הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

39.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3814

⸱

15 באוגוסט 2012

 ,  , 
1Neuroscience Program, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Molecular and Cell Biology, Uniformed Services University

במאמר זה

סיכום

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial העיקריות במבחנה מחקר ויישומים במורד הזרם.

תקציר

מיקרוגליה מהוות כ-12% מסך כלל האוכלוסייה התאית במוח של יונקים. בעוד שנוירונים ואסטרוציטים נחשבים לסוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים, המיקרוגליה ממלאת תפקיד משמעותי בפיזיולוגיה התקינה של המוח על ידי ניטור הרקמה לאיתור פסולת ופתוגנים ושמירה על הומאוסטזיס בפארנכימה באמצעות פעילות פגוציטית 1,2. מיקרוגליה מופעלות במהלך מספר מצבים של פגיעה ומחלה, כולל מחלות ניווניות של מערכת העצבים, פגיעות ראש טראומטיות וזיהומים במערכת העצבים 3. תחת תנאי הפעלה אלו, המיקרוגליה מגבירות את הפעילות הפגוציטית שלהן, עוברות שינויים מורפולוגיים ושגשוגיים, ומפרישות באופן פעיל רדיקלים חופשיים של חמצן וחנקן, כימוקינים וציטוקינים פרו-דלקתיים, ולעיתים קרובות מפעילות לולאת פראקרין או אוטוקרין 4-6. מכיוון שתגובות מיקרוגליות אלו תורמות לפתוגנזה של מחלות במצבים נוירולוגיים, נדרש מחקר המתמקד במיקרוגליה.

בשל ההטרוגניות התאית של המוח, קשה מבחינה טכנית להשיג חומר דגימה מספיק של מיקרוגליה ברמת טוהר גבוהה במהלך ניסויי in vivo. מחקרים עכשוויים על התפקודים הנוירופרוטקטיביים והנוירוטוקסיים של המיקרוגליה דורשים שיטה טכנית שגרתית ליצירה עקבית של מיקרוגליה טהורה ובריאה בתנובה מספיקה למחקר. אנו מציגים, בטקסט ובסרטון, פרוטוקול לבידוד מיקרוגליה ראשונית טהורה מתרביות גליה מעורבות למגוון יישומים המשכיים. בקצרה, טכניקה זו משתמשת ברקמת מוח מופרדת של גורי חולדה ניאונטליים כדי להפיק תרביות תאי גליה מעורבים. לאחר שתרביות הגליה המעורבות מגיעות לקונפלואנציה, מיקרוגליה ראשונית מבודדת באופן מכני מהתרבית באמצעות ניעור למשך זמן קצר. לאחר מכן, המיקרוגליה נזרעת בדרגת טוהר גבוהה לצורך מחקר ניסויי.

העיקרון והפרוטוקול של מתודולוגיה זו תוארו בספרות 7,8. בנוסף, מתודולוגיות חלופיות לבידוד מיקרוגליה ראשונית מתוארות היטב 9-12. רקמת מוח הומוגניזית עשויה להיות מופרדת באמצעות סבוב צנטריפוגי במדרג צפיפות כדי להפיק מיקרוגליה ראשונית 12. עם זאת, הסבוב הצנטריפוגי הוא באורך בינוני (45 min) ועשוי לגרום לנזק תאי ולהפעלה, כמו גם לגרום להעשרה של מיקרוגליה ואוכלוסיות תאיות אחרות. פרוטוקול אחר שימש לבידוד מיקרוגליה ראשונית במגוון אורגניזמים באמצעות ניעור ממושך (16 hr) בזמן שהם בתרבית 9-11. לאחר הניעור, הנוזל העליון של המדיום עובר סבוב צנטריפוגי כדי לבודד את המיקרוגליה. שיטת בידוד זו, הכוללת שני שלבים וזמן ממושך יותר, עשויה אף היא להפר את תפקוד המיקרוגליה והפעלתה. במעבדתנו אנו משתמשים בעיקר בפרוטוקול בידוד המיקרוגליה הבא ממספר סיבות: (1) מיקרוגליה ראשונית מדמה ביולוגיה in vivo באופן נאמן יותר מקווי תאי מיקרוגליה של מכרסמים שהם אלמוותיים, (2) שיבוש מכני מינימלי מפחית תפקוד תאי לקוי או הפעלה פוטנציאלית, ו-(3) ניתן להשיג תפוקה מספקת ללא צורך במעבר (passage) של תרביות התאי הגליאליים המעורבות.

