ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Summary

שיטה זו מאפשרת ניטור של תאים בזמן אמת מדידות כמותיות של פרמטרים שונים הגירה סלולריים כגון מהירות, תזוזה, ומהירות. שלא כמו שיטות מסורתיות, גישה זו בזמן אמת אינה מבוססת על מדידות כמותיות נקודות קצה הגירה, אלא היא מאפשרת ניטור חישוב פרמטרים שונים ברציפות.

Abstract

נדידת תאים היא תהליך דינמי, וזה חשוב עבור ההתפתחות העוברית, תיקון רקמות, בתפקוד המערכת החיסונית, וכן הפלישה הגידול ^{1, 2.} במהלך הנדידה כיוונית, התאים לנוע במהירות בתגובה האות chemotactic תאיים, או כתגובה לאותות פנימיים הניתנים על ידי ³ מכונות תנועתיות בסיסי. הגירה אקראית מתרחשת כאשר תא בעל כיווניות פנימי נמוך, מה שמאפשר לתאים לחקור את הסביבה המקומית שלהם.

נדידת תאים היא תהליך מורכב, בתא התגובה הראשונית עובר קיטוב ומרחיב בליטות לכיוון ההגירה ^2. השיטות המסורתיות למדידת הגירה כגון assay הגירה בוידן קאמרית היא שיטה קלה למדידת chemotaxis במבחנה, המאפשרת מדידת הגירה כתוצאה נקודת הסיום. עם זאת, גישה זו לא מאפשרת מדידה של פרמטרים הגירה בודדים, וגם לא מאפשרים visualization של שינויים מורפולוגיים כי התא עובר במהלך ההעברה.

כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת לנו לעקוב אחר תאים נודדים בזמן אמת באמצעות וידאו - פקיעה מיקרוסקופיה זמן. מאז נדידת תאים ופלישה הם סימני ההיכר של סרטן, שיטה זו יחולו בחקר תאים סרטניים הגירה הפלישה במבחנה. הגירה אקראי של טסיות כבר נחשב לאחד הפרמטרים של ⁴ תפקוד טסיות, ולכן שיטה זו יכולה גם לעזור בלימוד פונקציות הטסיות. Assay זה יש את היתרון של להיות מהיר, אמין, לשחזור, ואינו דורש אופטימיזציה של מספרים סלולריים. כדי לשמור על תנאים מתאימים פיזיולוגית של תאים, מיקרוסקופ מצויד אספקת ₂ CO ו התרמוסטט לטמפרטורה. תנועת התא מנוטר על ידי צילום תמונות באמצעות המצלמה מצויד המיקרוסקופ במרווחי זמן קבועים. נדידת תאים ניתן לחשב את המהירות הממוצעת על ידי מדידהעקירה שות ל מוצע נפ, המחושב על ידי תוכנה Slidebook.

Protocol

1. הכנת צלחת מצופה קולגן

1. לדלל קולגן לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב Opti-ממ התקשורת.
2. מעיל 6 צלחות גם עם קולגן, על ידי הוספת 1.5 מ"ל משלב 1 זה גם כן. דגירה בין לילה ב 4 ° C.
3. למחרת, לשטוף את הצלחת 2 פעמים עם פוספט 1x שנאגרו מלוחים (PBS) ולאחסן אותן ב PBS.

2. תא הכנה זריעה על צלחת 6 גם

הערה:....

Discussion

בזמן אמת אקראי assay הגירה מאפשרת מדויק, ניתוח רגישות, של הגירה פרמטרים סלולריים כגון מהירות תזוזה. שיטה זו אינה מצטמצמת אך בסופו של דבר המדידה ערך הנקודה, ולכן הוא כמותי יותר. מאז, תאים מנוטרים במדיום DMEM רגיל עם סרום, זה מפחית את ההשפעה המזיקה של הדגירה כבר תקשורת חופשית בסרום. הוכח כי הגירה של תאים תלויה עיצוב ושבירת קשר סלולריים עם תשתית ^8, אם כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של מתחת לקרקע שונות על הגירה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	תאומים ביו מוצרים	100-106
Opti-ממ	Invitrogen	31985-070
קולגן	BD	354231
מיקרוסקופ עם תא תא חי & אוטומטי בקר XY הבמה	אולימפוס	Olympus 1X81
איכות הסביבה קאמרית	נויה	נויה חיים לשכת Cell	שלנו יש מנהג בנוי מלבני זכוכית הלוח העליון של אופטיקה המתאימה דרך החלק העליון של החדר. צורה מלבנית להכיל רב גם צלחות המשמשים רבים experimen שלנוTS.
אוטומטי לשלב XY	קודם	לפני Proscan	זה מאפשר חזרה מדויקת להכפיל עמדות XY שנבחרו במהלך מיקרוסקופיה זמן לשגות.
מצלמה		Hamamatsu EM המצלמה C9100
תוכנה	נרכש בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ הספק כגון אולימפוס	Slide ספר 5