוך הצינור בז המכיל את פתרון coelenterazine. סגור את המכסה כך אור לא יכול לבוא במגע עם הצינור.
  8. בחר מתוך התפריט "תחזוקה Dispenser" וסמן את האפשרות Pump1.
  9. בחר באפשרות "מלא".
  10. כדי לערוך את פריסת צלחת לבחור באפשרות "חקור פרוטוקול ותוצאות" בתפריט. בחר את פרוטוקול לחץ פעמיים על זה. כעת בחר את בארות לקרוא.
  11. חזור אל "Wallac מנהל" ולחץ על "התחל". התגובה בין בלוציפראז renilla ו coelenterazine המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 482 ננומטר השיא.
  12. לאחר קריאת, ללכת על "תחזוקה Dispenser 'ובחר' ריק 'ו Pump1 לשחרר את כל הפתרון שיורית חזרה הצינור.
  13. עכשיו להעביר את צינור לצינור בז המכיל מים לתקתק "פלאש".
  14. לאחר שלב השטיפה לרוקן את הצינור על ידי בחירת 'ריקה'.
  15. מניחים את הצינור מתוך Pump1 בתוך הצינור חיץ התגובה הבז ואת אחד מן Pump2 בצינור luciferin בז.
  16. שינוי הפריסה צלחת.
  17. בחר "מלא" עבור Pump1 ו Pump2 מ 'דיספנסר תחזוקה "בתפריט.
  18. בחר את הפרוטוקול ואת תחילת הקריאה. התגובה בין בלוציפראז Firefly ו luciferin המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 560 ננומטר השיא.
  19. בסוף הקריאה לחזור על התהליך בידיים ריקות, ריקון עבור Pump1 ו Pump2.
  20. תוצאות זמינים כעת ב 'Wallac 1420 Explorer ".
  21. כל הניסוי קשורה למספר assay, שם משתמש, להתחיל ולסיים תאריך.
  22. תוצאות כעת ניתן לייצא כקובץ Excel.
  23. עבור חישובים, התאים מתחלקים לשלוש קבוצות: 1. לא בהלם התייחסות דגימות (כמפורט 100% וקיפלתי גחלילית בלוציפראז); 2. תאים ללא המלווה בחום מולקולרית בהלם; 3. תאים עם המלווה בחום מולקולרית בהלם.

6. נציג תוצאות

Refolding חלבון קשורה ישירות הזמן של ההתאוששות ולכן כדי לבדוק אם המערכת עובדת הפרו perly, assay צריך להתבצע איסוף התאים בנקודות זמן שונות. קשר ישיר זמן / אחוז refolding מציין כי הניסוי שבוצעה כהלכה, ולכן מהווה גורם מגביל. עם זאת, יש להתייחס תמיד refolding לאחר הלם החום הוא אירוע להרוות ולכן ניתוח תקין כמובן זמן יש לבצע לפני תחילת כל ניסוי.

figure-protocol-1
באיור 1. סקירה של הניסוי. ב assay refolding vivo דורש 3 עד 4 ימים להסתיים. ביום 1 תאים seeded ו transfected. תאים למחרת הם splitted לפורמט קטן יותר ביום 3 הם חום בהלם. בשלב זה ניתן לבצע את assay בלוציפראז מיד לאחר קצירת התאים או לשמור את תא גלולה ב -80 ° C ו לבצע את assay עוד רגע

_content "> figure-protocol-2
באיור 2. חלוקת התא. ביום 2 תאים מחולקים צלחת 6 באר. כל transfection יהיה מדולל היטב על מנת לקבל את כל transfection בצלחת אחת. כל צלחת יתאים זמן החלמה מסוים בתוספת צלחת ללא התייחסות בהלם.

figure-protocol-3
באיור 3. תוצאה טובה נציג. שיעור א 'של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות גחלילית בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר (קו שחור) ובנוכחות (הקו האדום) של המלווה. ערכי r בריבוע עולה מתאם טוב.

ב Fig.3A מוצג תוצאות נציג שבו תאים שנאספו דקות 15, 30, 45, 60 ו - 120 לאחר הלם החום בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרית. אחוז וקיפלתי מגביר בלוציפראז עם זמן החלמה ממושך עם transfection של המלווה המולקולרית. המתאם בין refolding זמן לשליטה (איור 3B, קו שחור) לבין המלווה המולקולרי-transfected התאים (איור 3B, קו אדום) מוצגת.

figure-protocol-4
איור 4. תוצאה רעה נציג. שיעור א 'של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר ובנוכחות (אדום line) של המלווה. הערכים מצביעים על מתאם r בריבוע רע.

