שיטה ליצירת אדם המושרה גזע pluripotent תאים (iPSCs) דרך לביטוי רטרווירוס בתיווך חוץ רחמי של OCT4, Sox2, KLF4 ו myc מתואר. באופן מעשי לזיהוי מושבות iPSC אדם המבוססים על ביטוי של GFP נדון גם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הם pluripotent ו כ מקורות הסלולר שלא יסולא בפז עבור בדוגמנות המחלה במבחנה ברפואה רגנרטיבית 1. הוכח בעבר כי האדם תאים סומטיים ניתן לתכנות מחדש כדי pluripotency ידי ביטוי אקטופי של ארבעה גורמי תעתוק (Oct4, Sox2, Klf4 ו myc) ולהיות המושרה על גזע pluripotent תאים (iPSCs) 2-4. כמו hESCs, iPSCs האדם pluripotent ומקור פוטנציאל תאים עצמיים. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לתכנת מחדש תאים פיברובלסטים אדם עם ארבעה גורמים תכנות מחדש משובטים לתוך עמוד השדרה-GFP המכיל retroviral 4. באמצעות פרוטוקול הבאה, אנחנו מייצרים iPSCs האדם 3-4 שבועות בתנאי ESC התרבות האנושית. אדם מושבות iPSC דומים hESCs ב המורפולוגיה להציג הפסד של ה-GFP הקרינה כתוצאה ההשתקה transgene retroviral. מושבות iPSC מבודדים מכנית תחת microsco הקרינהPE להתנהג באופן דומה hESCs. בתאים אלה, אנו מזהים את הביטוי של גנים pluripotency מספר סמנים פני השטח.
פרוטוקול
1. תכנות מחדש של רטרווירוס הבעת גורמים תכנות מחדש
- Fibroblasts אדם מתורבתים במדיום פיברובלסטים (10% FBS ב DMEM עם עט / דלקת).
- יום אחד לפני הזיהום, 1x10 צלחת 5 fibroblasts אדם לתוך אחד גם צלחת של 6 באר.
- Aspirate בינוני להסיר תאים מתים ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום פיברובלסטים טרי. הוסף סולפט protamine בריכוז הסופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל.
- בזהירות להוסיף את הכמות המתאימה של וירוס ה-GFP, להביע את כל המתאים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 5 5.
- יום אחד לאחר ההדבקה, הסר supernatant ויראלי, לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS, ולאחר מכן להוסיף 2 פיברובלסטים בינוני מ"ל.
- שלושה ימים לאחר ההדבקה, לבדוק את הקרינה GFP ומלאו היטב עם המדיום 2 פיברובלסטים מ"ל.
- ארבעה ימים לאחר ההדבקה, צלחת 1x10 4/2 ס"מ של פיברובלסטים העכבר מוקרן עובריים (MEFs) מזין תאים פיברובלסטים בינוני על גבי10 ס"מ צלחת פטרי מצופה 0.1% ג'לטין. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- חמישה ימים לאחר ההדבקה, לנתק fibroblasts אדם שנדבקו 1 מ"ל 0.05% typsin / EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ועל צנטריפוגות במשך 5 דקות בכל 200 גרם. Aspirate בינוני resuspend את התאים עם 10 מ"ל של מדיום פיברובלסטים. להעביר את התאים לתוך צלחת של 10 ס"מ מראש מצופה.
- לאחר 24 שעות, להחליף בינוני עם בינוני hESC תרבות (20% נוק אאוט החלפת בסרום, DMEM/F12, 0.1 מ"ל לא חיוניות חומצות אמינו, 4 ng / ml bFGF, עט / דלקת / גלוטמט, בטא merceptoethanol). שנה בינונית מדי יום. ESC כמו מושבות יתחיל להופיע 20-27 יום לאחר ההדבקה.
2. בידוד והרחבת iPSCs
- תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בדוק בהעדר GFP הקרינה במושבה המציג מורפולוגיה דומה hESCs.
- בעזרת פיפטה μl 10, לקחת מושבות iPSC בודדים ומניחים אותם לתוך אחד טוב של ג'לטין ו-MEF-CoAטד 12 גם הצלחת להשלים עם המדיום hESC. שנה בינונית מדי יום.
- עבור passaging, לשטוף את הצלחת עם 1 מ"ל של DMEM/F12, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של collagenase, ו דגירה במשך 10 דקות ב 37 ° C.