חשוב לציין כי פרוטוקול זה משתמש ברקמת מוח של גורי חולדה ניאונטליים לצורך בידוד מיקרוגליה, וכי שימוש בחולדות מבוגרות יותר לבידוד מיקרוגליה עלול להשפיע באופן משמעותי על התנובה, מצב האקטיבציה והתכונות התפקודיות של המיקרוגליה המבודדת. קיימות ראיות לכך שהזדקנות קשורה לתפקוד לקוי של מיקרוגליה, להגברת נוירו-דלקת ולפתולוגיות ניוრო-דגנרטיביות, ולכן מחקרים קודמים השתמשו במיקרוגליה בוגרת ex vivo כדי להבין טוב יותר את תפקידה של המיקרוגליה במחלות ניורו-דגנרטיביות שבהן הגיל הוא פרמטר חשוב. עם זאת, לא ניתן להחזיק מיקרוגליה ex vivo בתרבית למשך תקופות זמן ממושכות. לפיכך, בעוד שפרוטוקול זה מאריך את חייה של מיקרוגליה ראשונית בתרבית, יש לציין כי המיקרוגליה מתנהגת באופן שונה ממיקרוגליה בוגרת, ויש לשקול בזהירות את השמעות של מחקרים in vitro כאשר מתרגמים אותם למסגרת של in vivo.

פרוטוקול

1. דיסקציה של רקמת מוח החולדה ילודים

  1. L-15 צ'יל של ליבוביץ בתקשורת ממוזגים (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) עד 4 ° C. התקשורת והתרבות חמים (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ל 37 ° C. הכן 4 60x15 מ"מ צלחות פטרי עם 4-5 מ"ל של L-15 מדיה מותנה קרח. לעקר את כל כלי ניתוח עם אתנול 100%.
  2. יש לשטוף את הגורים-P2 ראפ היילודים עם אתנול 70%. (גורי עכברים היילודים בגילאי P1-P5 ניתן להשתמש בפרוטוקול זה.)
  3. עד מהרה לערוף עכברוש גור במספריים חדים סטריליים ושחרר את הראש מיד אתנול 70%. חזור עבור סכום כולל של 5 גורי עכברים מכן להעביר ראשי לתוך תמיסת מלח.
  4. הסר את המוח כולו מראשי ומניחים לתוך צלחת פטרי עם 4 - 5 מ"ל L-15 פתרונות (ליבוביץ' L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת) על קרח.
  5. חזור על נהלים 1.2 - 1.4 עבור הגורים הנותרים המלטה.
  6. להסיר את קרומי המוח מהמוח ולהעביר desרקמת המוח ired (כלומר, קליפה, המוח הקטן, המוח כולו, וכו ') לתוך צלחת פטרי חדשה עם 4-5 מ"ל של תמיסת L-15 (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) על קרח.

2. הכנת אוכלוסייה מעורבת תא גלייה

  1. ללא פגיעה ברקמת המוח עם מספריים או סכין, להעביר את הרקמה עם פיפטה 10 מ"ל ל 50 מ"ל צינור סטרילי חרוטית.
  2. סרכזת חרוט על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C.
  3. Aspirate supernatant. הוסף 4-5 מ"ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת).
  4. רקמת פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה סטרילית 10 מ"ל.
  5. מניחים מסננת תא (100 הנקבוביות מיקרומטר) על צינור טרי 50 מ"ל חרוטית. רקמת פיפטה מעלה ומטה פעם אחת עם 5 מ"ל פיפטה סטרילית ועם פיפטה סומק כדי מסננת את התא, לוותר על החומר דרך מסננת לתוך התא צינור חרוטי.
  6. שוטפים את המסננת תא עם 4-5 מ"ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + BS 0.1%עט + 1% / דלקת).
  7. סרכזת חרוטי עם תאים מתוחים על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C.

