Assay אישור mesothelial המתוארת כאן מנצלת את התאים שכותרתו fluorescently ואת זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו להמחיש כמותית למדוד את יחסי הגומלין של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial. Assay מתווך זה מדגים את השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן השחלות הוא הגורם המוביל של 5 מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית 1. למרות התגובה הראשונית חיובית לטיפולים, 70 עד 90 אחוז של נשים עם סרטן השחלות מפתחים גרורות חדשות, הישנות הוא לעיתים קרובות קטלני 2. זהו, אם כן, יש צורך להבין כיצד גרורות משניים להתעורר על מנת לפתח טיפולים טובים יותר עבור סרטן השחלות ביניים ומאוחר הבמה. גרורות סרטן השחלות מתרחש כאשר תאים ממאירים להתנתק מאתר הגידול הראשוני ולהפיץ ברחבי חלל הצפק. התאים המופץ יכול ליצור אשכולות תאיים, או spheroids, כי יהיה גם להישאר פנויות, או שתל על איברים בתוך חלל הצפק 3 (איור 1, סרט 1).
כל האיברים בתוך חלל הצפק מכוסים שכבה אחת, רציפה של תאים mesothelial 4-6 (איור 2). עם זאת, תאים mesothelial נעדרים מתחתגידול המוני הצפק, כפי שעולה מחקרים מיקרוסקופ אלקטרונים של האדם חלקים הכרותות רקמת הגידול 3,5-7 (איור 2). הדבר מצביע על כך התאים mesothelial אינם נכללים תחת מסת הגידול על ידי תהליך לא ידוע.
קודם ניסויים במבחנה הראו כי תאים ראשוניים סרטן השחלות לצרף ביעילות רבה יותר את תאי מטריקס מאשר תאים mesothelial 8, ומחקרים מאוחרים יותר הראו כי תאים ראשוניים mesothelial הצפק למעשה לספק מחסום הידבקות בסרטן השחלות תאים ופלישה (לעומת הידבקות ופלישה על מצעים שלא כוסו עם תאים mesothelial) 9,10. זה מראה כי תאים mesothelial לפעול כמחסום נגד גרורות סרטן השחלות. המנגנונים תאית ומולקולרית שבו תאים סרטניים בשחלות לפרוץ את המחסום הזה, לא לכלול mesothelium יש, עד לאחרונה, נותר לא ידוע.
כאן אנו מתארים את ההמתודולוגיה של ה ב assay חוץ גופית, כי מודלים של אינטראקציה בין סרטן השחלות spheroids תאים תאים mesothelial in vivo (איור 3, סרט 2). פרוטוקול שלנו מותאמת השיטות שתוארו קודם לכן לניתוח סרטן השחלות תאים אינטראקציות עם monolayers mesothelial 8-16, ו תוארה לראשונה בשנת הדוח מראה כי תאים סרטניים בשחלות לנצל ההפעלה integrin תלוי של שרירן וכוח המתיחה על מנת לקדם את הוצאת תאים mesothelial מתחת 17 אליפטית הגידול. מודל זה מנצל את זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לעקוב אחר שתי אוכלוסיות תאים בזמן אמת, מתן מידע במרחב ובזמן על אינטראקציה. על תאים סרטניים בשחלות לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), בעוד התאים mesothelial לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). RFP-להביע את סרטן השחלות spheroids סלולריים לצרף monolayer GFP-להביע mesothelial. התפשטות spheroids, לפלוש, ולהכריח את התאים mesothelial בצד יצירת חור monolayer. חור זה דמיינו כחלל שלילי (שחור) בתמונה GFP. האזור של החור לאחר מכן ניתן למדוד כמותית כדי לנתח את ההבדלים בין פעילות אישור שליטה אוכלוסיות הניסוי של סרטן השחלות ו / או תאים mesothelial. Assay זה דורש רק מספר קטן של תאים סרטן השחלות (100 תאים לכל אליפטית צילומי 20-30 spheroids בכל מצב), אז זה אפשרי לבצע את assay באמצעות יקרות דגימות תאים סרטניים ראשוניים. יתר על כן, assay זה ניתן להתאים בקלות לסינון תפוקה גבוהה.
