Method Article

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

DOI:

10.3791/3791

⸱

May 4th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול יעיל לשימוש במיקרו-מערך נוגדנים מרובים בעל תפוקה גבוהה עם זיהוי חלבון קושר גליקן המאפשר פרופיל גליקוזילציה של חלבונים ספציפיים. גליקוזילציה של חלבונים היא השינוי הנפוץ ביותר לאחר התרגום שנמצא בחלבונים, ומוביל לשינויים מגוונים בתכונות הפיזיקליות, הכימיות והביולוגיות של חלבונים. מכיוון שמנגנון הגליקוזילציה רגיש במיוחד להתקדמות מחלה וטרנספורמציה ממאירה, גליקוזילציה חריגה הוכרה כסמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם של סרטן ומחלות אחרות. עם זאת, השיטות הנוכחיות לחקר גליקוזילציה של חלבון הן בדרך כלל מסובכות או יקרות מדי לשימוש ברוב המסגרות המעבדתיות או הקליניות הרגילות ויש צורך בשיטה מעשית יותר לחקר גליקוזילציה של חלבון. הפרוטוקול החדש המתואר במחקר זה עושה שימוש במיקרו-מערך נוגדנים חסום כימית עם זיהוי חלבון קושר גליקן (GBP) ומפחית משמעותית את הזמן, העלות ודרישות ציוד המעבדה הדרושים לחקר גליקוזילציה של חלבון. בשיטה זו, מספר נוגדנים ספציפיים לגליקופרוטאין משותקים מודפסים ישירות על שקופיות המיקרו-מערך וה-N-גליקנים על הנוגדנים נחסמים. הנוגדנים הספציפיים לגליקופרוטאין החסומים והמשותקים מסוגלים ללכוד ולבודד גליקופרוטאינים מדגימה מורכבת המוחלת ישירות על שקופיות המיקרו-מערך. לאחר מכן ניתן לבצע זיהוי גליקן על ידי יישום של לקטינים ביוטיניליים ו-GBPs אחרים על שקופית המיקרו-מערך, בעוד שניתן לקבוע את רמות הקישור באמצעות Dylight 549-Streptavidin. באמצעות שימוש בפאנל נוגדנים ובדיקה עם לקטינים ביוטיניים מרובים, שיטה זו מאפשרת לפתח פרופיל גליקוזילציה יעיל של החלבונים השונים הנמצאים בדגימה נתונה של בני אדם או בעלי חיים.

