ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

סיכום

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

תקציר

מח העצם הוא האתר העיקרי שבו HSCs ובוגרת יותר כדוריות הדם אבות השושלת מתגוררים ולהבחין באורגניזם הבוגר. HSCs מהווים אוכלוסייה תא גזע pluripotent דקה של תאים המסוגלים לייצר את כל שושלות תאים דם בפעם חיים ^1. דיסקציה המולקולרי של הומאוסטזיס HSCs במח העצם יש השלכות חשובות hematopoiesis, אונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית. אנו מתארים את פרוטוקול סימון נוגדנים הניאון הליך gating אלקטרוני cytometry זרימת להבקיע תת אבות היווצרות הדם והפצה HSCs בעכברים בודדים (איור 1). בנוסף, אנו מתארים שיטה בהרחבה להעשיר אבות hematopoietic כמו גם לטווח ארוך (LT) ו לטווח קצר (ST) לשחזר HSCs מ אספו מח עצם השעיות התא על ידי העשרת המגנטי של תאים המבטאים C-Kit. הכנת התא וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי למיין תת שנבחרו במבחנהבמחקרים תפקודית ב vivo (איור 2).

שני osteoblasts trabecular ^2,3 ו ^-4 האנדותל סינוסי מהוות נישות תפקודית התומכים HSCs במח העצם. מספר מנגנונים בנישה osteoblastic, כולל משנה של N-cadherin ⁺ osteoblasts ³ ואינטראקציה של הקולטן טירוזין קינאז Tie2 לידי ביטוי HSCs עם angiopoietin-1 ליגנד שלה ⁵ מסכים בקביעת קפאון HSCs. "מצב שינה" במח העצם הוא חיוני כדי להגן על HSCs מ שכפול תשישות בסופו של דבר על פעילות רכיבה על אופניים יתר ^6. גירויים חיצוניים הפועלים על תאים של מערכת החיסון המולדת כגון חיוג כמו ligands הקולטן ⁷ ו אינטרפרון ^אלפא-6 יכול גם לגרום ריבוי והתמיינות של HSCs לתוך אבות מסורים השושלת. לאחרונה, אוכלוסיית HSCs עכבר רדומים בתוך לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 ⁺ CD150 ⁺ CD48 ^- CD34 ^- האוכלוסייה תוארה ^8. מיון של התאים על ביטוי CD34 מן ההשעיה אבות מועשר hematopoietic התא כמתואר כאן מאפשר בידוד של שניהם שוקט עצמית חידוש LT-HSCs ו ST-HSCs ^9. הליך דומה על דלדול של תאים החיוביים השושלת ומיון של LT-HSC עם CD48 ו Flk2 נוגדנים תוארה קודם לכן ^10. בדו"ח הנוכחי אנו מספקים פרוטוקול אפיון פנוטיפי ו vivo לשעבר לתא מחזור ניתוח של אבות היווצרות הדם, אשר יכול להיות שימושי עבור ניטור hematopoiesis בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. יתר על כן, אנו מתארים FACS מיון הליך HSCs, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להגדיר את גורמי ומנגנוני ויסות עצמי חידוש שלהם, הרחבת והבחנה בביולוגיה של התא התמרה מבחני אות כמו גם להשתלה.

