מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

סיכום

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

תקציר

התנועה נייד בתגובה לגירויים חיצוניים חיונית תהליכים תאיים רבים, כולל ריפוי פצעים, דלקות כתגובה לזיהום. השיטה הנפוצה היא למדוד chemotaxis assay קאמרית בוידן, שבו תאים chemoattractant מופרדים על ידי קרום נקבובי. כמו תאים נודדים דרך הממברנה אל chemoattractant, הם דבקים התחתון של הקרום, או נפילה לתוך התקשורת הבסיסיים, והם מוכתמים מכן וספר חזותית ^1. בשיטה זו, התאים נחשפים שיפוע תלול chemoattractant חולף, אשר נחשב ייצוג ירודה של הדרגתיים נמצאו ברקמות ^2.

עוד מערכת assay, תחת agarose chemotaxis ^{assay, 3, 4} צעדים תנועת התא על פני מצע מוצק בסרט מימית דק שיוצר מתחת לשכבת agarose. שיפוע שמתפתח agarose שטחית נחשב Appropriate ייצוג טבעי הדרגתיים. Chemotaxis ניתן להעריך על ידי הדמיה מיקרוסקופית של המרחק. שניהם assay קאמרית בוידן ו-assay תחת agarose מוגדרים בדרך כלל מבחני נקודות קצה.

מערכת אוטומטית ECIS / מוניות משלבת את הגישה מתחת agarose עם החשמל Cell-המצע התנגדות חישה (ECIS) ^{5, 6.} ב assay זה, אלקטרודות היעד נמצאים כל אחד 8 חדרים. גדול נגד האלקטרודה עובר כל אחד 8 חדרים (איור 2). כל חדר מלא agarose ושתי בארות קטנים הם קיצוץ agarose משני צדי האלקטרודה היעד. אחד גם הוא מלא עם האוכלוסייה התא הבדיקה, ואילו השני מחזיק את מקורות chemoattractant לשדר (איור 3). הנוכחי עבר דרך המערכת יכולה לשמש כדי לקבוע את השינוי בהתנגדות המתרחשת כאשר תאים עוברים על האלקטרודה היעד. תאים על היעד electrodדואר להגביר את ההתנגדות של המערכת ^6. כמו כן, תנודות מהירים ההתנגדות מייצגים שינוי יחסי הגומלין של התאים עם משטח האלקטרודה מעידים על שינויים מתמשכים צורה סלולריים. מערכת ECIS / מוניות יכולים למדוד את התנועה של האוכלוסייה התא בזמן אמת על פני פרקי זמן ארוכים, אבל גם רגיש מספיק כדי לזהות את בואם של תא בודד על האלקטרודה היעד.

Dictyostelium discoidium ידוע להעביר בנוכחות חומצה פולית שיפוע ^{7, 8} ו chemotactic התגובה שלו ניתן למדוד באופן מדויק על ידי ECIS / ⁹ מוניות. Chemotaxis ליקוציט, בתגובה SDF1α וגם היריבים chemotaxis יש גם למדוד עם ECIS / ^{10 מוניות, 11.} למשל התגובה ליקוציט כדי SDF1α מוצג באיור 1.

פרוטוקול

1. ECIS / מוניות אלקטרודה הכנה

1. משטח זהב של מערך ECIS / מוניות האלקטרודה (בהיקף של 8 תאים לכל שקופית) הוא התייצב לראשונה על ידי טיפול מקדים עם ציסטאין 10 mM סטרילית במים deionized (DH ₂ O) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים.
2. Aspirate הפתרון ציסטאין מן החדר כל אלקטרודה, יש לשטוף 3 פעמים עם סטרילית DH ₂ O, ולהחליף μl 250 בינוני שלם (RPMI 1640, 10% FBS, 25 HEPES חיץ mM).
3. חבר את מערך אלקטרודות כדי ליצור קשר עם מספרי זיהוי אישיים על בעל מערך המכשיר כדי לבצע בדיקת האלקטרודה.
4. צ'יימברס המחוברים כראוי יודגשו בירוק על מסך המחשב. אם לתאי מודגשים באדום, הם לא מחוברים האלקטרודה יש ​​לשנות את מיקומו של בעל מערך קשרים עבור כל חדרי.
5. כאשר כל החדרים מחוברים, ללחוץ על כפתור "בדוק" בבקר תוכנה להרתיעלכרות את ההתנגדות הראשונית ואת ערכי קיבול עבור חדר אחד. ערכי ההתנגדות צריכה להיות בין 1600 ו 2000 אוהם, וערכים קיבול צריכה להיות בין 5 ל 6 nanofarads עבור מערך 8 קאמרית. אם החדר אינו נמצא הפרמטרים האלה מקובלים, חדר יחיד אין להשתמש כדי לאסוף נתונים.
6. נתק את האלקטרודה מבעל מערך להכין את חדרי בודדים agarose. Aspirate בינוני מלשכתו ולשטוף כל תא 3 פעמים עם סטרילית DH ₂ א '

