לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

1. הגדרת ניתוח הערות

1. לפני הניתוח לעקר ציוד ומכשירים כירורגיים. חומרים מתכלים המשמשים ההליך הכירורגי הסטרילי של עכברוש אחד כוללים 1 וילון להיות layed בתור משטח סטרילי עבור מיקום של מכשירים, אחד עם חור וילון מראש לחתוך כ -0.5 x 1.5 בשנת במרכז כדי להיות ממוקם על עכברוש , ו גזה. חור חתוך מראש על וילון יהיה ליישר עם החתך נעשה על עכברים. הכלים הדרושים לניתוח כולל 1 זוג מספריים רמת לשמש לחתוך חומרים לתפירה, שני מלקחיים ואת בעל מחט בסדר לטיפול ותופס של תפר, ואת אזמל עם להב. יצרנו עבורכם רשימה הכלים הנפוצים בשימוש במעבדה שלנו בטבלה של חומרים כירורגית כלים ספציפיים. עם זאת, בחירת הכלי הסופי תלוי בהעדפות הנסיין.
2. להכין את שטח הניתוח. מניחים 100 מ"ל 0.9% שקית מלח סטרילית תחת כרית חימום על מנת להבטיח כי מי מלח כי בא במגע Wרקמת ith לפדר הוא מראש לחמם כ 37 ° C. כחלופה מלוחים, ניתן להשתמש בתמיסת רינגר או אחרת חיץ פיזיולוגית. פריסת מכשירי ניתוח מעוקרות ואספקה ​​על וילון סטרילי עבור גישה נוחה במהלך ההליך החצנה. כמו כן, תצטרך סטריליים עצה כותנה applicators ואת המתאימים 3 סוגי תפרים (4-0, 5-0, ו 7-0). עושה חבילות בטוח הם מראש נפתחה כך את החומרים ניתן לגשת עם טיפול סטרילי. לבסוף, לחטא את שלב טרום שונה פלסטיק ידי טבילה אותו אתנול 100% במשך לפחות 5 דקות. הבמה היא 100 מ"מ צלחת פטרי עם חור אליפטי לחתוך במרכז (איור 1). כלי Dremel ניתן בתחילה לעשות, ואם יש צורך, להרחיב את החור. לאחר חור הוא עשה, בקצוות של פלסטיק חתך עשויים חלקה באמצעות נייר של גרגרי חול שונים. בשלב נשטף אז, סוף סוף, חימר או דוגמנות אינרטי (שנרכש בחנות אמנות מקומית) או silicעל דבק נוסף אל שפת הבור על מנת לספק הרים, משטח חלק. לפני מגע עם רקמות, שלב יהיה צורך לשטוף כראוי עם תמיסת מלח סטרילית.
3. עבור דגם זה של אנגיוגנזה, אנו משתמשים בדרך כלל חולדות זכרים בוגרים Wistar (350 ± 25 גרם). זני עכברים אחרים והגילאים ניתן להשתמש. במעבדה שלנו, חולדות הן בהרדמה באמצעות זריקה תוך שרירית עם קטמין (80 מ"ג / ק"ג BW), xylazine (8 מ"ג / ק"ג BW), וכן אטרופין (0.08 מ"ג / ק"ג BW). לאחר כ 5 דקות, השפעת ההרדמה הוא אישר עור הבטן של חולדה מגולח.