פרוטוקול

1. הכנת תרחיף תאים ממח העצם

1. להרדים את העכבר ולמקם את בעל החיים בסיר נירוסטה ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל הגב. איסוף עצם הירך לבין עצם השוק מן הרגליים האחוריות, ואת עמוד השדרה.
2. להסיר את כל שאריות מדויק של רקמות רכות של עמוד השדרה עם מספריים קצה חד לבין מעצמות הרגליים עם גזה. חנות הכלים צינור 50 פלקון מ"ל עם 30 מ"ל של מדיום RPMI המכיל 10% מומת חום בסרום שור עוברית (FBS), השלימו עם 50 mercaptoethanol β-מיקרומטר, 100 מיקרומטר ממ לא חיוניות חומצות אמינו, 1 MEM mM פירובט נתרן, 2 mM L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 100 סטרפטומיצין U / ml פניצילין.
3. מכסים את תחתית מרגמה מעוקר בעבר עם מסנני סטריליים.
4. מעבירים את העצמות אל תוך המדוכה ומכסים אותם בשכבה של מסננים על מנת להרכיב שטח החיכוך.
5. הכן 50 מ"ל צינור פלקון מסופק עם מסנן פלקון.
6. לרסק את העצמותבעזרת העלי עד קבלת ההשעיה התא הומוגנית.
7. מעבירים את ההשעיה לתוך הצינור.
8. הוסף מ"ל מרגמה 5 של המדיום RPMI טרי שלם לכבס למסוק את התאים הנותרים.
9. חזור על שתי הנקודות האחרונות עד עצמות ומעורים נראה ברור.
10. להעביר ולסנן בצינור חדש ההשעיה התא כדי לחסל את פסולת ברקמות הנותרים.
11. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע תא גלולה.

2. פנוטיפי ניתוח

1. Resuspend ולשטוף בתאים של עכברים בודדים 15 מ"ל של PBS ו FBS 2%.
2. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
3. להשעות גלולה של 5 מ"ל PBS ו 2% FBS ותאי הספירה.
4. העברת 1 × 10 ⁶ תאים / גם בתחתית בארות 96 עגולצלחת.
5. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5.
6. להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם המצוין PBS ו - 2% FBS להכתים את התאים.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200
   • C-Kit מצומדות כדי APC 1:100
   • מצומדות כדי ביוטין 1:50 Sca1
   • מצומדות כדי FITC 1:50 CD34
   • מצומדות כדי PE 1:100 FcγR
   • IL-7R מצומדות ל PE-Cy7 1:100
7. מחק supernatant ולהוסיף 50 μL תמהיל מבז היטב כל אחד מהם. לנתק לתוך תאים בודדים ידי pipetting.
8. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
9. לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS.
10. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant ידי צלחת היפוך.
11. לדלל streptavidin ב PBS ו - 2% FBS כמצוין להכתים את התאים.
    • Streptavidin conjuמגודרת כדי APC-Cy7 1:300
12. הוסף 50 μL הפתרון היטב כל אחד מהם. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
13. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C.
14. לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS.
15. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
16. Resuspend תאים μL 100 של PBS ו FBS 2%.
17. להשיג דגימות ב FACS.

3. העשרה המגנטי של C-Kit ⁺ תאים

1. הכן פתרון מאגר המכיל PBS, pH 7.2, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA), ו 2 mM EDTA.
2. Resuspend תא גלולה של העצם הדלועים נגזר לפחות 10 עכברים 1 מ"ל של תמיסת מאגר המכיל C-Kit MAB מצומדות כדי APC בדילול 1:50.
3. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
4. לשטוף פעמיים את התאים עם 40 מ"ל של תמיסת המאגר.
5. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר tהוא supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
6. Resuspend תא גלולה ולהוסיף 50 μl של Anti-APC microbeads על העכבר בכל להרדים ישירות גלולה.
7. מערבבים היטב דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
8. לשטוף את התאים על ידי הוספת 40 מ"ל של תמיסת חיץ צנטריפוגות בסל"ד 1500 דקות 5. Aspirate supernatant לחלוטין.
9. Resuspend תא גלולה ב כפולה של 4 מ"ל של הפתרון למאגר כל שלושה עכברים להרדים.
10. מקום MACS טורים LS בשדה המגנטי של מפריד MACS מתאים. 1 השתמש בעמודה אחת לשלושה עכברים להרדים.
11. הכינו עמודות על ידי שטיפה עם 4 מ"ל של תמיסת חיץ.
12. החל ההשעיה התא על העמודים.
13. איסוף התאים שהוסרו מהן תוויות העוברים ולשטוף טור עם 4 מ"ל של תמיסת המאגר. לבצע פעולות כביסה ידי הוספת 4 מ"ל של תמיסת חיץ שלוש פעמים. הוסף חוצץ חדש כאשר המאגר טור מתרוקנת.
14. הסרה של עמודות מ מפריד ו placה כל אחד על גבי 15 צינורות מ"ל פלקון.
15. פיפטה 4 מ"ל של תמיסת חיץ על כל עמודה. מיד לשטוף את התאים המסומנים מגנטית על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך הטור.
16. בצנטריפוגה צינורות בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
17. Resuspend כל גלולה עם 1 מ"ל של תמיסת חיץ כדורי קבוצתיות צינור יחיד פלקון 15 מ"ל.