איור 4 א. מראה תוצאה נציג של ניסוי לא ביצע כראוי. גם הביקורת (פסים שחורים) לבין המלווה המולקולרי-transfected תאים (ברים אדומה) לא הראה עלייה חלבון refolding עם הזמן. בנוסף, transfection של המלווה המולקולרי לא הביא לעלייה של refolding. מתאם זה עני הוא אישר באיור. 4B מראה ערך r בריבוע של 0.6619 ו 0.1882 בהתאמה לשליטה (קו שחור) המולקולרית המלווה-transfected תאים (קו אדום).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו בפרוטוקול כדי למדוד את פעילות refolding תאיים של מלווים מולקולרית מוצג. Assay כולו ניתן לבצע 3 עד 4 ימים כפי שמוצג על ידי סקירה של איור. 1.

עמידות ליניאריות של אות אור המיוצר על ידי גחלילית ואת בלוציפראז renilla מהווים בסיס מוצק עבור שחזור של הפרוטוקול.

השלב הקריטי של assay היא הבחירה של מגיב transfection יעיל על מנת ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנילו מדלו הוא מקבל מלגת מחקר כמו קבוצת לחוקר הצעיר (YIG) מהמכון הטכנולוגי של קרלסרוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

לצורך ניסוי זה "אור וקטור" צורה Luminometer פרקין אלמר '1420 הארה מונה שימשה

תוכניות Luminometer:

Renilla: משאבה 1, 100 הזרקה μl

מאגר התגובה: Pump1, 70 הזרקה μl

Luciferin: Pump2, הזרקת 30μl

עבור מאגרים להכין פתרונות אלו המניות מים מזוקקים כפול:

  • - 1M MgSO 4: 246,48 גרם MgSO 4 * 7H 2 O ב 1 ליטר
  • - 0,5 M EGTA: 190,18 גרם EGTA ב 1 ליטר
  • - 1M KH 2 PO 4: 136,09 גרם KH 2 PO 4 ב 1 ליטר
  • - 1M K2 HPO 4: 228,23 גרם K 2 HPO 4 * 3H 2 O ב 1 ליטר
  • - NaCl 5M: 292,2 גרם NaCl ב 1 ליטר
  • - 0,5 M EDTA: 186,12 גרם EDTA * 2H 2 O ב 1 ליטר  

גלאי, גלאי-חיץ:

  • - 25mm Glycylglycin
  • - 15mm MgSO 4
  • - 4 מ"מ EGTA

עבור 1 ליטר להשתמש 3,3 גרם Glycylglycin, 15 מ"ל של פתרון MgSO4 1M ו 8ml של פתרון 0,5 EGTA ז. לפתור במים, כדי להתאים את pH 7,8 ומביאים בהיקף כולל של 1 ליטר.

תגובת חיץ חיץ עבור Renilla / Coelenterazine:

  • - & Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4
  • - 86,6 mM KH 2 PO 4
  • - 0.5 M NaCl
  • - 1mm EDTA

עבור 1 מ"ל להשתמש 13,4 ליטר פתרון 1M KH 2 PO 4, 86,6 מ"ל של פתרון 1M K 2 HPO 4, 100 מ"ל של תמיסת NaCl 2ml 5M של פתרון 0.5 EDTA M.

חברה קטלוג / מספר מוצר:
DMEM (השתנה Dulbecco הנשר בינוני 1X) GIBCO 41966029
עוברית זהב בסרום שור PAA ת 15-151
X-treme ג'ין 9
Transfection DNA מגיב 		רוש 06365809001
PBS
פוספט של Dulbecco בופר 1X 		GIBCO 14190-094
מגבים
3 - (N-Morpholino) Propanesulfonic חומצה 		Sigma-Aldrich M1254
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
תמוגה הצפת פסיבי 5X Promega E194A

Glycylglycin
EGTA
MgSO 4 (4 * MgSO 7H 2 O)

Sigma-Aldrich
רוט
רוט 		G7278
3054.2
P027.1

KH 2 PO 4
K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O)
NaCl
EDTA

רוט
רוט
רוט
רוט 		3904.1
6878.2
3957.1
8043.1
Luciferin Firefly ביוסינט L8200
Coelenterazine ביוסינט C7000
DTT (Dithiothreitol) רוט 6908.2
ה-ATP (אדנוזין טריפוספט) רוש 10519987001

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
  2. Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
  3. Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
  4. Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
  5. Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
  6. Whitesell, L., Lindquist, S. L. HSP90 and the chaperoning of cancer. Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).
  7. Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. 17-AAG: mechanisms of antitumour activity. Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).
  8. Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
  9. Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
  10. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
  11. Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
  12. Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
  13. Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Intracellular Refolding AssayMolecular Chaperone ActivityLuciferase Reporter SystemHeat Shock RecoveryProtein Refolding MeasurementHEK 293 Cell TransfectionCycloheximide TreatmentFirefly Luciferase AssayRenilla Luciferase ControlX treme Gene Reagent

מאמרים קשורים