שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית: Ex vivo RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

סיכום

לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות לשעבר vivo Electroporation של פלסמידים שיתוף להביע RNA מעכבות (RNAi) ו-GFP בקליפת המוח העוברי murine. פרוטוקול זה הוא מקובל בחקר היבטים שונים של neurodevelopment כגון neurogenesis, העברה עצבית ו המורפוגנזה העצבית כולל דנדריט ו תוצאה האקסון.

תקציר

קליפת המוח מכוון את התפקודים הקוגניטיביים. מבנה זה 6 שכבות נוצרת באופן בפנים ואחת בחוץ, האחרון, שבו הנוירונים הראשונים שנולדו להישאר קרוב יותר החדר ואילו נוירונים שנולדו האחרונות להעביר בעבר הנוירונים שנולדו הראשונים לקראת פני השטח של המוח ^1. בנוסף העברה עצבית ^2, תהליך מפתח לתפקוד קליפת המוח הנורמלי הוא הסדרת המורפוגנזה עצבית ^3. בעוד המורפוגנזה עצבי ניתן ללמוד במבחנה בתרבויות העיקריות, יש הרבה מה ללמוד מהדרך שבה תהליכים אלה מוסדרים בסביבות רקמות.

אנו מתארים טכניקות לניתוח ההגירה העצבית ו / או המורפוגנזה של פרוסות organotypic של קליפת המוח ^4,6. וקטור pSilencer שונה משמש המכיל גם מקדם U6 שמניע את RNA כפולים חדים תקועים ואת קלטת ביטוי נפרד המקודד חלבון ה-GFP מונע ביה CMV האמרגן ^7-9. הגישה שלנו מאפשר הערכה מהירה של ליקויים תוצאה neurite על מציאה מסוים של גנים מועמדים ונעשה בו שימוש בהצלחה המסך של הרגולטורים של תוצאה neurite ^8. כי רק קבוצת משנה של תאים יביע המבנים RNAi, את פרוסות organotypic לאפשר ניתוח פסיפס של פנוטיפים פוטנציאליים. יתר על כן, כי ניתוח זה נעשה אומדן של קרוב בסביבה vivo, הוא מספק עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או נוק אאוט לגנים של תפקוד קליפת המוח ידוע. לבסוף, בהשוואה בטכנולוגיה electroporation vivo, את ההצלחה של הניסויים electroporation לשעבר ב vivo אינה תלויה בפיתוח ניתוח מיומן מיומנות ניתן לבצע עם זמן אימון קצר ומיומנות.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות תרבות ותקשורת (לא וידאו)

1. הכן 1 ליטר תמיסת מלח מאוזנת האנק של השלם (HBSS) המכיל HBSS 1x, 2.5 מ"מ (Hepes pH7.4), 30 מ"מ D-גלוקוז, 1 mM CaCl _2, 1 mM MgSO ₄ ו 4 מ"מ NaHCO _3. להוסיף מים מזוקקים פעמיים (DDH ₂ O). סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר, וחנות ב 4 ° C.
2. הכן את התרבות פרוסת בינוני באמצעות 35 מ"ל בסל בינוני איגל התקשורת, 12.9 מ"ל של HBSS מלא, 20 מ"מ D-גלוקוז (1.35 מ"ל של תמיסת M 1), 1 mM Glutamax (0.25 מ"ל של תמיסת 200 מ"מ), 0.5 מ"ל של פניצילין סטרפטומיצין-100x המניות. סנן לעקר עם מסנן 0.2-מיקרומטר, ולאחר מכן להוסיף חום מומת סוס סרום לריכוז הסופי של 5%.
3. הכן פתרון Laminin עובד על ידי הפיכת 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון Laminin המניה עם מים סטריליים deionized מזוקקים. הכן 100 aliquots μL ב 0.5 מ"ל צינורות eppendorf ולהקפיא ב -80 ° C.
4. הכן פולי-L-ליזין עובד כל כךlution ידי הוספת 5 מ"ל סטרילי H ₂ O ל 5 מ"ג של פולי-L-ליזין לעשות 1 מ"ג / מ"ל פתרון המניות. הכן 1 aliquots מ"ל ו ההקפאה ב -20 ° C.
5. הכן פתרון הציפוי על ידי דילול 1 מ"ל של פולי-L-ליזין 100 μL של laminin לנפח סופי של 12 מ"ל עם מים סטריליים. להפוך את הפתרון הזה טריים בכל פעם.

