הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

19.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3883

⸱

8 ביוני 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, 2Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University

במאמר זה

סיכום

במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.

תקציר

חלקיקים מתכלה צמחו כפלטפורמה צדדי על התכנון והיישום של אפי חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות בדרכי הנשימה. באופן ספציפי, polyanhydride חלקיקים מורכב חומצה sebacic aliphatic (SA), ארומטי 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) הקסאן (CPH), או amphiphilic 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) להציג בתפזורת ייחודי סחף קרקע קינטיקה 1,2 וניתן לנצל לשחרר באיטיות ביומולקולות תפקודית (למשל, אנטיגנים, נוגדנים חלבון וכד ') in vivo 3,4,5. אלו חלקיקים גם בעלי פעילות משלים מהותי, מה שהופך אותם בחירה מצוינת עבור פלטפורמת אספקת החיסון 6,7,8.

על מנת להבהיר את המנגנונים השולטים ההפעלה של חסינות מולדת בעקבות החיסון הרירית אפי, יש להעריך את התגובות מולקולרית תאית של p אנטיגןתאים כועס (נגמ"שים) אחראית ליזום התגובה החיסונית. התאים הדנדריטים הם נגמ"שים העיקריים שנמצאו בניהול דרכי הנשימה, בעוד מקרופאגים מכתשיים (AMɸ) שולטים parenchyma ריאות 9,10,11. AMɸ הם היעילה ביותר בניקוי הריאות של פתוגנים חיידקים ופסולת תא 12,13. בנוסף, זה סוג תא יש תפקיד חשוב בהובלה של אנטיגנים של חיידקים אל קשרי הלימפה וניקוז, וזה צעד ראשון חשוב בייזום של תגובה חיסונית אדפטיבית 9. AMɸ גם מביעים רמות גבוהות של זיהוי תבניות מולדות קולטנים זבל, מפרישים Pro דלקת מתווכים, וראש ותאי T נאיבי 12,14. האוכלוסייה טהורה יחסית של AMɸ (למשל, יותר מ 80%) יכול בקלות להיות מושגת באמצעות שטיפה ריאות למחקר במעבדה. תושב שנקטפו AMɸ מבעלי חיים המוסמכות החיסונית לספק הפנוטיפ מייצג של מקרופאגים אשר encounter חיסון החלקיקים מבוסס in vivo. במסמך זה אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים הקציר ותרבות AMɸ מעכברים ולבדוק את הפנוטיפ הפעלה של מקרופאגים לאחר הטיפול עם חלקיקים polyanhydride במבחנה.