- שוטפים את התאים פעמיים עם DMEM/F12.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום hESC טרי. באמצעות מרים תאים, לפרק את המושבות לחתיכות קטנות ולנתק התאים הנותרים מהצלחת.
- מעבירים את חתיכות resuspended של מושבות לאחד גם צלחת 6-גם ג'לטין ו-MEF מצופה.
3. ניתוח immunofluorescence של סמנים pluripotent
- שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS ו permeabilize עם. 0.2% טריטון X-100 ב PBS למשך 30 דקות
- חסום שאינם ספציפיים מחייב דוגרים על ידי תאים עם BSA 3% ב PBS במשך שעתיים.
- דגירה התאים עם הנוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ו דגירה התאים עם נוגדן ספציפי משנית למשך שעה בטמפרטורת החדר, מיגון מפני אור.
- שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף DAPI במהלך הכביסה האחרונה ואחריו הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- זיהוי כתמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. כמותי בזמן אמת PCR Assay עבור סמנים pluripotent
- לבודד RNA הכולל את iPSCs האדם הנגזרות fibroblasts אדם באמצעות ערכת RNeasy של Qiagen.
- לסנתז גדיל 1-cDNA באמצעות כתב עילי transcriptase השני הפוך.
- בצע QPCR לזהות גנים pluripotency באמצעות primers שדווח קודם לכן. 6
5. נציג תוצאות
- שינוי מורפולוגי במהלך תכנות מחדש
אנחנו נגועים fibroblasts אדם BJ1 ודטרויט 551 עם קוקטייל של רטרווירוסים הנושאים OCT4, Sox2, KLF4 ו myc,והיו מסוגלים לזהות שינויים מורפולוגיים במהלך תכנות מחדש (איור 1). עשרים ואחד ימים לאחר ההדבקה, אנו מכירים iPSC מושבות קטנות על ידי המורפולוגיה שלהם hESC דמוי. יתר על כן, אנו מכירים iPSCs על ידי הקרינה ה-GFP. בתאי גזע pluripotent, כגון ESCs ו iPSCs, להביע את המנגנון המולקולרי להדחיק ביטוי גנים proviral 7-9. וקטור retroviral הייחודי שלנו מבטא את ה-GFP ביחד עם תכנות מחדש הגנים על ידי LTR retroviral. לכן, תאים המבטאים באופן רציף GFP נחשבים להביע transgenes ללא להשתקת גנים proviral. מושבות iPSC לתכנות מחדש באמונה לרכוש את רשת מולקולרית pluripotency להראות העדר ביטוי של GFP (איור 2) 10. - אפיון pluripotency של iPSCs אדם
ניתחנו מושבות שמקורם דטרויט-551 fibroblasts באמצעות אימונוהיסטוכימיה עם Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, ו OCT4 נוגדנים Nanog ( לוח 2). IPSCs לתכנות מחדש בהצלחה לבטא את כל אלה סמנים (איור 3 א). אנחנו גם ניתח ביטוי גנים באמצעות ניתוח RT-PCR כמותי. הבחנו כי ביטוי OCT4, Sox2, KLF4, myc ו Nanog הוגדל באופן משמעותי לעומת תאים פיברובלסטים ההורים אבל בקנה אחד עם זו של H9 hESCs (איור 3 ב).
באיור 1. שינויים מורפולוגיים של רטרווירוס נגועים fibroblasts אדם. (AD) שינוי מורפולוגי מתקדמת במושבות מדטרויט-551 fibroblasts נגועים גורמים תכנות מחדש. יום 5 (א), יום 10 (ב) יום 14 (ג), ביום 21 (ד). תאים להראות מורפולוגיה hESC כמו לאחר 21 יום.
איור 2. נציג ה-GFP ביטוי ניאון בתאים שעברו תכנות מחדש. ב"ג ודטרויט 551 fibroblasts נדבקו רטרווירוס להביע ארבעה גורמים תכנות מחדש 4, ו מודגרות במדיום hESC במשך ארבעה שבועות. Fibroblasts ב"ג (א, ב) ודטרויט 551 (ג', ד ') להראות דומה מורפולוגית. מיום 21, מושבות GFP שליליים מתחילים להיווצר, אשר מייצגים את iPSCs חרוצים וישרי דרך 10. (E, F) הצג הפכה דטרויט 551 תאים שלא עברו תכנות מחדש הנכון. (A, C, E) מושבות תחת התצוגה בניגוד שלב. (B, D) לתכנות מחדש כראוי התאים המציגים השתקת ה-GFP. (ו) ה-GFP ביטוי בהיר מהמושבה טרנספורמציה.