2. הכנת הוספת פורסים Organotypic (לא וידאו)

1. הכן שתי שש גם צלחות עם הוספת 1 לכל תרבות גם באמצעות מלקחיים סטריליות. הוסף 2 מ"ל סטרילי DDH ₂ O מתחת מוסיף תרבות.
2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ציפוי על גבי קרום נזהר שלא לנקב את קרום. דגירה לילה חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. הסר מדיה ציפוי ולשטוף עם קרום סטריליים H ₂ 0 3 פעמים. בואו מוסיף יבש לפני השימוש. הוסף 1.8 מ"ל של מדיום פרוסת תרבות מקום 37 ° C חממה. לעטוף את הצלחות בשימוש עם Parafilmוחנות ב 4 ° C עד 4 שבועות.

3. הכנות לקראת electroporation (לא וידאו)

1. הכן בונה RNAi עבור electroporation. כפולות גדיל רנ"א מוסיף חדים היו משובטים לתוך וקטור pSilencer. מכיל פלסמיד: 1) מקדם U6 שמניע את הדור גדיל RNA כפול, ו 2) קלטת ביטוי GFP מונע על ידי האמרגן CMV ^8,9. פלסמיד זה תוארה קודם לכן על ידי קונישי ועמיתיו ⁹ ועוד ^7,8. פלסמידים הם מטוהרים באמצעות ערכת maxi-Prep Qiagen, ולהשתמש בהם בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.
2. כדי להמחיש DNA תוך הזרקת אותה, להכין את הצבע 0.5% במהירות פתרון ירוק ולהשתמש בו ב 1:20 עם ה-DNA להיות מוזרק (בדרך כלל 20 μL של ה-DNA עם μL 1 של ירוק מהיר). שאריות DNA מהיר צבע תערובת ירוקה ניתן לאחסן ב -20 ° C עד שבוע.
3. ביתור השטח נקי, dissectiכלי נג ו כלי vibratome עם אתנול 70%. לצנן HBSS מושלמת כל כך קר קרח. צ'יל vibratome כלי בידי אריזה קרח סביבו בתוך vibratome עם מעט מים לקירור מהיר. הכן 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose באמצעות HBSS שלמים. מיקרוגל דקות 1. הימנע מעל רותחים. לשמור על 42 מעלות צלזיוס waterbath עד לשימוש.
4. Electroporation פרמטרים מוגדרים באופן הבא. עבור E15 השימוש העובר 35 V, 5 פעימות, 100 מרחק MS, MS 900 במרווחים בין הפולסים. בעלי חיים גדולים יותר, כדי להבטיח electroporation, השתמש מתח גבוה עד 50 V או להגדיל את מספר פעימות עד 8 פעימות. כדי למנוע נזק לרקמות אצל בעלי חיים צעירים יותר, השתמשו בפולסים או פחות או עד 2 קטניות מתח נמוך עד 25 ו 'פרמטרים אלה עשויים להיות מגוונים וקבע באופן אמפירי בהתאם לגיל של בעל החיים.

4. דיסקציה ו electroporation (וידאו)

1. לאחר והרדמת חסד נשים בהריון, לנתח עוברים אל HBSS קרח שלמים. קהפרק אחד העובר בתוך שקי שליה האישיים שלהם.
2. לנתח את העובר ולנתק את הראש אחרי החוליה הראשונה. לשמור על HBSS קרח שלמים.
3. להזרקה, הצב את הראש על פיסת Parafilm על גבי צלחת פטרי. שימוש בהתאמה אישית המילטון במזרק (ראה לוח ט) להזרים כ 6-8 μL של ה-DNA: מהיר תערובת צבע ירוק דרך החדר השלישי כדי למלא את שני החדרים הצדדיים של שלפוחית ​​קליפת המוח. לחלופין, ניתן לעשות הזרקה ישירות לתוך החדר כל לרוחב.
4. עבור electroporation vivo לשעבר, השתמש BTX-פינצטה אלקטרודות פלטינה. מניחים את האלקטרודה החיובית כלפי הצד של קליפת אתה רוצה electroporate העליון של הראש כלומר על קליפת המוח הגב.
5. לאחר electroporation, דגירה ראשי על קרח דק 'לפחות 5 לפני הניתוחים.
6. לנתח מוחות של HBSSby קרה כקרח עושה חתך קטן בצד של הראש לקלף את עור בצידי הראש. לאחר מכן, עםמלקחיים עדינים לקלף בעדינות והפיה מהמוח. הסר את המוח ללא פגע מן הגולגולת, נזהר שלא לפגוע בקליפה.