פרוטוקול

1. קציר המקרופאגים מכתשיים (AMɸ) של העכבר באמצעות שטיפה ריאות

  1. מתאים ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) כגון חלוק מעבדה, כפפות חד פעמיות, והגנה עין נכונה.
  2. הכן מלאה AMɸ (cAMɸ) בינוני לפני תחילת הבציר. הוסף 2.5 מ"ל של סטרפטומיצין / פניצילין (עט / דלקת) הפתרון, 250 μL של mercaptoethanol-β (2-mercaptoethanol), ו -25 מ"ל של סרום חום מומת שור עוברית (FBS) כדי מ"ל 222.25 של שינוי Dulbelcco הנשרים בינוני (DMEM). מסנן לעקר cAMɸ בינוני באמצעות גודל הנקבוביות 0.2 מיקרומטר הבקבוק מסנן למעלה תחת ואקום.
  3. להרדים עכבר בריא על ידי מחנק 2 CO בחדר euthanization. למרות העכבר C57BL / 6 (6-8 שבועות) שימש לצורך פרויקט זה, טכניקה זו שטיפה ריאות ניתן לבצע על כל זן של העכבר. באמצעות בלון גז דחוס, שלא זרימת הגז לתוך החדר דקות 1 לפני הצבת העכבר CHענבר להבטיח כי קאמרית טעונה במלואה עם CO 2. מניחים את העכבר בתא לרגע אחד לפחות להרדים את העכבר. בנוסף, ולגרום לדימום מחודש בכל דרך העכבר לנקב לב כשיטה פיזי כדי לאשר את מותו העכבר כמתואר 1.4.
  4. הנח עכבר על גבו (צד הגב), ריסוס באתנול 70%, אתר את עצם החזה ואת, בזווית של 30 מעלות מהבטן, הכנס מחט מד 23 (מצורף מזרק 1 מ"ל) כ - 50 מ"מ לתוך חלל בית החזה . עם המיקום הנכון של המחט, ניתן יהיה לאסוף בין 0.4-1 מ"ל של דם תלוי בגודל של עכבר. לבחון את בעלי החיים על הפסקת סימנים חיוניים.
  5. במקום העכבר על ספסל במעבדה כך שהוא שוכב על הבטן שלה (צד הגחון). תרסיס העכבר עם אתנול 70% לעקר את סביבת העבודה. לצבוט את העור בערך באמצע עמוד השדרה של העכבר. באמצעות מספריים הנתיחה כי כבר מעוקרות עם אתנול 70%, לעשות חתך קטן דרך העור.
  6. תפוס את העור משני צידי החתך, ומושכים את העור בכיוונים מנוגדים לאורך ציר הגולגולת, הזנב של העכבר. כאשר נעשה בצורה נכונה, עור יוסר הפגר הבסיסית.
  7. הצוואר של העכבר אמור להראות שרירים חשופים ובלוטות. בזהירות לחתוך את רקמת ולמשוך אותו לכיוון הקדמי של העכבר באמצעות מלקחיים, ובכך לחשוף את הגרון, קנה הנשימה, והוושט של העכבר. למנוע חיתוך וריד הצוואר או העורק הראשי.
  8. קנה הנשימה נראה כעת, והוא מזהה כמו רקמת הסחוס עם טבעות סביבו. בעדינות להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים בעדינות להרים להפריד בין קנה הנשימה לוושט, הנמצא בצד הגב.
  9. לעשות חתך קטן הקדמי למקום 1 מחזיקה קנה הנשימה אבל האחורי אל הגרון. החתך צריך להיות על כ זווית ° 45 מעלות. כמו כן, לא לגמרי transect קנה הנשימה, זה ימנע ממנו retracting אלחלל הגוף.
  10. למלא מזרק 1 סמ"ק מצויד עם קטטר חתול טום עם PBS סטרילי לקראת להכניס קטטר לתוך לומן של קנה הנשימה. החזיקו את קנה הנשימה באמצעות מלקחיים ועם היד להחזיק את הקטטר קרוב לקצה כדי להגדיל את השליטה בעדינות להכניס אותו לתוך האתר חתך קנה הנשימה. בעדינות להכניס קטטר לתוך קנה הנשימה על 20 מ"מ. להחזיק את הנשימה כי הוא סביב צינורית קטטר, לשחרר את היד השנייה.
  11. באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד עם קטטר, בעדינות להחדיר 0.75 מ"ל של בטמפרטורת החדר, סטרילית PBS לריאות ואז בעדינות לשאוב בחזרה לתוך המזרק PBS. חזור על תהליך זה שלוש פעמים תוך חיצונית עיסוי החזה. נתק את המזרק מ קטטר ולחלק נוזל שטיפה לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לאחר מילוי המזרק עם 0.75 מ"ל של PBS טרי וחיבור מחדש את המזרק קטטר, חזור על שלבים 1.9 ו - 1.10 פעמיים עבור כל עכבר. ההתאוששות נוזלים יכול להיות חלקי, קבלת פחות מ ווlume רווי. אם איסוף תאים של העכבר יותר, הצב את שפופרת 15 מ"ל עם התאים שנקטפו על הקרח עד שכל lavages ריאה בוצעו.