פרוטוקול
1. סרטן השחלות Cell אליפטית גיבוש
- RFP-לבטא בתאי סרטן השחלות הם בתרבית בינוני בסיס 10% (תא מותאם אישית התרבות בינוני המכיל תערובת 50:50 של 199 ו MCDB105, 10% מומת בסרום שור עוברית 1% עט סטרפטוקוקוס). להביע RFP בתאי סרטן השחלות שהוסרו מהן תוויות, transfect תאים עם פלסמיד המכיל RFP ובחר את התאים המבטאים RFP. לחלופין, וקטורים ויראליים ניתן להשתמש כדי להביע את זמני חלבוני ניאון, או התאים יכולים להיות מראש דגירה עם אדום ניאון תא גשש צבע (Invitrogen).
- לפני היווצרות spheroids סרטן השחלות, יש צורך ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
"Assay עמילות mesothelial" המובא כאן עושה שימוש זמן לשגות מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר אינטראקציות של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial, בפירוט במרחב ובזמן רב. בעבר, מספר קבוצות 8-14 השתמשו מבחני נקודות קצה להראות כי תאים סרטניים בשחלות לצרף ולפלוש אל monolayers התא mesothelial. Assay זה הוא ייחודי בכך שהוא משתמש תאים שכותרתו fluorescently להבחין בין תאים סרטניים מתאי mesothelial, כך הדינמיקה של שתי אוכלוסיות תאים יכולים להיות במעקב לאורך ass.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה למסור.
תודות
אנו רוצים להודות הדמיה Nikon מרכז בבית הספר לרפואה בהרווארד, במיוחד ג'ניפר ווטרס, לארה Petrak וסלמון וונדי, לאימונים השימוש של מיקרוסקופים timelapse שלהם. אנו רוצים גם להודות רוזה נג ו אחים בסר לדיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 5695837 (למ 'Iwanicki) ו GM064346 כדי JSB, על ידי מענק מטעם ד"ר מרים ושלדון אדלסון למחקר רפואי קרן (כדי JSB).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| OVCA433 סרטן השחלות תאים | מתנת ד"ר דניס שלאמון | ||
| ZT תאים mesothelial | מתנת ד"ר טאן אינס | ||
| בינוני 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | יישומים תא בע"מ | 117-500 | |
| FBS חום מומת | Gibco | 10082 | |
| עט סטרפטוקוקוס | Gibco | 15070 | |
| 96 צלחות גם | קורנינג שחקן המשנה | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (פולי המה) | סיגמא אולדריץ' | 192066-25 גרם | פתרון מרובה המה לפזר אבקת 6mg מרובה המה ב 1ml של EtOH 95% |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | לדלל עד 95% ב DH 2 0 |
| תרבית תאים מכסה המנוע | Nuaire | נו-425-300 | |
| רקמת התרבות חממה | Thermo Scientific | 3110 | |
| חממה מרובה המה צלחות | Labline מכשירים | אימפריאל III 305 | |
| השולחן צנטריפוגות | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 מנה גם הזכוכית התחתונה | MatTek קורפ. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | סיגמא | F1141-במינון של 1 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse מיקרוסקופ: | |||
| מיקרוסקופ | ניקון | TI-E הפוכה ממונע מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות עם מערכת משולבת פוקוס מושלם | |
| עדשה | ניקון | 20X-0.75 המספרי apeture | |
| הלוגן transilluminator | ניקון | 0.52 NA עבודה ארוך מרחק הקבל | |
| עירור ופליטה מסננים | Chroma עוברים מסננים בודדים Nikon הדיור | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| מועבר Epifluoresce נתיב האור | סאטר | חכמים תריסים | |
| יישור קווי בקידוד ממונע הבמה | ניקון | ||
| מקורר טעונה מצמידים מכשיר המצלמה | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| הדגירה מיקרוסקופ חדר עם בקרת טמפרטורה CO 2 | שהותקן | ||
| בידוד רעידות השולחן | TMC | ||
| ש"ח אלמנטים תוכנה | ניקון | גרסה 3 |
מקורות
- Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
- Burleson, K. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