2. לפדר עכברוש החצנה דגם

1. מקם את החולדה הרדים על גבו על כרית חימום לשמירה על חום גופם. טכניקות אספטיים משמשים במהלך ההליך הכירורגי. ללבוש כפפות סטריליות ואינם מאפשרים מכשירים וציוד ליצור קשר לא סטריליים משטחים שאינם הרקמות חולדה.
2. נקו את אזור הבטן עם מגבונים לסירוגין USIng גזה סטרילית ספוגה איזופרופיל 70% ויוד.
3. באמצעות להב סכין המנתחים, לעשות חתך קטן (כ 0.75 אינץ') אורך לאורך העור ואז Linea alba כ 1 ס"מ מתחת עצם החזה.
4. מניחים את וילון מראש על קיצוץ בסעיף הבטן, כך פתח מתיישר עם החתך.
5. להפעיל לחץ בעדינות סביב החתך. בדרך כלל זה יהיה לגרום לחשיפה של המעי הדק מספיק כדי להיות מזוהה בקלות.
6. באמצעות קצה applicators כותנה, משוך בעדינות את החלק של המעי הדק ולאתר מעי. כמו לפדר הוא שלף, יש layed בעדינות החוצה בשלב פלסטיק (איור 2).
7. זהה 6-8 חלונות vascularized mesenteric. חלון mesenteric מוגדר קרום שקוף דק בין העורקים / ורידים זוגות המזינים את המעי הדק (איור 2).
8. רשום את שעת ההתחלה של החצנה. השאירו את mesenteר"י סעיף exteriorized במשך 20 דקות. בתקופה החצנה, השתמש במזרק סטרילי (5 מ"ל) כדי לחדש לסירוגין מלוחים בצלחת פטרי כדי להבטיח רקמות נשאר שקוע ולא להתייבש.
9. במהלך תקופה של 20 דקות חשיפה, סמן את 2 חלונות mesenteric במיקום מרכזי עם תפר 7-0 סטרילית. הסימנים צריכה להיעשות באזור שומן ליד המעי.
10. להחזיר את האזור exteriorized של לפדר את חלל הבטן.
11. סגור את שרירי הבטן עם תפר 5-0 monofilament בתבנית קטע.
12. סגור את העור עם תפר monofilament 4-0 בתבנית קטע.
13. לנגב את השטח לצורך איחוי עם מגבונים לסירוגין באמצעות גזה סטרילית ספוגה isopropoyl 70% ויוד.
14. מורחים ג'ל סיכה עין על שתי העיניים של עכברוש. מטרת סיכה העין היא למנוע התייבשות של הקרנית במהלך הליך ההחלמה כירורגית. יישום של חומר סיכה עין יש להחיללפני תחילת התערבות כירורגית. במידת הצורך, להירשם מחדש חומר סיכה בעין לפני החזרת חולדה לכלוב שלה עבור התאוששות.

3. רקמת קציר קיבוע

1. ביום גירוי לתגובה עניין, להרדים ו להרדים חולדה. במעבדה שלנו, חולדות הן בהרדמה באמצעות זריקה תוך שרירית עם קטמין (80 מ"ג / ק"ג BW), xylazine (8 מ"ג / ק"ג BW), וכן אטרופין (0.8 מ"ג / ק"ג BW) ואז מורדמים באמצעות הזרקת intracardiac של beuthanasia. Beuthanasia הוא פתרון pentobarbital נתרן / פניטואין, שניתן להשתמש בהם על המתת חסד מהיר ונטול כאבים. לכל העכברים במעבדה שלנו בדרך כלל מזריק 0.1-0.2 מ"ל.
2. לפתוח מחדש את חלל הבטן בעדינות להסיר את המעי הדק ולאתר את שני החלונות מסומנים.
3. לחתוך את כל החלונות mesenteric exteriorized באמצעות מלקחיים ומיקרו מספריים. כולל הגבול של חלון לכל שומן יש יתרון על רקמות לאחר מכן מתפשט על שקופיות מיקרוסקופ. מיד, לטבול כל חלון PBS. כאשר חיתוך, מנסים להימנע חיתוך דרך העורק / וריד זוגות בתוך הגבול השומן של Windows כדי למזער את הדם ממלא את הפוטנציאל של Windows. כמו כן, למזער חיתוך דרך המעי כי התוצאות תוכן המעי ליצור קשר עם Windows.
4. להשתמש במלקחיים כדי להפיץ רקמות על שקופיות מיקרוסקופ בעלי מטען חשמלי חיובי. שתי רקמות יכול להיות מותקן בכל שקופית.
5. אפשר הרקמות באופן חלקי יבש באמצעות להב סכין המנתחים להסיר את עודפי השומן.
6. רקמות מוכנים כעת להיות קבוע. שיטות קיבוע אופייניות ניתן להשתמש. במעבדה שלנו, אנחנו בדרך כלל לתקן את השקופיות של מתנול (-20 ° C) למשך 30 דקות. תיוג מוצלח יש גם הופיע עם רקמות יתבטל. שיטות קיבוע יכול לסמוך על הנוגדן המועדף עליך.