4. מיון של בתאי גזע hematopoietic ואת אבות מסורים השושלת

1. להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם כפי שעולה 500 PBS μL ו FBS 2% להכתים את התאים.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200
   • C-Kit מצומדות כדי APC 1:100
   • SCA-1 מצומדות כדי ביוטין 1:50
   • מצומדות כדי FITC 1:50 CD34
   • מצומדות כדי PE 1:100 FcγR
2. בצנטריפוגה צינור מ לשנים הקודמותשל סעיף בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
3. מוסיפים את תערובת מבז כדי גלולה. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
4. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
5. לשטוף פעמיים את התאים עם 14mL של PBS ו FBS 2%.
6. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
7. לדלל streptavidin כמפורט 500 PBS μL ו 2% FBS להכתים את התאים.
   • Streptavidin מצומדות כדי APC-Cy7 1:300
8. הוסף הפתרון הצינור. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
9. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C.
10. לשטוף פעמיים את התאים עם 14 מ"ל של PBS ו - 2% FBS.
11. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
12. Resuspend תאים μL 500 של PBS ו FBS 2%.
13. להעביר ולסנן את ההשעיה תא צינור חדש 5 מ"ל כדי אליminate אגרגטים הסלולר זה יכול להפריע הליך המיון.
14. הוסף 5 μL של 7-AAD (להשתמש בו בדילול 1:100) על השעיית התא על מנת להוציא 7-AAD ⁺ מתים תאים ממוינים האוכלוסיות.
15. מיין תאים עם FACSAria BD פי פנוטיפים את הבאים:
    • LKS תאים: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 ⁺
    • LT-HSCs: LKS CD34 ^-
    • ST-HSCs: LKS CD34 ⁺
    • GMPs: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 FcγR ^{נמוכה גבוהה} CD34 ⁺
    • חברי הפרלמנט האירופי: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 FcγR ^{נמוך נמוך} CD34 ^-
    • CMPs: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 FcγR ^{נמוך נמוך} CD34 ⁺

5. נציג תוצאות

איור 1 מציג ודוגמא הליך gating אלקטרונייםהנפוצים הציון אבות הלימפה (CLPs) כמו ^- לין / c-Kit ^{וראה זה} / אינטרלוקין (IL)-7R ⁺ תאים, לין ^- / c-Kit ⁺ / SCA-1 ⁺ (LKS) ולין ^- / c-Kit ⁺ / SCA ^{וראה זה} -1 (C-Kit ⁺⁾ תאים, מ C-Kit ⁺ שער, אבות מיאלואידית משותף (CMPs) מזוהים FcγR ^{וראה זה} CD34 ⁺ תאים, אבות granulocyte / מונוציטים (GMPs) כמו FcγR ^היי CD34 ⁺ תאים megakaryocyte / אבות כדורית אדומה (חברי הפרלמנט האירופי) כמו FcγR ^Lo CD34 ^- תאים, משער LKS, LT-HSC ו ST-HSC מזוהים CD34 ^- ו CD34 ⁺ תאים, בהתאמה. מח העצם זו ההשעיה התא יכול להיות מועשר על C-Kit ⁺ תאים עם חרוזים מגנטיים (איור 2): LT-HSC ו ST-HSC לאחר מכן ניתן למיין על פי ביטוי CD34, כמו גם אבות אחרים על פי הפנוטיפ המתואר לעיל.