מבוא

גליקוזילציה של חלבון, שהוא השינוי הנפוץ ביותר בחלבונים, משנה את התכונות הפיזיקליות, הכימיות והביולוגיות של חלבון, וממלא תפקיד מהותי בתהליכים ביולוגיים שונים1-6. מכיוון שמנגנון הגליקוזילציה רגיש במיוחד להתקדמות מחלה וטרנספורמציה ממאירה, גליקוזילציה חריגה הוכרה כסמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם של סרטן ומחלות אחרות 7-12. למעשה, רוב הסמנים הביולוגיים הנוכחיים של סרטן, כגון חלק L3 של α-1 Fetoprotein (AFP) עבור קרצינומה של הכבד 13-15, ו-CA199 עבור סרטן הלבלב 16, 17 הם כולם חלקיקי גליקן חריגים על גליקופרוטאינים. עם זאת, שיטות לחקר גליקוזילציה של חלבונים היו מסובכות, ואינן מתאימות למעבדה ולסביבות קליניות שגרתיות. צ'ן ועמיתיו המציאו לאחרונה מיקרו-מערך נוגדנים חסום כימית עם שיטת זיהוי חלבון קושר גליקן (GBP) לתפוקה גבוהה ופרופיל מרובה של גליקופרוטאינים מקומיים בדגימה מורכבת 18. בשיטת מיקרו-מערך מבוססת זיקה, מספר נוגדנים ספציפיים לגליקופרוטאין משותקים לוכדים ומבודדים גליקופרוטאינים מהתערובת המורכבת ישירות על שקופית המיקרו-מערך, והגליקנים על כל חלבון שנלכד בודד נמדדים על ידי GBPs. מכיוון שכל הנוגדנים הרגילים מכילים N-גליקנים שיכולים להיות מזוהים על ידי רוב ה-GBPs, השלב הקריטי בשיטה זו הוא לחסום כימית את הגליקנים על הנוגדנים מלהיקשר ל-GBP. בהליך, קבוצות cis-diol של הגליקנים על הנוגדנים התחמצנו לראשונה לקבוצות אלדהיד על ידי שימוש ב-NaIO4 במאגר נתרן אצטט תוך הימנעות מאור. קבוצות האלדהיד הוצמדו לאחר מכן לקבוצת ההידרזיד של מקשר צולב, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), ואחריו צימוד של דיפפטיד, Cys-Gly, לקבוצת המלימיד של MPBH. לפיכך, קבוצות ה-cis-diol על גליקנים של נוגדנים הומרו לקבוצות מגושמות ללא הידרוקסיל, מה שעיכב את קשירת הלקטינים ו-GBPs אחרים לנוגדני הלכידה. הליך חסימה זה גורם ל-GBPs ולקטינים להיקשר רק לגליקנים של חלבונים שנלכדו. לאחר חסימה כימית זו, דגימות הסרום הודגרו עם מיקרו-מערך הנוגדנים, ולאחר מכן גילוי הגליקנים באמצעות לקטינים ביוטיניליים ו-GBPs שונים, והודגמו עם Cy3-streptavidin. השימוש המקביל בפאנל נוגדנים ובדיקת לקטין מרובה מספק פרופילי גליקוזילציה נפרדים של חלבונים מרובים בדגימה נתונה 18-20. שיטה זו שימשה בהצלחה במספר מעבדות שונות 1, 7, 13, 19-31. עם זאת, היציבות של MPBH ו-Cys-Gly, הליך מסובך ומורחב בשיטה זו משפיע על יכולת השחזור, היעילות והיעילות של השיטה. בפרוטוקול חדש זה, החלפנו גם את MPBH וגם את Cys-Gly במגיב אחד יציב הרבה יותר חומצה גלוטמית הידרזיד (Glu-hydrazide), מה ששיפר משמעותית את יכולת השחזור של השיטה, פישט וקיצר את כל ההליך כך שניתן יהיה להשלים אותו תוך יום עבודה אחד. בפרוטוקול חדש זה, אנו מתארים את הנוהל המפורט של הפרוטוקול שניתן לאמץ בקלות על ידי מעבדות רגילות למחקר שגרתי של גליקוזילציה של חלבון וטכניקות הנחוצות להשגת תוצאות הניתנות לשחזור וניתנות לחזרה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הדפס microarray נוגדן עבור assay

  1. לדלל את כל הנוגדנים ל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת מלח פוספט חיץ, pH 7.2 (PBS).
  2. Aliquot 40 μl של נוגדן זה לתוך צלחת 384, גם המקור.
  3. טען את צלחת 384 גם מקור על microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
  4. טען 20 microarray שקופיות נתיב אל microarrayer כמטרה.
  5. הגדר את microarrayer להדפיס 48 subarrays זהים, בהם 27 נוגדנים ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. היעד חלבון נוגדן הבחירה ללכוד