4. רקמת Immunolabeling

1. רקמות יכול עכשיו להיות מתויג בדרך כלל בהתאם להוראות לכל נוגדן עבור אימונוהיסטוכימיה. לאור העניין שלנו לזהות את התפקידיםpericytes של כלי דם במהלך אנגיוגנזה, במעבדה שלנו בדרך כלל תוויות עבור לתאי אנדותל ו perivascular ^{10, 12, 13.} תוויות שימושיים כדי לזהות תאים האנדותל לאורך ההיררכיה של רשתות כלי הדם הם נוגדנים נגד PECAM או BSI-lectin. סמנים סלולריים Perivascular בשימוש ברקמות זו כוללים NG2, desmin, SM-α אקטין, PDFGRβ, ומעמד III-β טובולין. בהמשך, בסעיף 3.3, יש לנו ברשימה פרוטוקולים פרוטוקולי immunolabeling colorimetric ו ניאון PECAM.
2. לפני הדגירה הנוגדן הראשוני הראשוני, שקופיות הם מיובש שואב להסיר את הפתרון למאגר עודף. כמו כן, רקמות מתוארים תחילה בעט שעווה כדי למנוע זרימה בלתי מבוקרת של פתרונות נוגדנים מן הרקמה. לבסוף, כל הצעדים תיוג מלוות צעדים כביסה. לשטיפת מדרגות, מגלשות ממוקמים בתוך צנצנות צביעה. פתרון חיץ הוא החליף 3 פעמים במהלך תקופת הרחצה.
3. אנדותל נוגדנים סלולריים תיוג הליכים: <p > PECAM Colorimetric Lableing
   1. הנוגדן העיקרי הדגירה: לטפטף כ 100-200 מ"ל נוגדן ראשוני פתרון (1:200 חד שבטי נוגדן עכבר biotinylated CD31 בדילול במאגר נוגדנים (0.1% ב Saponin PBS BSA + 2%)) על גבי כל לרקמות; לוודא את הרקמה כולה מכוסה פתרון נוגדנים. הדגירה של 1 שעה בטמפרטורת החדר.
   2. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
   3. הדגירה נוגדנים משני: נוגדנים משני בטפטוף פתרון (VECTASTAIN עלית פתרון ABC וקטור מעבדות; peroxidase משני streptavidin פתרון נוגדנים) על גבי הרקמות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
   4. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
   5. דגירה רקמות עם וקטור נובה האדום במשך 15 דקות. ואז לעלות רקמות עם מים.
   6. הר שקופיות: טובלים שקופיות אתנול 95% 10 פעמים. לטבול מחליק באתנול 100% למשך 2 דקות. שקופיות לטבול באתנול עוד 100% כדיlution במשך 2 דקות. ואז לטבול שקופיות ב רצופים פתרונות קסילן 100% 2 דקות כל אחד. אפשר לייבש ולכסות הרקמות בשכבה דקה של VectaMount ו coverslip.

   PECAM תיוג פלורסנט

   1. הנוגדן העיקרי הדגירה: לטפטף כ 100-200 מ"ל נוגדן ראשוני פתרון (1:200 חד שבטי נוגדן עכבר biotinylated CD31 בדילול במאגר נוגדנים (0.1% ב Saponin PBS BSA + 2%)) על גבי כל לרקמות; לוודא את הרקמה כולה מכוסה פתרון נוגדנים. הדגירה של 1 שעה בטמפרטורת החדר.
   2. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
   3. הדגירה נוגדנים משני:. נוגדנים משני בטפטוף פתרון ((1:100 streptavidin-CY3 בדילול במאגר נוגדנים (0.1% ב Saponin PBS BSA + 2%)) על גבי הרקמות דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
   4. לשטוף עם רקמות saponin PBS 0.1% במשך 30 דקות.
   5. הר שקופיות: לטפטף 50:50 PBS עם גליצרול על גבי הרקמות. לכסותעם תלוש כיסוי. לאחר מכן, השתמש לק כדי לאטום את הפער בין שער תלוש ולהחליק.

5. נציג תוצאות

תמונות מייצגות של לפדר רקמות חולדה שכותרתו immunohistochemically עבור PECAM מוצגים באיור 3. PECAM תיוג מזהה את כל סוגי כלי לאורך ההיררכיה של שיפוץ רשתות כלי הדם והוא יכול לשמש לכמת מדדים angiogenic על גירוי נקודות ספציפיות זמן ההודעה. PECAM תיוג גם מאפשר קביעת arterioles לעומת venules. Arterioles האכלה בדרך כלל מציגים בקטרים ​​קטנים יותר מאורך מורפולוגיה תא האנדותל בהשוואה venules לזווג (איור 4). נימים נבטים נימי ניתן לזהות על פי קוטר כלי שלהם ואת המיקום היחסי בתוך הרשת. מאפיינים טיפוסיים של רשתות שיפוץ כולל עלייה נימי הנבטה, צפיפות כלי שיט, אזור vascularized ו tortuos venularity. כימות מדדים angiogenic שונים מזהה את מהלך הזמן של צמיחה רשת (תרשים 5). נימי צומח קיימים כלי, פסגות בין יום 3 יום ו 5 ו חוזר לרמת unstimulated של 10 יום. עלייה זו חולפת על הנבטה מלווה עלייה בצפיפות כלי הדם באזור vascularized. כראיה על עיצובו מחדש של כלי גדול יותר במודל זה, מספר מגזרים עורקיק ו ורדיד גם מעלה במהלך הזמן.