2. עיבוד קציר שטיפה AMɸ ריאות

  1. סרכזת נוזל שטיפה ריאות ב 250 x ג'10 דקות ב 4 ° C.
  2. שימוש בטכניקה סטרילית, supernatant לערות לתוך מיכל פסולת המתאים בתוך ארון בטיחות ביולוגית. Resuspend תא גלולה ידי בעדינות וגרף צינור צנטריפוגות לרוחב החלק העליון של המדף מבחנה. הוסף 1 מ"ל של מדיום cAMɸ כדי resuspend התאים.
  3. למנות את התאים באמצעות Z1 מונה קולטר החלקיקים ידי pipetting 20 μL של תאים לתוך 10 מ"ל של Isoton II diluent בבקבוקון קולטר הדלפק. הוסף 3 עד 4 טיפות של ריאגנט II-זאפ oglobin ממוסס את הבקבוקון בעדינות מרחב זה 3 עד 4 פעמים ולאחר מכן לטעון את הבקבוקון מדגם על הדלפק כדי להשיג ריכוז התא. הקפד לתכנת את המונה עם מקדם דילול של 2 X 10 4 כדי להציגהתא ריכוז ככל שמספר התאים לכל מ"ל.
  4. לדלל תאים עד 2.5 x 10 -5 מ"ל באמצעות המדיום cAMɸ.
  5. לוותר על 2 מ"ל של 2.5 x 10 5 תאים למ"ל לבאר כל אחד מנה 6-גם בתרבית רקמה.
  6. כדי להעשיר את AMɸ, מאכלים תרבות דגירה בתוך 37 ° C חממה humidified עם אווירה 5% CO 2 על 6 שעות, כדי לאפשר לתאים לדבוק בתחתית הבאר. בעדינות לשאוב supernatant לא לשבש תאים חסיד.
  7. יש לשטוף את הבארות באמצעות סטרילית PBS (סידן ומגנזיום חינם) כדי להסיר את אי - חסיד תאים ופסולת. הוסף 2 מ"ל של מדיום cAMɸ היטב כל אחד מהם.
  8. דגירה תאים לילה בתוך 37 ° C חממה humidified עם אווירה 5% CO 2 לפני תוספת של חומרים ממריצים. לאחר שלב זה העשרה, כ 87% מכלל התאים חיובית עבור סמנים מקרופאג CD11b ו F4/80 (איור 2 ג).