לפני assay microarray נוגדנים, חומרים כימיים וחומרים מסוימים יש צורך לקחת בחשבון ומוכן. לעצב microarray נוגדנים עבור פרופיל glycan או סמן ביולוגי glycan ההקרנה, פאנל של נוגדנים ספציפיים למועמדים גליקופרוטאין צריך להיקבע על פי הספרות או תוצאות קודמות. נוגדנים אלה נרכשו בדרך כלל מיצרנים שונים, כגון מחקר ופיתוח מערכות וכו 'IgGs עדיפים נוגדנים ללכוד מאז הבדיקות הקודמות שלנו הראו כי ח.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הפטיטיס ומחקר וירוס.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תעודת זהות שם מגיב קיצור חברה קטלוג #
L1 Concanavalin Biotinylated ConA וקטור מעבדות BK-1000
L2 Lectin Biotinylated Sambucus nigra SNA וקטור מעבדות B-1305
L3 Biotinylated עדשה Culinaris Agglutinin רע"א וקטור מעבדות BK-2000
L4 Biotinylated Ricinus communis Agglutinin אני RCA וקטור מעבדות BK-1000
L5 Lectin Biotinylated Aleuria Aurantia אאל וקטור מעבדות B-1395
L6 Lectin Biotinylated Erythrina Cristagalli ECL וקטור מעבדות BK-3000
L7 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II GSL ב ' וקטור מעבדות BK-3000
L8 Biotinylated נבט חיטה Agglutinin WGA וקטור מעבדות BK-1000
L9 Biotinylated vulgaris Phaseolus Erythroagglutinin PHA-E וקטור מעבדות BK-2000
L10 Biotinylated vulgaris Phaseolus Leucoagglutinin PHA-L וקטור מעבדות BK-2000
L11 בוטנים Biotinylated Agglutinin הרשות הפלסטינית וקטור מעבדות BK-1000
L12 Biotinylated Pisum sativum Agglutinin PSA וקטור מעבדות BK-2000
L13 Biotinylated לבלב Biflorus Agglutinin DBA וקטור מעבדות BK-1000
L14 ב"דאטורה Biotinylated וסטרמוניום Lectin DSL וקטור מעבדות BK-3000
L15 Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin SJA וקטור מעבדות BK-2000
L16 סויה Biotinylated Agglutinin SBA וקטור מעבדות BK-1000
L17 Biotinylated Solanum Tuberosum (תפוחי אדמה) Lectin STL וקטור מעבדות BK-3000
L18 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin אני אני GSL וקטור מעבדות BK-2000
L19 Lectin Biotinylated בקיה Villosa VVL וקטור מעבדות BK-2000
L20 Biotinylated Lycopersicon Esculentum (עגבניות) Lectin לל וקטור מעבדות BK-3000
L21 Ulex Biotinylated Europaeus Agglutinin אני אני UEA וקטור מעבדות BK-1000
L22 Biotinylated Jacalin JACALIN וקטור מעבדות BK-3000
A1 F עיזים ("א.ב.) 2 נגד אדם IgM שבר, נוגדנים Fc5μ IgM ג'קסון חיסונית מחקר 109-006-129
A2 החמור F ('א.ב.) 2 Frag נגד אדם IgG (H + L)tibody Ab1 ג'קסון חיסונית מחקר 709-006-149
A3 עכבר נגד אדם IgG ו '("א.ב.) 2 נוגדנים חד שבטיים AB3 ג'קסון חיסונית מחקר 209-005-097
A4 אנטי אנושי עז אלפא 2 macroglobulin polyclonal נוגדנים A2M GeneTex GTX62924
A5 הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים A1AT לי Biosiences CA1T-80A
A6 נגד אדם מאוס Alpha-1-antitrypsin נוגדנים חד שבטיים A1AT סיגמא אולדריץ' SAB4200198
A7 הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים מערכה NeoMarkers RB-367-A1
A8 הארנב נגד אדםAlpha-1-antichymotrypsin polyclonal נוגדנים מערכה פישר סיינטיפיק RB9213R7
A9 נגד אדם מאוס transferrin חד שבטי נוגדן Transferrin GeneTex GTX101035
A10 הארנב נגד אדם transferrin polyclonal נוגדנים Transferrin GeneTex GTX77130
A11 אנטי אנושי עז אפוליפופרוטאין J polyclonal נוגדנים ApoJ Abcam ab7610
A12 נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן GP73 אבוט 14H4-23
ת 13 נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן GP73 סנטה קרוז ביוטכנולוגיה INC SC-101275
A14 הארנב נגד אדם אלפא 1 fetoprotein polyclonal נוגדנים AFP GenWay GWB-41C966
ת 15 נגד אדם מאוס Alpha-1 fetoprotein חד שבטי נוגדן AFP פיצג'רלד 10-A05A
A16 נגד אדם מאוס hemopexin חד שבטי נוגדן Hemopexin Assaypro 60190-05011
A17 עכבר נגד אדם glypican-3 (1G12) נוגדנים חד שבטיים GPL3 סנטה קרוז ביו SC-65443
A18 נגד אדם מאוס Kininogen (LMW) נוגדנים חד שבטיים Kininogen Assaypro 20333-05011
A19 הארנב נגד אדם MMP-21 חד שבטי נוגדן MMP21 Epitomic 1955-1
A20 נגד אדם מאוס CEACAM-1 חד שבטי antibody CEACAM מחקר ופיתוח מערכות MAB1180
A21 עכברוש נגד האדם נוגדנים חד שבטיים DPPIV/CD26 DPPIV מחקר ופיתוח מערכות MAB22441
A22 נגד אדם מאוס PIVKA II נוגדנים חד שבטיים PIVICA קריסטל כימית 8040
A23 נגד carcinoembryonic עכבר אנטיגן CEA ארה"ב הביולוגי C1300
A24 עכבר נגד CA125 סרטן Antigen CA125 ארה"ב הביולוגי C0050-01D
A25 נגד CA19-9 סרטן עכבר אנטיגן CA19-9 ארה"ב הביולוגי C0075-18
A26 נגד לואיס עכבר x חד שבטי נוגדן לואיס X Calbiochem 434631
ביו Biotinylated BSA (בקרה חיובית) ביו תוצרת בית N / A