במעבדה שלנו, מודל זה נעשה שימוש כדי לזהות שינויים פנוטיפי הסלולר בנקודת זמן מסוימת במהלך תהליך זה שיפוץ ^{10, 11.} כך, למשל, בכיתה ג'β-טובולין מזהה pericytes לאורך כלי angiogenic (איור 6). ברקמות unstimulated, מעמד III-β טובולין ביטוי ספציפי העצב. לעומת זאת, בתקופת השיא של נימי הנבטה, בכיתה III-β טובולין באה לידי ביטוי על ידי תאים perivascular. סוג זההתוצאה מדגישה את השימוש במודל זה angiogenic פשוט חזקים כדי לזהות סוגי תאים חדשים המעורבים בתהליך angiogenic.

באיור 1. תמונות של שלב פלסטיק לפני ואחרי-שינוי. בשלב שלפני שונה הוא מאכל 100 מ"מ פטרי. השינויים כוללים קיצוץ חור אליפטי במרכז, בנוסף הבאות של פלסטלינה או דבק סיליקון אל שפת הבור ליצירת פני השטח, העלה חלק. משטח זה מספק גבול פנימי המאפשר superfusion של Windows mesenteric exteriorized. סרגל קנה מידה הוא 1 ס"מ.

איור 2. תמונה של האזור mesenteric exteriorized. חלונות Mesenteric מוגדרים ממברנות שקופים דקים בין העורקים / ורידים זוגות המזינים את המעי הדק. במהלך החצנהמשך הזמן, באזור mesenteric מונח החוצה שקוע בתוך מי מלח בתוך צלחת פטרי שונה. מודלים אינרטי חימר צהוב מספק משטח חלק של לפדר להימשך דרך חור חתוך מראש. סרגל קנה מידה הוא 1 ס"מ.

איור 3. תמונות נציג של רשתות כלי הדם mesenteric מרקמות ורקמות unstimulated ב 3 ו 10 ימים החצנה תפקיד לפדר. PECAM תיוג לזהות את ההיררכיה של רשתות כלי הדם, כולל, arterioles (א '), venules (V) נימים (C). גירוי פוסט, רשת כלי הדם מוצגת עלייה הנבטה נימי (ראשי חץ) וצפיפות כלי. סרגל קנה מידה היא 100 מיקרומטר.

באיור 4. נציג תמונות של עורקיק / זוגות ורדיד בתוך mesenteric למבוגרים רשת כלי הדם עכברושs. בתמונות שני, arterioles (א ') ניתן להבדיל בין venules (V) על בסיס בקוטר יחסית קטן יותר מאורך התא מורפולוגיה האנדותל. ברים הם בקנה מידה 20 מיקרומטר.

איור 5. כימות נציג מדדים angiogenic במהלך השעה שלאחר כלי הדם החצנה הצמיחה לפדר. א) שטח כלי דם ליחידת שטח הרקמה. ב) מספר נבטים נימי הדם ליחידת שטח. ג) סה"כ אורך כלי הדם ליחידת שטח כלי הדם. * מייצג הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצת unstimulated. השוואות סטטיסטיות נעשו באמצעות ניתוח שונות חד כיווני ואחריו במבחן של דאן. (P <0.05). האו"ם מייצג unstimulated.

איור 6. תמונות ניאון נציג של רשתות כלי הדם mesenteric מרקמות ורקמות unstimulated ב 3 ו 10ימים לפרסם החצנה של לפדר. Immunofluorescent PECAM תיוג (אדום) מזהה בתאי האנדותל, ומעמד III-β טובולין תיוג (ירוק) מזהה העצבים (ראשי חץ) ותאי perivascular (חיצים). תאים Perivascular זמני upregulate הכיתה III-β טובולין במהלך נימי הנבטה. ברשתות כלי הדם unstimulated, מעמד III-β טובולין הוא עצב מסוים אינו מזהה תאים perivascular. 3 ימים גירוי לתגובה, מעמד III-β טובולין חיובי תוויות בתאי perivascular יחד microvessels. ביום 10, בכיתה III-β טובולין דפוס הביטוי מתחיל לחזור תרחיש unstimulated. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר.

איור 7. תמונות תומכות היתכנות מראש שכותרתו תאים מעקב שימושית מקומית במהלך הצמיחה רשת כלי הדם מומרץ ע"י החצנה לפדר. התאים היו superfused על mesenterIC-Windows בתקופה של 20 דקות החצנה. 1 ביום שלאחר הניתוח, תאים DiI שכותרתו (אדום) נצפו במישור דאם מרחק עם PECAM חיובית microvessels (ירוק). א, ב) דוגמאות DiI בתאי מח העצם שכותרתו מציג מעוגלות מוארך מורפולוגיות. במקרים מסוימים (חיצים) היו תאים מוארכים יחד microvessels. ג) דוגמה מקבץ של DiI שכותרתו בתאי גזע mesenchymal ליד קצה נימי נבט (החץ). ברים הם בקנה מידה 50 מיקרומטר (א), ו -20 מיקרומטר (B, C).

אין לנו מה למסור.