3. ציפוי ותחזוקה של מעורבות בתרביות תאים גליה

  1. לכל אחד במוח החולדה גור מעובד להכין 1 T-75 סטריליים קנקן ידי הוספת 12 מ"ל של תרבות המדיה (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) לתוך בקבוק אחד.
  2. Aspirate supernatant מתאי pelleted ולהוסיף 5-6 מ"ל של מדיה ותרבות כדי גלולה התא. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל.
  3. העברת נפח שווה של ההשעיה התא בקבוק T-75 כל אחד.
  4. דגירה צלוחיות של CO 2 באינקובטור 5% ב 37 ° C עבור סכום כולל של 1-3 שבועות.
  5. צלוחיות יש מודגרות 1 למשך 5 ימים, ביום החמישי, להחליף את התקשורת והתרבות בבקבוק כל אחד עם 12 מ"ל של התקשורת טריים ולחזור חממה. לאחר מכן, כל 3 ימים, להחליף את התקשורת מיזוג של כל אחד עם בקבוק 12 מ"ל של התקשורת טריים להשיג המפגש. זה חייב לעשותנה בזהירות בלי לגעת התחתונה של צלוחיות שבו התאים לצרף.

4. בידוד ציפוי של microglia ראשי

  1. לאחר תרבויות גליה מעורבים הם confluent לחלוטין, הסר צלוחיות של חממה ולכסות כמוסות קנקן עם parafilm למנוע חילוף הגזים עם האוויר הסביבתי.
  2. ללחוץ את צלוחיות ב 100 RPS (מסייע מעבדה SI-600, Jeio טק) עבור שעות 1 ב 37 ° C.
  3. לאסוף מדיה מכל צלוחיות עם פיפטה 10 מ"ל מבלי לשבש את שכבת astrocyte על פני הבקבוק. מניחים את צינורות התקשורת ב -50 מ"ל בצורת חרוט. הוסף מדיה טריים על צלוחיות וצפחות ​​וחזרה חממה.
  4. סרכזת צינורות חרוטי ב RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C.
  5. Aspirate supernatant מכל צינורות דמויי קונוס. כדורי סלולריים הם גבוהים מיקרוגליה תאים טוהר. כדורי Resuspend ב 1 מ"ל של microglia ציפוי התקשורת (DMEM FES + 10% + 1% פניצילין / סטרפטומיצין).
  6. ספור את צפיפות התאים בתקשורת resuspended באמצעותhemocytometer.
  7. להוסיף נפח מתאים של התקשורת מיקרוגליה ציפוי להשגת 2 x 10e5 תאים לכל צפיפות מ"ל. צלחת בהתאם לניתוח ניסיוני.
  8. אפשר microglia לצרף לילה.

5. נציג תוצאות

הפרוטוקול שתואר לעיל התוצאות גבוהות תרבויות טוהר העיקריים מיקרוגליה. כפי שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה לסמן מקרופאג / microglia תאים ספציפיים (Iba1), מצופה תרבויות מיקרוגליה הם> טהור 90% (איור 2). בנוסף, מכתים עבור סמנים סלולריים astrocyte, oligodendrocyte ו נוירונים ספציפיים מדגים זיהום מינימלי (איור 2). לאחר הקמת מעורבות בתרביות תאים גליה, microglia יכול להיות מבודד על ידי ניעור עד 4 פעמים רצופות. הבידוד הראשונית microglia תניב כ -2.2 x 106 תאים למ"ל או כ -9 מיליון תאים לכל 10 צלוחיות והתשואה הצפויה יורדת עם כל שא ברציפותקה. Microglia מבודדים בשיטה זו נעשה שימוש בהצלחה לחקור היכולת phagocytosis, פונקציה כגון ייצור תחמוצת החנקן, רעילות עצבית (איור 3) 13-14.

figure-protocol-1
באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול להכנת תערובת בתרביות תאים גליה ובידוד של microglia העיקרי.

