מערכת 3D של האדם culturing chondrocytes במפרק ברמות גבוהות של נוזל סינוביאלי מתואר. הנוזל הסינוביאלי משקף את microenvironment הטבעי ביותר עבור הסחוס במפרק, וניתן להשיג בקלות ומאוחסנים. מערכת זו ולכן יכול לשמש ללימוד התחדשות הסחוס ועל הרפוי ההקרנה לטיפול בדלקת מפרקים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי
במאמר זה
סיכום
תקציר
הרס הסחוס היא תכונה מרכזית פתולוגי של דלקת מפרקים ניוונית, הסיבה המובילה למוגבלות בארה"ב. הסחוס הבוגר אינו מחדש ביעילות רבה in vivo, וכתוצאה מכך, דלקת מפרקים ניוונית גורמת לאובדן בלתי הפיך סחוס מלווה כאבים כרוניים 1,2 תנועה. הנדסת רקמות סחוס מציעה פוטנציאל מבטיח להתחדש ולשחזר תפקוד הרקמה. טכנולוגיה זו כרוכה בדרך כלל chondrocytes זריעת לתוך פיגומים טבעי או סינתטי culturing 3D וכתוצאה מכך לבנות בינוני מאוזן על פני תקופה של זמן עם מטרה של הנדסת רקמות ביוכימית ובוגרת biomechanically כי ניתן להשתיל לתוך האתר פגם in vivo 3-6 . השגת מצב אופטימלי לצמיחה chondrocyte בתצהיר מטריצה היא חיונית להצלחה של הנדסת רקמות הסחוס.
ב סחוס חלל יליד משותף, בבית ארטיקתואר בלבד משטח עצם טובל הנוזל הסינוביאלי. זה נוזל שקוף וצמיג מספק חומרים מזינים הסחוס במפרק avascular והוא מכיל גורמי גדילה, ציטוקינים ואנזימים חשובים לחילוף חומרים chondrocyte 7,8. יתר על כן, נוזל סינוביאלי מאפשר חיכוך נמוך התנועה בין משטחי הסחוס בעיקר באמצעות הפרשת שני מרכיבים מרכזיים, ואת hyaluronan lubricin 9 10. לעומת זאת, הסחוס ורקמות מהונדסים תרבותי לרוב בתקשורת מלאכותית. בעוד כלי התקשורת הללו עשויים לספק תנאים מוגדרים יותר לחקר מטבוליזם chondrocyte, נוזל סינוביאלי ביותר ומשקפת את הסביבה הטבעית של chondrocytes במפרק אשר מתגוררים בה
ואכן, נוזל סינוביאלי יש את היתרון של להיות קל להשיג חנות, לעתים קרובות ניתן מתחדש באופן קבוע על ידי הגוף. כמה קבוצות יש להשלים את המדיום תרבות עם נוזל סינוביאלי בגידול האדם ארנב, שור והכלב גhondrocytes, אך משמש בעיקר רק רמות נמוכות של נוזל סינוביאלי (מתחת ל 20%) 11-25. בעוד chondrocytes, עוף סוס האדם כבר בתרבית בינוני עם אחוז גבוה יותר של נוזל סינוביאלי, מערכות אלה התרבות היו דו מימדי 26-28. כאן אנו מציגים את השיטה שלנו של כונדרוציטים culturing האדם במפרק במערכת 3D עם אחוז גבוה של נוזל סינוביאלי (עד 100%) על פני תקופה של 21 ימים. בעשותו כן, התגברנו משוכה העיקריים שהוצגו על ידי צמיגות גבוהה של נוזל סינוביאלי. מערכת זו מספקת את האפשרות ללמוד chondrocytes האדם הנוזל הסינוביאלי בסביבה 3D, אשר יכול להיות משולב עם עוד שני גורמים חשובים אחרים (מתח חמצן טעינה מכני) 29,30 המהווים את הסביבה הטבעית של הסחוס לחקות את הסביבה הטבעית סחוס הצמיחה. יתר על כן, מערכת זו יכולה לשמש גם עבור assaying פעילות הנוזל הסינוביאלי על chondrocytes ולספק פלטפורמה לפיתוחסחוס התחדשות טכנולוגיות אפשרויות טיפוליות עבור דלקת פרקים.
פרוטוקול
מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי
בעבודה זו, אנו במארז chondrocytes במפרק האדם חרוזים אלגינט באמצעות ייצור שונה, הציע אנקפסולציה פרוטוקול (Lonza, ו 31). באמצעות אלה בונה 3D, פיתחנו מערכת של תאים culturing במדיום תרבות המכיל אחוזי מגוונת של נוזל סינוביאלי אנוש העריכו אלה בונה 3D עבור ביטוי גנים הסחוס.
1. הכן chondrocytes במפרק האנושי (HAC) אנקפסולציה (3D) תלת מימדי
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בדו"ח זה, פיתחנו שיטה המאפשרת התרבות של כונדרוציטים במפרק האדם בסביבה 3D במדיום המכיל ריכוז גבוה של נוזל סינוביאלי האדם. הנוזל הסינוביאלי הוא אחד הרכיבים העיקריים המהווים את הסביבה הטבעית בחלל משותף, שבו מתגוררים chondrocytes במפרק. עם זאת, את הצמיגות של הנוזל הסינוביאלי כבר אתגר גדול עבור culturing לטווח ארוך תלת ממדי של כונדרוציטים. כדי להתגבר על האתגר של שמירה אפילו הפצה מזין ב צבירה מבנה בסביבה צמיגה ולמנוע 3D, שמנו בונה סחוס תחת תנועה מתמדת עם נדנדה עדין. כדי לשפר את השל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו שום דבר לגלות.
תודות
ברצוננו להודות רובין ניי (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura ודנה Cairns (Tufts University) למתן עזרה עם אחסון נוזל סינוביאלי ו צנטריפוגה. עבודה זו מומנה על ידי NIH (1R01AR059106-01A1) עבור LZ
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
טבלה של חומרים כימיים ספציפיים ציוד:
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
|---|---|---|---|
| אלגינט (מלח נתרן Alginic חומצה) | סיגמא | A2158-250 | פתרון 2.4% המאוחסן ב 40 ° C |
| סידן כלוריד Dihydrate, גרעיניים | JT בייקר | A19339 | |
| צמיחה התקשורת Chondrogenic | Lonza | CC-3156 (הבסיס מדיה) | |
| CC-4409 (תוספת) | |||
| בידול מדיה Chondrogenic | Lonza | CC-3226 (הבסיס מדיה) | |
| CC-4408 (תוספת) | |||
| במפרק chondrocytes האדם | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4 ',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy מיני קיט (להפקת RNA) | Qiagen | 74104 | |
| PCR ריאגנטים: SYBR ירוק | Quanta | 95053-500 | |
| 12 מ"ל במזרק | טייקו, קנדל-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague מחט המזרק | Tyco-קנדלl-Monoject | 8881 | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | IX71 | |
| פלטפורמה נדנדה | Thermoscientific thermolyne | Vari-לערבב | |
| Primers רצפים | |||
| קולגן IIa קדימה | 5'-TTC ATC המרכז לאמנות עכשווית CCC TCT AGT CAC-3 " | ||
| קולגן IIa-הפוכה | 5'-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3 " | ||
| MMP13 קדימה | 5'-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3 " | ||
| MMP13-הפוכה | 5'-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3 " | ||
| Caspase 3-קדימה | 5'-TCA tta TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3 " | ||
| Caspase 3-הפוכה | 5'-ATG TGG AAC החטיבה GAG המרכז לאמנות עכשווית TCC TTT -3 " |
מקורות
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