5. הטבעת ואת חתך של קליפת המוח Electroporated (וידאו)

1. להעביר 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose לתוך תבנית גדולה מונחת על קרח. תחתית התבנית יתחיל לגבש מהר יותר אשר ימנע מן המוח שוקע לתחתית של התבנית. בעדינות, להעביר את המוח עם מלקחיים יפים אחד אחד לאחר הסרת עודפי חיץ עם Kimwipe או נייר פילטר. השתמש עצה 10 pipet μL כדי לערבל את המוח בתוך התבנית על מנת להבטיח ממשק מרבי בין agarose ורקמות במוח.
2. המזרח המוח כדי לוודא שכל המוחות הם בכיוון זהה וברמה על אותו agarose. בואו agarose לחזק דקות בערך 5. השתמש דבק מלכד (דבק מטורף) לצרף את אבני agarose כך נורות חוש הריח הם בעמידה. לאחר אבני מחוברים, מיד מוסיפים אנילספירה HBSS קרים וקוצצים את agarose לעשות פרוסות בודדות בטוח מתקבלים על המוח כל אחד.
3. לחתוך את אבני, קבע מהירות של vibratome למהירות נמוכה (כ 1/2 לכל היותר) ולקבוע את תדירות הרטט להב על ההגדרה הגבוהה ביותר. צור -250 מיקרומטר פרוסות עבות העטרה. אחזור פרוסות בעזרת מרית בסדר כפוף ולהעבירם בארות רקמות עם מברשת או מלקחיים בסדר.
4. בשכונה תרביות רקמה, להעביר את פרוסות לתוך מוסיף מצופים. הוספת 500 μL של התקשורת והתרבות פרוסה כדי להוסיף כל לעשות העברה קלה. עד 5 פרוסות יכול להיות ממוקם בכל הוספה. הסר מדיה עודף מהחלק העליון של הפרוסות ואת דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified.

6. תרבות וניתוח של פרוסות Organotypic (וידאו)

1. כדי לשמור על פרוסות בריאים, מדיה טריים יש להוסיף לפחות פעם ביומיים מתחת קרום ידי החלפת מחצית התקשורת בכל פעם.
2. על מנת לנתח את פרוסות אחרי Dימים esired בתרבות, לתקן את הפרוסות הממברנה. לשטוף עם חיץ 1x מלוחים פוספט (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, לתקן עם Paraformaldehyde 4% (PFA) לילה ב 4 מעלות צלזיוס או שעה 1 בטמפרטורת החדר.
3. פרוסות ניתן לנתח עם סמנים תאיים שונים או מוכתמים Hoechst לבד לדמיין תאים electroporated ולא electroporated. Permeabilize ולחסום פרוסות של 2 שעות בטמפרטורת החדר עם סרום עיזים 10%, טריטון 0.1% ב 1x PBS עם טלטול עדין.
4. כתם עם Hoechst עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר, לשטוף 3 פעמים עם 10 דקות 1x PBS פעם עם טלטול עדין.
5. לעלות פרוסות לחתוך את הקרום עם אזמל, ולהשתמש מלקחיים עדינים להעביר את הקרום המכיל פרוסות זכוכית חלבית מחליק בתא מים. עד 5 פרוסות יכול להיות ממוקם בכל שקופית זכוכית. הסרה של עודפי מים, ולהוסיף טיפה של פתרון Flourmount על כל פרוסה המוח. בעדינות להניח coverslip על גבי פרוסות המוח ולהסירy בועות אוויר. ניתוח פרוסות באמצעות מיקרוסקופ confocal.

7. פרפין הטבעת אלטרנטיבית של פרוסות Organotypic (לא וידאו)

1. פרוסות Organotypic יכול גם להיות מוטבע על פרפין לניתוח עדין מורפולוגי, לשם כך הקרום המכיל את פרוסות organotypic יכול להיות קבוע ב 4% PFA כמתואר לעיל.
2. הפרוסות קבועים המוטבעים 1% agarose (לפני לחמם 37 ° C), ביסוס בקרח למשך 30 דקות. אבני agarose אז יכול להיות שלאחר קבוע PFA 4% על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. בלוק agarose המכיל פרוסת organotypic לאחר מכן ניתן יהיה מוטבע פרפין ומעובד immunofluorescence כפי שתואר קודם לכן ^10.

8. נציג תוצאות

ייצוג שבתרשים של electroporation של קליפת התרבות Murine של פרוסות organotypic מוצג באיור 1. שיטה זו היא אסטרטגיה יעילה אונסיד הערכת תפקוד של גנים המעורבים בהתפתחות עצבית ^11. בהתאם לכמות ה-DNA electroporated ואת השלב העוברי על electroporation, יעילות transfection ישתנו. פרוסות יתחיל להביע את ה-GFP לפחות 8 שעות לאחר electroporation ותאי יעבור את הרצף הרגיל של אירועים neurogenic (התפשטות, הגירה, והבחנה עצבית מוקדמת) בתרבות. תרשים 2 מציג פרוסת המוח electroporated כי הוא מביע ביקורת pSilencer-GFP וקטור ניתן לראות אבות נוירונים, הנוירונים נודדים נוירונים הבדיל ב פרוסה. פרוסות Organotypic ישמור המורפולוגיה שלהם כל עוד הם נשמרים בממשק התקשורת אוויר טוב על הקרומים וניתן להשתמש בו עד לפחות 5 ימים בתרבות.