figure-protocol-2
איור 2. בידוד של microglia טוהר גבוהה אומת על ידי ניתוח immunohistochemical באמצעות microglia (איבא-1, אדום), astrocyte (GFAP, ירוק), תא עצב (NeuN, אדום) oligodendrocyte (CC1, אדום) סמנים ספציפיים. מכתים את ה-DNA של תאים בתרבית על ידי DAPI (כחול) מוצג גם.

figure-protocol-3
איור 3. מבודד microglia ב שיטת descriבמיטה נעשה שימוש במספר מבחני, כולל אך לא רק, מבחני פאגוציטוזיס, מבחני תפקוד לימודי neurotoxicity. במחקרים אלה, מצאנו כי microglia (איבא-1 חיובי, ירוק), כאשר הם נחשפים לשליטה (א) או LPS (ב ') התקשורת שטופלו, להגדיל phagocytosis שלהם שכותרתו fluorescently חרוזים לטקס (אדום), אשר ניתן לכמת ( ג). יתר על כן, LPS (1ng/ml) הטיפול יכול להגביר את ייצור תחמוצת החנקן microglia (ד '). לבסוף, הן באמצעות הוספת transwell מופרד או ישירות microglia-נוירונים תרבויות, מצאנו כי microglia מודגרות עם LPS יכולות לגרום מוות של תאים עצביים, כפי שהיא נמדדת על ידי לקטט דהידרוגנז LDH () שחרור (E, F).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אמנם זה פרוטוקול מנוצל באופן שגרתי כדי לייצר microglia טהור ובריא ניסויים מחקריים, שיקול דעת מעמיק של ההיבטים הטכניים במהלך חלקים קריטיים של תהליך יהיה למזער משונות microglia מבודד. ראשית, במהלך דיסקציה של רקמת המוח מן הגורים חולדה היילודים, עבודה במועד הדרוש כדי למזער את הנזק ואת חוסר חמצן לרקמות איסכמי. עם זאת, חשוב גם להסיר לחלוטין את כיסוי meningeal מהמוח במהלך לנתיחה, כי נוכחות של קרומי המוח יתרום זיהום פיברובלסטים משמעותית בשל קצב התפשטות המהירה בתנאים תרבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תודות

ממומן על ידי תוכנית עירונית באוניברסיטת שירותי במדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
60 מ"מ X 15 מ"מ צלחות פטרי פישר המותג 0875713A
מספריים חדים המבתרים מדע כלים עדינים 14094-11
דומון # מלקחיים סטנדרטיים 7 ב טיפים, מעוגלים, 11cm מדע כלים עדינים 11270-20
דומונט # 5 מלקחיים סטנדרטיים טיפים, ישרים, 11 ס"מ מדע כלים עדינים 11251-10
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטי VWR 89039-656
5 מ"ל בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות גרנייה ביו אחת 606180
10 מ"ל בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות גרנייה ביו אחת 607180
תא 100 מיקרומטר סטרילית ניילון מסננת בז 35-2360
75 2 ס"מ רקמות תרבות צלוחיות קורנינג 430641
Dulbecco מינימלית של אמצעי חיוני (DMEM) Gibco (Invitrogen) 31053-028
ליבוביץ של L-15 בינוני Gibco (Invitrogen) 11415064
בסרום שור עוברית Gibco (Invitrogen) 16000-036
עוברי סוסים סרום דיג SH3007402
פניצילין, סטרפטומיצין Gibco (Invitrogen) 15140163
100% אתנול חברת וורנר גרהם 64-17-5
פוספט שנאגרו תמיסת מלח, 10X, pH 7.4 איכות ביולוגית, Inc. 119-069-131 1X במים מזוקקים סטרילית
Biohazard שקיות VWR 14220-028
Haemocytometer האוסר מדעי 1492
6 גם תרבית תאים צלחות עם משטח cellBIND קורנינג 3335

מקורות

  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
  3. Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
  4. Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
  5. Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
  6. Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
  7. Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
  8. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).
  9. Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
  10. Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
  11. Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
  12. Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
  13. Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
  14. Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

IBA One
בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.