HSCs יכולה להיות אנה lyzed במיקרוסקופ הדמיה חיה confocal כפי שמוצג באיור 4, שם CD34 ^- תאים הוכתמו מתחם נוקלאוטיד מחייב quinacrine ¹¹ כמו גם הגרעין האדום (DRAQ5). ב HSCs, אבל לא GMPs, quinacrine חיובי שלפוחית ​​נראים ¹² הציטופלסמה. יתר על כן, HSCs מיון יכול לשמש בניסויים פונקציונליים כמו הפגינו 5 דמות, אשר מציג את העלייה cytosolic Ca ^{2 +} ב HSC-LT ידי הפעלת קולטנים-P2 purinergic בחשיפה טריפוספט-אדנוזין (ATP) ו ionomycin ^12.

באיור 1. נציג ניתוח נקודה העלילה של לין-BM תאים. הליך gating אלקטרונית על cytometer זרימת לזהות להבקיע אבות hematopoietic ו HSCs מן ההשעיה מח עצם התא מוכתם כמתואר בטקסט פרוטוקול.

pload/3736/3736fig2.jpg "/>
איור 2. תוכנית להעשרת סלקטיבית של C-Kit ⁺ תאים ממח העצם.

איור 3 מחזור התא ניתוח אלקטרונית LKS סגורות CD34 ^-. HSCs ב בריאים ועכברים עם IBD מוכתמים נוגדנים-67 קי ו DAPI. התאים היו קבועים permeabilized עם Lyse / תקן ו פרם מאגרים ואחריו מכתים עם מצומדות FITC Ki-67 ו DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל. תאים רכיבה הם בקושי אם בכלל לזיהוי LKS CD34 ^- תא HSCs של פקדים בריא ^12.

. איור 4 לחיות מיקרוסקופיה הדמיה confocal של FACS מיון CD34 ^- HSCs ו GMPs מוכתמים quinacrine נוקלאוטיד מחייב את המתחם הגרעיני ואדום (DRAQ5). את הרביעים קטנים להראות quinacrine קופהשלפוחית ​​itive זוהה בציטופלסמה של HSCs אך לא GMPs.

איור 5. Cytosolic Ca ^{2 +} עליות HSCs מיון עמוסות פורעה-2 ו מגורה עם ה-ATP ו ionomycin. עקבות של תאים בודדים מוצגים. כל התאים היו מגיבים ATP תאי מראה עלייה בולטת cytosolic Ca ^{2 +} אחרי תוספת של ATP.

דיון

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח מהיר ומדויק של hematopoiesis בעכברים בודדים (איור 1). זה ניתוח במסגרות ניסיוניות שונות, כולל מודלים Murine של דלקת, אוטואימוניות, כשל חיסוני, מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן, מאפשרת מענה את ההשפעה של התנאים פתולוגיים על hematopoiesis. איור 3 מציג ניתוח של פעילות רכיבה על התא LKS מגודרת באופן אלקטרוני CD34 ^- תאים בעכברים בריאים ועכברים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD) ¹³ על ידי מכתימה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
RPMI 1640	Gibco	42401
MEM NEAA 100x	Gibco	11140
נתרן פירובט	Gibco	11360
PenStrep	Gibco	15070
PBS	Gibco	20012
FBS	Gibco	16000
מסננת תא 40 מיקרומטר	BD פלקון	352340
7-AAD מכתים פתרון	BD Pharmingen	559925
Lyse / לתקן את המאגר	BD Pharmingen	558049
פרם חיץ III	BD Pharmingen	558050
Ki-67	BD Pharmingen	556026
DAPI	Invitrogen	D21490
CD4 (GK1.5)	eBioscience	150041
CD8 (53-6.7)	eBioscience	150081
CD3 (145-2C11)	eBioscience	150031
CD45R (RA3-6B2)	eBioscience	150452
CD19 (6D5)	eBioscience	150193
Gr1 (RB6-8C5)	eBioscience	155931
Tre119 (TER-119)	eBioscience	155921
NK-1.1 (PK136)	eBioscience	455941
C-Kit (2B8)	eBioscience	171171
SCA-1 (D7)	eBioscience	135981
CD34 (RAM34)	eBioscience	110341
FcγR (2.4G2)	eBioscience	553145
Anti-APC microbeads	Miltenyi BIOTEC	130-090-855
LS עמודות	Miltenyi BIOTEC	130-042-401