3. תוספת של Polyanhydridדואר חלקיקים טיפולים בקרה

  1. לייצר חלקיקים באמצעות nanoencapsulation polyanhydride נגד ממס 15. בתהליך זה, פולימר הוא מומס מתילן כלוריד (4 ° C בריכוז של 25 מ"ג / מ"ל) ו זירז של פנטן (-20 ° C ב כלוריד 1:200 יחס מתילן: פנטן).
  2. לשקול את חלקיקי polyanhydride באמצעות עיקור לשקול עבודה על שיווי המשקל שניתן למדוד במדויק את כמויות מיקרוגרם. הוסף חלקיקים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
  3. Resuspend חלקיקים בקרח קר cAMɸ. החישובים נעשים כך לא יותר מ 0.3 מ"ל של מדיום נוסף גם כל להשיג את הריכוז הרצוי של חלקיקים. שמור את חלקיקי resuspended על הקרח עד חלקיקים נוספים לתרבות היטב.
  4. לפני הוספת חלקיקים התרבויות AMɸ, sonicate חלקיקים באמצעות sonicator גבי ספסל עם microtip. לעקר microtip ידי ריסוס עם אתנול 70% ו ניגובg עם Kimwipe סטרילי לפני sonication. Sonicate ב 10-20 ג'אול עבור S 30-45, תוך שמירה על צינור על הקרח. שימו לב ההשעיה nanoparticle macroscopically. אם החלקיקים אינם מפוזרים במידה מספקת, לאפשר השעיה להגדיר על קרח דק 1-2 על מנת להבטיח כי חלקיקים הם מתחת לטמפרטורת מעבר הזכוכית של הפולימר לפני sonicating שוב בין 30 ל 45 שניות. מטרת צעד זה היא מספקת sonication לפיזור חלקיקים, כמו CPTEG 50:50: חלקיקים CPH נוטים לצבור כאשר הם נחשפים לסביבה מימית. עם זאת, כמה אגרגטים קטנים של חלקיקים, עדיין עשויים לרחף.
  5. ההשעיה Nanoparticle (מפוזרים במידה מספקת) יש לשמור על הקרח ומשומשות מיד כדי למנוע שחיקה מוקדמת לפני השטח או צבירה.
  6. הסר את הכלים תרבות המכילים AMɸ מ חממה ומקום בארון בטיחות ביולוגית. הצלחת להטות בזווית של כ 45 מעלות ו פיפטה את כמות Mediאממ כי יתווספו ההשעיה nanoparticle (זה לא יעלה על 0.3 מ"ל). נא לא להפריע לתאי חסיד בעת הסרת בינוני.
  7. המערבולת nanoparticle polyanhydride השעיה לזמן קצר לפני הוספתו בארות המתאימים. פיפטה את כמות ההשעיה nanoparticle (לא יותר מ 0.3 מ"ל) לתוך הבאר ספציפי (ים), עם זאת, אל פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. פעולה זו יכולה לנתק את חסיד AMɸ מהבאר. חלקיקים יישב לתחתית הבאר ולפנות את התאים. על המחקרים המפורטים בדוח זה, הריכוז הסופי של חלקיקים שיתוף תרבותי עם AMɸ היה 125 מיקרוגרם / מ"ל. להמשיך בארות הבאים וקבוצות הטיפול הרצויות. כוללים קבוצות ביקורת חיוביים ושליליים, כגון בינונית בלבד 200 ng / mL lipopolysaccharide (LPS) לבארות ייעודיים.
  8. להחזיר את הכלים תרבות על 37 מעלות צלזיוס humidified חממה עם אווירה 5% CO 2 של 48 שעות. מחקרים קינטית laborator שלנוY הראו 48 שעות להיות תקופה תרבות אופטימלית להערכת הן על פני קרום התא ביטוי סמן ואת הפרשת ציטוקינים כפי שהוא מאפשר זמן מספיק לצורך שעתוק סינתזת החלבון להתרחש. למרות רמות גבוהות יותר של ציטוקינים לצבור בתקופה תרבות המורחבת (כלומר, 72 שעות), הערכת שטח פני התא ביטוי הסמן בנקודה זו בזמן ניתן מבולבל על ידי תרומה של רמות גבוהות של ציטוקינים. השינויים ביטוי סמן פני העיר לא ניתן לייחס ישירות גירוי עם חלקיקים עצמם.