באיור 1. איור של electroporation vivo לשעבר ואת פרוסת organotypicassay תרבות. E14.5 עוברים הם גזור החוצה, והזריקו בנפרד כדי להמחיש את האתר עם ​​הזרקת ה-DNA מעורבב עם צבע ירוק ומהירה. ה-DNA ניתן להזריק בשני החדרים הצדדיים כמו מתואר באיור או החדר השלישי כדי למלא את החדרים הצדדיים. לאחר ההזרקה, המוח הם electroporated electroporator עם גל מרובע, הצבת אלקטרודה חיובית בצד הרצוי של המוח. המוח המוטבעים 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose ו מחולק באמצעות vibratome. 250 פרוסות המוח מיקרומטר ממוקמות על 0.4 מיקרומטר מוסיף ותרבותיים עד שבוע. GFP ניתן לראות לאחר 8 שעות transfection הודעה.

איור 2. ניתוח של פרוסות המוח electroporated. פרוסות המוח Electroporated הוכתמו על Hoescht. קליפת המוח הגב מראה אבות עצביים electroporated על אזור חדרית (VZ). נוירונים קורטיקאל צלחת (CP) הם תחום אזור שוליים (MZ). חיצים לבנים מראים נוירונים נודדים. במקרה זה, המוח הוזרקו ב E15.5 ו electroporated עם וקטור בקרת pSilencer GFP. קטעים מייצגים explants קורטיקליים 4 ימים לאחר electroporation. בר בהיקף 100 מיקרומטר.

פתרון בעיות:

1. יעילות נמוכה transfection: התאם את הריכוז של ה-DNA משמש מיקרוגרם לפחות 1 / μL. השתמש תמיד ב-DNA נקי מאוד הכנה מקסי אם השימוש צורך אנדו ללא Quiagen ערכת לטהר את ה-DNA.
2. תאים transfected באזור המוח שונה מהרצוי 1: ודא אלקטרודות ממוקמים בצורה נכונה עם מיקום האלקטרודה החיובית כלפי צד של המוח לקבל electroporated.
3. פרוסות Organotypic לאבד את המורפולוגיה: התקשורת שנה כל יום ולהבטיח הפרוסות לא צף בתקשורת
4. פרוסות יורד agarose כפי שהם נמצאים לחתוך vibratome: ודא כי ממשק טוב הוא עשה כאשר הטבעה במוחם של היתוך נמוכה נקודת agarose.

דיון

שיטות אלה מעורבים electroporation vivo לשעבר של פלסמידים קידוד כפולה גדילי RNA סיכות ראש ⁸ והתרבות של פרוסות organotypic ⁴ מספקים מספר יתרונות בולטים. ראשית, שיטות אלו מאפשרים הערכה מהירה של RNAi הנגזרות פנוטיפים. הכללתו של ה-GFP קלטת קידוד ביטוי וקטור pSilencer אותו המכיל מקדם U6 שמניע את סיכת ראש כפול גדילי RNA מאפשר זיהוי ואפיון מהיר של תאים electroporated עם וקטור RNAi. בנוסף ליעילות בזמן, שיטות אלה הם מאוד חסכונית בהשוואה לדור של קווי בנוקאאוט מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
המילטון המזרק	המילטון	80008	31 מד, 0.5 סנטימטרים, PT-4 (רמת beveling נקודה), נפח 10μl
פלטינום tweezertrodes	BTX	45-0489	5 מ"מ גודל
ECM830 electroporator	BTX	45-0002
BTX Footswitch	BTX	45-0208	לשימוש עם electroporator ECM830
רוטט microtome להב	LEICA	VT1000 S
6 - מנה גם להשתמש עם מוסיף	FALCON	353502	מכיל חריצים כדי להתאים מוסיף
תרביות רקמה מוסיף	FALCON	353090	0.4 מיקרומטר
מהיר גרין	SIGMA	F7252
התכה נמוכה agarose	FISHER	BP165-25	ה-DNA כיתה
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
פולי-L-ליזין	Sigma-Aldrich	P5899
מדיום הבסיס Eagle	סיגמא אולדריץ'	B-1522
10x ללא Ca ו Mg HBSS	GIBCO	14180-046
HEPES ללא חומצה	Sigma-Aldrich	H4034