1. השולחן רשימת לקטינים ונוגדנים שימוש בפרוטוקול זה.

שם / s מגיב ציוד חברה מספר קטלוגי
ללא מגע microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate דיג 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray שקופיות Gentel PATH
Slide Imprinter (לא חובה) החברה ג'ל WSP60-1
מטרף דיג 15-453-211
סרכזת Eppendorf 5804 000.013
כביסה שקופיות אגן / שקופיות מכתים מהודרת עם מתלה נשלף דיג 08-812
הדגירה שקופיות תא / מיקרוסקופ שקופיות תיבת דיג 03-448-5
Brij 35, 30 W / V הפתרון% במים Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 דיג P337-100
נתרן Periodate (NaIO 4) סיגמא 311448
L-גלוטמית חומצה γ-hydrazide סיגמא G-7257
אצטט וסודיום (CH 3 COONa) סיגמא S2889
שור סרום אלבומין (BSA) Lampire ביולוגית Labs 7500804
מאגר מלוחים פוספט (PBS) (10X) Denville מדעי CP4390-48
Dylight 549 מצומדות NeutrAvidin Thermo 22837
מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות רוש 4693159001
ChromPure האדם IgG, קטע Fc ג'קסון Immunoresearch 009-000-008
ChromPure לנוגדנים אנושיים, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 009-000-003
ChromPure עכבר IgG, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 015-000-003
ChromPure עכבר IgG, קטע Fc ג'קסון Immunoresearch 015-000-008
ChromPure הארנב IgG, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 011-000-003
ChromPure חמור IgG, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 017-000-003
Microarray סורק טקאן LS מחדש

2. לוח רשימת ציוד ריאגנטים שימוש בפרוטוקול זה.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemically Blocked Antibody MicroarrayGlycosylation ProfilingGlycan Binding Protein DetectionAntibody Glycan BlockingBiotinylated Lectin DetectionFluorescence Microarray ScannerGlycoprotein CaptureMultiplexed High throughputHCC Serum AnalysisGlycan Binding Proteins

Related Articles