4. הערכת AMɸ הפעלה באמצעות cytometry זרימה

  1. הכן הקרינה המופעל מיון תאים (FACS) חוצץ (0.1% אזיד הנתרן ו -0.1% שור סרום אלבומין (BSA)) ב 0.1 פוספט M שנאגרו מלוחים (pH 7.4) לפני קצירת מקרופאגים מצופה כי היה שיתוף תרבותי עם חלקיקים OR-ממריצים.
  2. להכין עבודה של פתרונות למאגר חסימת ואת נוגדנים חד שבטיים. כדי להכין את החיץ בלוק, לדלל עכברוש IgG (Sigma) ו anti-CD16/32 (eBioscience) עד 1 מ"ג / מ"ל ​​ו - 10 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה, במאגר FACS. לדלל סמן פני נוגדן לוח במאגר FACS לריכוז או היצרן מומלץ או ריכוז משתמש אופטימלית. לקבלת התוצאות שהוצגו בעבודה זו, את לוח סמן משטח כולל נוגדנים כנגד MHC II, CD86, CD40 ו CIRE (CD209). אנטי עכבר נוגדנים כנגד סמנים מקרופאג F4/80 ו CD11b כלולים גם בלוח באופן חיובי לזהות פנוטיפ מקרופאג במהלך ניתוח הנתונים. יש להקפיד בבחירת נוגדנים נגד מולקולות MHC-חלבון II, כמו זנים טהורים עכבר לעתים קרובות שונים haplotypes MHC-חלבון שלהם II. את הנוגדנים שנבחרו חייבים להגיב עם alloantigens MHC-חלבון ספציפי לידי ביטוי על ידי מתח העכבר של עניין.
  3. לאחר 48 שעות של דגירה עם חלקיקים ו / אוממריצים, התא במקום תרבות מנות על קרח למשך 20 דקות. כדי להסיר את מקרופאגים חסיד של הצלחות, בעדינות לגרד בארות עם מגרד תא 24 ס"מ.
  4. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, לשאוב בעדינות את התאים ובינוניים מעלה ומטה חמש פעמים כדי ליצור ההשעיה תא בודד. פיפטה את התוכן של בארות בודדים לתוך צינורות נפרדים 5 מ"ל קלקר כדי לא לערבב יחד תאים טיפולים ניסיוניים שונים.
  5. הוסף 2 מ"ל של חיץ FACS לצינור אחד.
  6. סרכזת צינורות של תאים ב 250 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  7. למזוג supernatant בעדינות תא גלולה resuspend בנוזל שיורי על ידי וגרף צינורות לרוחב החלק העליון של המדף מבחנה.
  8. כדי למנוע שאינם ספציפיים מחייב של נוגדנים חד שבטיים, להוסיף 10 μL מאגר חוסם (שהוכן 4.2) על צינור אחד של תאים. מערבולת צינורות דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  9. להוסיף נפח מתאים של נוגדנים חד שבטיים מדולל כדי צינור כל incubאכלו בחושך על קרח במשך 15 דקות. צינורות המכילים דגימות להיות מנותח צריך לקבל שילוב של נוגדנים של לוח polycromatic (אופטימיזציה הקודם של שילוב של נוגדנים יש לבצע על ידי מעבדות בודדות). קבוצות שליטה נוספת יש לכלול כראוי להגדיר את הפרמטרים על רכישת cytometer את זרימת, כולל צינורית של תאים שלא תויגו, וצינורות הפיצויים המתאימים התאים המסומנים באמצעות כל צבע אחד בנפרד. כדי להגדיר נכונה את השערים עבור ניתוח תזרים cytometric, הקרינה מינוס אחת (FMO) שולטת יש לכלול במהלך הרכישה. בקרות FMO הם תאים שכותרתו עם כל fluorochrome-מצומדות נוגדנים הנמצאים בשימוש בלוח למעט אחד מוחלף על ידי שליטה isotype שלו בהתאמה. אוכלוסיות חיוביות ושליליות (כלומר, aliquots נפרדות של תאים שטופלו מעורר ביקורת בינוני חיובי בלבד) צריך להיכלל FMO ובקרת צינורות פיצויים.
    10. הוסף 2 מ"ל של חיץ FACS אל מערבולת כל צינור, ו צנטריפוגות ב 250 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  10. למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה בנוזל שיורי על ידי וגרף צינורות לרוחב החלק העליון של המדף מבחנה.
  11. אם לוח נוגדן מורכב נוגדן לא מצומד ישירות fluorochrome אבל היא מצומדת במקום ביוטין, streptavidin fluorochrome-מצומדות צורך לדמיין את הסמן על פני השטח. בשלב זה, להוסיף נפח מתאים של streptavidin fluorochrome-מצומדות בדילול מלא ו דגירה בחושך במשך 15 דקות על הקרח. כמו 4.2, streptavidin יהיה מדולל לריכוז המומלץ על ידי היצרן או לאחד מותאם על ידי המשתמש. צעד זה נחוץ רק עבור לוחות המכילים נוגדנים ראשוניים biotinylated.
  12. לבצע צעד לשטוף כמתואר 4.10.
  13. לדלל נפח מתאים של BD ייצוב 01:03 מקבע במים deionized. הוספת 100 μL של מקבע מדולל כדי צינור אחד תוך בעדינות ווrtexing למנוע clumping של תאים. תאים שכותרתו קבוע ניתן לאחסן ביציבות ב 4 בחושך מעלות צלזיוס למשך שבוע בערך לפני הרכישה על cytometer הזרימה.