איור 3. אפיון של תאים אנושיים גזע המושרה pluripotent. (א) אדם 551-IPS-K1 מושבות תאים להביע סמנים משותפים לתאי גזע pluripotent. מכתים DAPI מעיד על התוכן הסלולרי הכולל לכל שדה. (ב) כמותי בזמן אמת-PCR (RT-QPCR) עבור ביטוי OCT4, Sox2, KLF4, myc בפה ההורים, ibroblast 551-IPS-K1 iPSCs ו H9 תאים אנושיים גזע עובריים (hESCs). הנתונים היו מנורמל נגד הגן β-אקטין משק בית זממו יחסית לרמה ביטוי בתאי פיברובלסטים ההורים 4.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הביטוי של ארבעה גורמי תעתוק fibroblasts reprograms אדם עד iPSCs. ניסיונות רבים נעשו כדי לייצר iPSCs אדם באמצעות שילוב גישות שאינם או לא גנטית כדי לייצר iPSCs בטוח מבחינה רפואית. עד כה שיטות אלה מראים יעילות נמוכה מאוד ודורשים אופטימיזציה נוספת כדי לשפר את שחזור 11-14. שיטות רטרו או lentiviral משמשות בקלות להפיק וליישם iPSCs עבור האדם במודלים חוץ גופית מחלה, שהם תלויים פחות על בעיות בטיחות שנגרמו על ידי שילוב ויראלי. תכנות מחדש בשיטה המתוארת כאן זמין הגזירה יעיל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה למסור.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל ובריאות הילד פרס מחקר של קרן צ'רלס הוד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330057 | 80% |
| תחליף סרום Knockout | Invitrogen | 10828-028 | 20% |
| L-גלוטמין (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | 2 mM |
| חומצות אמינו שאינן חיוניות (10 mM) | Invitrogen | 11140050 | 0.1 mM |
| βמרקפטו–אתנול (14.3 M) או MTG | Invitrogen | M-6250 | 0.1 mM |
| bFGF-2 10 μג'/מ"ל | GIBCO, מבית Life Technologies | GF003AF | 4 ng/ml |
| פניצילין/סטרפטומיצין | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| DMEM | Invitrogen | 11965118 | 90% |
| סרום עגל רב-ערכי (FBS) | Invitrogen | 10407028 | 10% |
| פניצילין/סטרפטומייצין | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| <חזק>טבלה 1. מצע גידול | |||
| OCT4 | Abcam | Ab19857 | 1:500 |
| SSEA3 | EMD Millipore | MAB4303 | 1:100 |
| SSEA4 | BD Biosciences | BD560218 | 1:100 |
| Tra-1-81 | BD Biosciences | BD560173 | 1:100 |
| Tra-1-60 | BD Biosciences | BD560174 | 1:100 |
| NANOG | Abcam | Ab21624 | 1:500 |
| Alexa-Flur 488 | Invitrogen | A11008 | 1:1000 |
| Alexa-Flur 555 | Invitrogen | A21422 | 1:1000 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:5000 |
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| קולגנאז מסוג IV | Invitrogen | 17104019 | 1mg/ml |
| ג'לטין, חזיר | Sigma-Aldrich | G 1890 | 0.1% |
| טריטון | Sigma-Aldrich | X100-500ML | 0.2% |
| פראפורמלהיד | Sigma-Aldrich | 47608 | 4% |
| אלבמין משרת הבקר (BSA) | American Bioanalytical | AB01800 | 3% |
| תאי הזנה מסוג MEF | EMD Millipore | PMEF-N | |
| מגבי תאים | Corning | 3008 | |
| מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: מיקרוסקופ הפוך עם מסנן GFP | |||
| <חזק>טבלה 2. ריאגנטים וציוד |
מקורות
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Hotta, A., Ellis, J. Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states. Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).
- Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET. Nature. 464, 927-931 (2010).
- Wolf, D., Goff, S. P. Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs. Nature. 458, 1201-1204 (2009).
- Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin,, Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).
- Wolf, D., Goff, S. P. TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells. Cell. 131, 46-57 (2007).
- Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