2. הכנת agarose צ'יימברס

1. ב צינורית סטרילית מ"ל 15 פוליפרופילן חרוטי, 0.03 גרם מידה של Seakem GTG agarose ולהוסיף 1 מ"ל סטרילי PBS. החלפת מכסה צינור רופף, וממיסים agarose ב החיטוי של מחזור 2 נוזל דק '(נמס במיקרוגל אינו יעיל עבור assay זה). זה זמן קצר לא להמיס את צינור חרוטי. עבור תאים פחות אנין שאינן דורשות סרום לתרבות, (למשל discoideum Dictyostelium) 0.5%agarose יכול להתבצע בכל אמצעי מתאים נמס במיקרוגל. החיטוי הוא הכרחי עבור תאים הדורשים סרום, כמו זה יהיה מפוגל אם נמס במיקרוגל.
2. הוסף 5 מ"ל של מדיום RPMI חימם באמבטיה מלאה מים (55 ° -60 ° C) ישירות agarose חם, לריכוז סופי של 0.5% agarose ו pipet מעלה מטה בעדינות כדי לערבב.
3. 300 Pipet μl של המדיום agarose נמס לתוך תא אחד, להחליף את ECIS / מערך כיסוי מוניות ולאפשר ג'ל בטמפרטורת החדר.
4. Pipet שנותר agarose לתוך כובע של שפופרת 15 מ"ל להעריך gelling agarose. Agarose זה עודף ישמש גם בחלק 4: חיתוך בארות לתוך agarose.

3. בניית והשחזה קנית כלי חיתוך טוב

1. חדד 2 14 cannulae בוטה מד סוף, באמצעות 5/64 "קצת. סובב את קצה המקדח בפתיחת כל צינורית עם המקדחה במהירות נמוכה, מה שהופך מסוימת המקדח חותך בקצה הפנימי של כל אחד אופ צינוריתening כדי ליצור חוד החנית חדה (איור 4 א).
2. לקדוח שני חורים עד 1 "x 2" "פרספקס (איור 4 ב-D) עם 5/64" x ¼ קצת בעיתונות התרגיל. הכנס כל חידד 14 צינורית מד כך בולט במרחק שווה בין כל חור פרספקס.

4. חיתוך וולס לתוך agarose

1. לעקר cannulae 14 מד ידי קלות בוערים הטיפים. לפני חיתוך בארות בחדר ECIS, לאפשר cannulae להתקרר לטמפרטורת החדר, או לצנן cannulae ידי נגיעה agarose בכובע של שפופרת 15 מ"ל. אם הטמפרטורה של הצינורית הוא גבוה מדי, agarose יתמוססו כמו בארות קאמרית נחתכים, עיבוד בארות את מעוות ופגום.
2. יישר זוג צינורית מעל שתי נקודות זהב סביב אלקטרודה היעד בתא אחד (איור 2 ג ו - 5). הכנס את צינורית אנכית, ללא כל תנועה אופקית, לעצור במגע עדין בין צינורית ופני האלקטרודה. מוציאים בזהירות את הצינורית, שוב ללא כל תנועה אופקית. המיקום של בארות נוספות נגד הדרגתיים אפשרי גם עם תצורה של לנענע צינורית.
3. לשאוב בעדינות את התקע agarose שהותירה הצינורית, תוך שימוש סטרילי 9 "פיפטה פסטר, מחובר לחץ ואקום נמוך, עם מלכודת ואקום לתפוס פסולת agarose.
4. הוסף 300 μl של שלמות התקשורת RPMI אל פני השטח של תא אחד על 37 מעלות צלזיוס, במשך 2 דקות כדי להרוות את agarose ולאחר מכן בעדינות לשאוב התקשורת מפני השטח ואת בארות מבלי להפריע agarose.

5. טוען וולס

1. גם כל אחד מסוגל להחזיק נפח של μl 7. ל 1 גם בחדר זה, להוסיף 7 μl של תאים ההשעיה. עבור תאים Jurkat טי, השתמש 2 X10 ⁷ תאים למ"ל. תאים אלה יגיבו 7 μl של 200 ng / mL SDF-1α מדולל RPMI שלם, שאין לה נסיוב. להשתמש במדיה להשלים לבד כמו המשך שליליתרול.
2. אחרי בארות נטענים, להציג כל תא של המערך עם מיקרוסקופ הפוכה על מנת להבטיח כי כל בארות נחתכו מלא כמו שצריך. תאים צריך להיות בגבולות הגבול בסדר. אם הם נראים גם בארות, או מתפשטים מעבר לגבול התא טוב, אז הפער נוצר תחת agarose. הערה בארות שנקבעו באופן לא תקין, כפי הנתונים לא ניתן לפרש באופן אמין מן החדרים האלה.