5. נציג נתונים

חלקיקים מפוברק בשלב 3.1 היה בקוטר ממוצע של 163 ± 24 ננומטר מורפולוגיה בקנה אחד עם שהשיגה במחקרים קודמים 5,16. חלקיקים בתמיסה לפני ואחרי sonication מוצגות באיור 1 כדי להדגים את הצורך sonication על מנת להבטיח פיזור נאות של חלקיקים. ניתוח תזרים cytometric של AMɸs שנקטפו לקבל ע"י שטיפה ריאות מוצג באיור 2. סימון תאים עם שילוב של CD11b העכבר נגד ועכבר נגד F4/80 נוגדנים, כמו גם את הפקדים המתאימים FMO מאפשר הקמת תיוג רקע, זיהוי AMɸs ו gating לצורך ניתוח נוסף. טיפול מקרופאגים מכתשיים עם polyanhydrideחלקיקים משפר ההפעלה כפי שמוצג על ידי עוצמת הקרינה מוגברת הממוצע של MHC II, CD40, CD86, ו CIRE (איור 3).

figure-protocol-1
1. איור 50:50 CPTEG: CPH חלקיקים לפני () ואחרי זה 30 (ב) sonication.

figure-protocol-2
2. איור ניתוח תזרים cytometric של מקרופאגים מכתשיים שנקטפו שכותרתו עם () Alexa פלואוריד 700 נגד CD11b ו PE-Cy7 FMO הבקרה, (ב) Alexa פלואוריד 700 FMO בקרה PE-Cy7 anti-F4/80 (ג ) Alexa פלואוריד 700 נגד CD11b ו PE-Cy7 anti-F4/80. המספר בפינה הימנית העליונה מייצג את אחוז פעמיים חיוביות תאים.

figure-protocol-3
איור 3. Histograms הוכחת עלייה כוונות הקרינהצפיפות לביטוי פני MHC II (א '), CD40 (ב'), CD86 (C) CIRE (ד ') לאחר התרבות המשותפת של מקרופאגים מכתשיים עם CPTEG 50:50: polyanhydride CPH חלקיקים עבור שעות 48. היסטוגרמות מתארים תוצאות AMɸ שכותרתו FMO שולטת ( figure-protocol-4 ), מטופל AMɸ תווית עם נוגדנים כנגד כל סמני שטח פני התא ( figure-protocol-5 ) ו AMɸ בתרבית עם חלקיקים ומסומן עם נוגדנים כנגד כל סמני שטח פני התא ( figure-protocol-6 ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Nanoparticle Polyanhydride פלטפורמות החיסונים הראו יעילות כאשר מנוהל intranasally ב משטרי מינון יחיד 5. מדידת ההפעלה של אוכלוסיות תאים מקומיים phagocytic של הריאות הנגרמת על ידי אספקת פלטפורמה זו מאפשרת חיסון הערכת היכולת הפוטנציאלית שלה בסופו של דבר לקדם את המערכת החיסונית אדפטיבית.

