הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

סיכום

למרות מאמצים מתמשכים לתרבויות מעבר לתנאי מזין חינם, הגזירה והתרבות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יישארו תלוי במידה רבה בשיתוף עם תרבויות ניזונים עובריים של עכבר (MEFs). כאן, אנו מציגים שיטה חדשנית להסרת מתקני האכלה במהירות מתרבויות hESC לפני הניסויים.

תקציר

פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) שמשו להקמת תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) תרבויות לאחר בידוד הבלסטוציסט ^1. מערכת זו שומרת על מזין hESCs מעובר התמיינות ספונטנית במהלך התרחבות תא. עם זאת, שיטה זו משותפת התרבות היא עבודה אינטנסיבית, דורשת כוח אדם מיומן, וטוהר hESC נמוך תשואות ^4. מעבדות רבות ניסו למזער את מספר התאים מזינים בתרבויות hESC (כלומר שילוב מנות מטריצה ​​מצופות או סוגי תאים אחרים מזין ^5-8). מערכות תרבות שונות אלו הראו תוצאות מבטיחות, אבל עדיין לא החליפו את השיטה הסטנדרטית לhESCs culturing עם fibroblasts embyronic עכבר C שטופל בmitomycin כדי לעכב בידול ספונטני לא רצוי של תרבויות hESC. לכן, התאים המזינים המשמשים בהרחבת hESC יש להסיר במהלך ניסויי בידול. למרות מספר טכניקות זמינות לטיהור שיתוף hESClonies (FACS, מקים, או שימוש בסמי וקטורים עמידים) ממתקני האכלה, טכניקות אלה הן עבודה אינטנסיביות, יקרים ו / או הרסני לhESC. מטרתו של פרויקט זה הייתה צריך להמציא שיטה לטיהור שמאפשרת הקצירה של אוכלוסייה טהורה של hESCs. אנו מציינים כי בתרבות hESC מחוברת, אוכלוסיית MEF ניתן להסיר באמצעות שאיפה פשוטה ומהירה של גיליון MEF. הסרה זו תלויה במספר גורמים, כולל קשירה לרוחב תא לתא של MEFs שיש זיקה מחייבת נמוכה למנת תרבות סטירן, והיכולת של מושבות תאי הגזע לדחוף את fibroblasts החיצוני בדור שלהם " נישה ". HESC היה אז נבדק לSSEA-4, Oct3 / 4 ו1-81 ביטוי Tra עד 10 ימים לאחר הסרת MEF כדי להבטיח תחזוקה של pluripotency. יתר על כן, מושבות hESC היו מסוגלות להמשיך ולצמוח מהם לתצורות גדולות יותר לאחר הסרת MEF, מתן רמה נוספת של התרחבות hESC.

פרוטוקול

1. הכנה מתעלקת עכבר עוברי

1. MEFs שימוש בשיתוף תרבות hESCs יש לטפל קודם לכן על ידי הקרנה או mitomycin-C כדי לעכב את התאים עוברים מחטיבה.
2. שעות לפני זריעת MEF, מעייל כל פלזמה 60 מ"מ טופלו מנת התרבות עם 2 מ"ל של 0.05% לטין.
3. הפשר בקבוקון של MEFs טופל וצלחת ב~ 20,000 תאים / ^{2 סנטימטר.}
4. אפשר התאים לדבוק בן לילה.

2. hES....

דיון

השיטה שהוצגה בכתב היד הזה מציעה אלטרנטיבה מהירה וזול יותר לחיסול תאים מזינים פיברובלסטים מתרביות תאים עובריות אנושיות. ההסרה המוצלחת של fibroblasts תלויה בקיומו של monolayer חוזקה confluent של תאים אלה שמתפתחים בתרביות תאי גזע ארוכות יותר. לאחר 7-10 ימים, מושבות hESC הגוברות לדחוף את fibroblasts המזין בכיוון החוצה, שהניבה monolayer פיברובלסטים צפופים יותר ויותר בין מושבות. מצורף תא לתא החזק בתוך monolayer פיברובלסטים תאפשרו ההסרה המהירה שלה כגיליון תא. יש לציין בזהירות כי טכניקת ט.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
DDR2	סנט קרוז	7555	מרקר פיברובלסטים
Dapi	Calbiochem	268298	מרקר גרעין תא
SSEA-4	Millipore	MAB4304	אדם ESC מרקר
Oct 3/4	סנט קרוז	9081	אדם ESC מרקר
Flk-1	BD פארמה	555307	מרקר בידול מוקדם
Tra-1-81	Acris	AM20377AF4-S	אדם ESC מרקר

טבלת 1. טבלה פלילית ספציפיותרבותיי משמשות לimmunostaining hESC.