6. איסוף נתונים

1. מניחים את האלקטרודה של בעל מערך מחדש לחבר את כריות זהב על מערך אלקטרודות על קפיץ סיכות פוגו של בעל ולחץ על "התקנה". בורות המחוברים כראוי יודגשו בצבע ירוק. אם בארות הם אדום, הם לא מחוברים האלקטרודה יש ​​מיקומו של בעל המערך.
2. בחר "8WE1" (8 טוב 1 האלקטרודה) מן התפריט הנפתח בלוח התוכנה כדי לציין את תצורת מערך.
3. בחר "לבדוק" את התוכנה ב contrלוח ol כדי לקבוע את ההתנגדות הראשונית ואת ערכי קיבול עבור כל טוב. ערכי ההתנגדות צריכה להיות בין 1600 ו 2000 אוהם, בעוד שערכי קיבול צריכה להיות בין 5 ל 6 nanofarads.
4. בחר תדרים מרובים כדי למדוד את ההתנגדות בתדרים שונים. יש בחירה אישית של תדרים, או באמצעות סדרה של תדרים המומלצות. תקן מספר רכישה הגדרות תדר ללכוד נתונים על 11 שנקבע מראש תדרים (52.5, 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 16,000, 32,000 ו 64,000 Hz) בשיעור של 8 בארות / דקה. מרווח הזמן בין המדידות יכול גם להיות מותאם אישית. איסוף נתונים תדר מרובים מאפשר ניתוח, קיבול התנגדות עכבה ו. איסוף ערכי ההתנגדות ב 4000 הרץ מספיקה בדרך כלל לחקר יונקים chemotaxis סלולריים, אבל התדרים נוספים עשויים לספק מידע בהקשרים אחרים ^12,13.
5. משך הניסוי סה"כ ניתן לקבוע, על יד ימיןהפאנל, או את הניסוי ניתן לעצור באופן ידני, על ידי לחיצה על "סיום" פעם התאים יצרו התנגדות המעידים על הגעתו האלקטרודה. הזמן שלוקח לתאים להגיע האלקטרודה תלוי בסוג התא בשימוש.
6. לחץ על "התחל" כדי להתחיל באיסוף הנתונים.

7. ניהול נתונים

1. למרות הנתונים ניתן לייצא ל-Excel, תוכנת 1600R ECIS, המלווה את מערכת ECISθ היא השיטה היעילה ביותר כדי לנתח נתונים ECIS / מוניות.
2. תוכנת ניתוח הנתונים סרגל הכלים מכיל לחצני הבחירה Z, R, ו-C אלה לקבוע אם, עכבה התנגדות או קיבול, בהתאמה, הוא זמם על הציר האנכי על ציר x (זמן שחלף).
3. ECIS / מוניות הצגת הנתונים בצורה היעילה ביותר כאשר ההתנגדות על פני זמן ב 4000 הרץ. שינויים מהירים התנגדות, או microtransients (איור 1), מעידות על תנועת הסלולר על האלקטרודה. קומפילציה, obinning r נקודות הנתונים, כך שלא כל הנקודות בגרף, לא מומלץ ECIS / מוניות, שכן הוא יהיה microtransients הממוצע מתוך הנתונים.
4. לאחר הגרף נעשה עם תוכנת ECIS1600R, זה יכול להיות מיוצא על ידי בחירת "גרף יצוא" מתפריט קובץ, ונשמר כקובץ. Tif או. בקובץ jpg.

8. נציג תוצאות

נייד chemotaxis מותווה על ידי עלייה ההתנגדות ב 4000 הרץ. ההגעה של תאים על האלקטרודה יעד מצוין גם על ידי הופעתו של תנודות מהירים התנגדות בשם microtransients או micromotion כמתואר Opp et. al., 2009 (איור 1) ^14. תוצאה שלילית מצוין באמצעות עקבית, או ירידה קלה, ההתנגדות ב 4000 הרץ, כפי שניתן לראות באיור 1 באדום. העדר microtransients הוא גם סימן של היעדרות של תנועת התא כדי האלקטרודה. הגידול ההתנגדות היא Pro ישירותportional לתאי מספר החוצים את האלקטרודה ^10. תוספת של נוגדן חד שבטי ספציפי chemoattractant או רעלנים ידוע להפריע מצמידים קולטנים ז חלבון יכול לחסום chemotaxis ^11.