באופן ספציפי, קצירת מקרופאגים מכתשיים מנוזל שטיפה ריאות וטיפול אותם ניסוחים שונים של חלקיקים מספק תובנות לגבי היכולות של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תודות

המחברים מבקשים להודות צבא ארה"ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור תמיכה כספית ד"ר שון ריגבי מ מתקן מדינת איווה אוניברסיטת cytometry זרימה עבור מומחה סיוע טכני שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
CAM מדיה
DMEM Cellgro 15-013-CV
50 מ"מ 2-mercaptoethanol סיגמא M3148-25ML
פניצילין / סטרפטומיצין 10,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון Cellgro 30-002-CI
בסרום שור עוברית אטלנטה ביולוגיות S11150
מאגר FACS
נתרן כלורי פישר סיינטיפיק S671-500
סודיום פוספט פישר סיינטיפיק MK7868500
אשלגן כלורי פישר סיינטיפיק P217500
אשלגן זרחתי פישר סיינטיפיק P288-200
BSA (שור אלבומין סרום) סיגמא A7888
אזיד הנתרן סיגמא S2002
נוגדנים
עכברוש IgG סיגמא I4341
Anti-MS CD16/32 eBioscience 16-0161
Anti-MS MHC II haplotype IA / IE, שיבוט M5/114.15.2, מצומדות כדי isothiocyanate fluorescein (FITC) eBioscience 11-5321
Anti-CD86 העכבר, שיבוט GL-1, מצומדות כדי allophycocyanin (APC), Cy7 Biolegend 105030
Anti-CD40 העכבר, שיבוט 1C10, מצומדות כדי APC eBioscience 17-0401
אנטי עכבר CD209, שיבוט 5H10, מצומדות כדי ביוטין eBioscience 13-2091
נגד העכבר CD11b, שיבוט M1/70, מצומדות כדי Alexa פלואוריד 700 eBioscience 56-0112
נגד העכבר F4/80, שיבוט BM8, מצומדות כדי phycoerythrin (PE)-Cy7 eBioscience 25-4801
PE-טקסס אדום מצומדות streptavidin BD Biosciences 551487
מתכלים אחרים ריאגנטים
אתנול פישר סיינטיפיק A405-20 משמש% 70 (V / V)
דחוס CO 2 Linweld 16000060
1 מ"ל מזרק BD Biosciences 309659
ריבונית ½ 3 "Catcatheter האב טום קנדל 703021
בטיחות ביולוגית הממשלה NUAIRE סדרה 22
דיסקציה מספריים דיג 138082
מצבטים Roboz RS-8254
PBS, 1X ללא סידן ומגנזיום Cellgro 21-040-CM
15 צנטריפוגות צינורות מ"ל עם שווי בורג VWR הבינלאומי 21008-216
ששת גם בתרבית רקמה המטופלים צלחות שחקן המשנה 3516
תחתית Racks פלסטיק Nalgene 5970
מגרד תא 24 ס"מ TPP 99002
5 מ"ל פוליסטירן מסביב התחתונה Tube בז 352008
Pipet, סיוע XL דראמונד 4-000-105
10, 5, ו - 2 מ"ל טפטפות דיג 13-675
200 ו 10 micropipettors μL Gilson Pipetman F123601
200 ו 10 פיפטה טיפים μL דיג 02-707
BD ייצובמיצב BD Biosciences 338036
Isoton II diluent Beckman Coulter- 8546719
זאפ ב-oglobin מגיב ממוסס Beckman Coulter- 7546138
קולטר בקבוקוני פלסטיק פוליסטירן מונה Beckman Coulter- 14310-684
מבחנות BD Biosciences 352008
ציוד
בקירור צנטריפוגה Labnet 50075040
החממה Humidified CO 2 Nuaire דגם Autoflow 8500
FACSCanto תזרים Cytometer BD Biosciences 338960
קולטר החלקיקים מונה Z1 Beckman Coulter- WS-Z1DUALPC
נוזלי Sonicator ציוד לעיבוד עם Microtip Misonix מס 'דגם S-4000

מקורות

  1. Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
  2. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
  3. Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
  4. Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
  5. Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642(2011).
  6. Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
  7. Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
  8. Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
  9. Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
  10. Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
  11. Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
  12. Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
  13. Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
  14. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  15. Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
  16. Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
  17. Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4(2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD11bMHC II
הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.