באיור 1. Chemotaxis של תאים Jurkat האדם טי בתגובה SDF1α. תאים Jurkat האדם טי (2.0x10 ⁶ תאים / מ"ל) נחשפו שיפוע של SDF-1α (החל בריכוז 100 ng / ml) או RPMI 1640 כביקורת שלילית. התנגדות מנורמלת ב 4000 הרץ היה בגרף. אדם Jurkat ותאי T עבר בתגובה SDF-1α, כפי שמעיד הגידול התנגדות microtransients, בעוד שום תנועה נתפס עם חשיפה RPMI 1640.

איור 2. צפה לראש כ ECIS / מוניות אלקטרודה withouלא agarose. כל אלקטרודה ECIS / מוניות מורכב של 8 תאים בודדים. החדר כל מניות האלקטרודה גדול (א), והוא מכיל אלקטרודה היעד היחיד (ב). כל תא יש גם 2 חוגים זהב (ג), אשר משמשים כמדריך כאשר חיתוך בארות agarose עם cannulae. ריבועי זהב (ד) הם רפידות מגע המתחברים את הסיכות פוגו על מנת להחיל את AC הנוכחי האלקטרודה. האלקטרודות היעד יחידות כל אחד במעגל עם אלקטרודה נגדית גדול (ה).

איור 3. שתי בארות נחתכים לתוך תא אחד agarose-מלא. כאשר chemoattractant מתווסף 1 טוב זה מפזרת כדי ליצור שיפוע ב agarose, עם הריכוז הגבוה ביותר של chemoattract הקרוב chemoattractant היטב. התאים לטייל מתחת agarose לעבר ריכוזים גבוהים יותר של chemoattractant והוא יכול לעבור את האלקטרודה היעד. כמוהתאים לעבור את האלקטרודה היעד, עלייה של ההתנגדות נרשם על ידי התוכנה ECIS 1600R.

באיור 4. החדרת cannulae 14 2 מד אל פרספקס. א) ב '5/64 "המקדח משמש כדי לחדד את קצה הצינורית.) שני החורים יש לקדוח לתוך פרספקס כדי להכיל את cannulae 14 מד פי ירה את הפריסה. C) השתמש מקדחה כדי להבטיח את החורים הם בניצב על פני השטח pleixglass. ד ') שני Cannulae חידד מוכנסים דרך ¼ "פרספקס, 2 מ"מ זה מזה (נמדד מן הקצוות הפנימיים). Cannulae אלה חידדו מוכנסים היטב לתוך agarose לחתוך את הבארות.

איור 5. יישור cannulae עם נקודות זהב בתא ECIS / מוניות. כדי לחתוך בארות, cannulae חידד חייבלהיות מתואם עם נקודות זהב חובקים את האלקטרודה היעד בתחתית תא ECIS / מוניות. Cannulae צריך להיות מוכנס בצורה אנכית, ללא כל תנועה אופקית, והוציאו באותו אופן.

דיון

מאפיינים חדשים של assay ECIS / מוניות כוללים את יכולתה להפוך אוסף של נתונים בזמן אמת כמו תאים להגיב chemoattractant. תוך יישום נפוץ ביותר של טכנולוגיה זו היא למדוד תגובות הסלולר הדרגתיים chemotactic בודדים, או הדרגתיים המורכבות תערובות של אגוניסטים chemotaxis ואת היריבים, הגישה ECIS / מוניות גם ניתנות וריאציות על אלו תצורות יכול להיות מועיל למדי הערכת התגובה התאית. אין עדות טובה כי חופפים או הדרגתיים עוקבים יכול להשפיע על התנהגויות הסלולר בדרכים חדשות. יתר על כן, סביר להניח כי אלה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
ECIS Zθ	לביופיסיקה שימושית		http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php
ECIS אלקטרודה מערך	לביופיסיקה שימושית	8W Chemotaxis	http://www.biophysics.com/cultureware.php
Seakem GTG agarose	BioWhittaker יישומים מולקולרית	50070
RPMI1640	Cellgro	10-040
HyClone בסרום שור עוברית	Thermo Scientific	SH300703
פnicillin / סטרפטומיצין	מגה פיקסל Biomedicals	1670049	פניצילין 5,000 IU / mL: סטרפטומיצין 5 מ"ג / מ"ל
מאגר HEPES	מגה פיקסל Biomedicals	1688449	פתרון 1M, תרבית תאים כיתה
14 מד נירוסטה קנית (2) 4 אינץ'	אספקת כללי מעבדה	5-8365-1	בלאנט נקודה