מאמר שיטה

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

18.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3991

⸱

20 ביולי 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Center for Neuroscience Research, Tufts School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Geriatrics & Gerontology, Wake Forest Baptist Medical Center, 3Department of Medicine, Boston University Medical Center

במאמר זה

סיכום

היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

תקציר

מיזוג מיטוכונדריאלי ממלא תפקיד חיוני בהומיאוסטזיס של סידן מיטוכונדריאלי, בביואנרגטיקה, באוטופגיה ובבקרת איכות. המיזוג נמדד בתאים חיים באמצעות המרה פוטו-כימית של GFP הניתן להפעלה פוטו-כימית המכוון למטריקס (mtPAGFP) בתת-אוכלוסייה של מיטוכונדריה. הקצב שבו המולקולות שהומרו פוטו-כימית מגיעות לשיווי משקל בכלל אוכלוסיית המיטוכונדריה משמש כמדד לפעילות המיזוג. עד כה, המדידות בוצעו בגישת time lapse של תא בודד, המכמתת את שיווי המשקל בתא אחד לאורך שעה. כאן, אנו מגדילים ומסרטגים שיטה קודמת שפורסמה לתאים חיים, המבוססת על שימוש ב-mtPAGFP ובריכוז נמוך של TMRE (15 nm). שיטה זו כוללת הפעלה פוטו-כימית של חלק קטן מהרשת המיטוכונדריאלית, איסוף סדרות (stacks) ברזולוציה גבוהה של חתכים קונפוקאליים בכל 15 דקות למשך שעה, וכימות השינוי בעוצמת האות. בהתאם למספר גורמים, כגון קלות מציאת תאים המבטאים PAGFP והאות של האזורים שהופעלו פוטו-כימית, ניתן לאסוף כ-10 תאים בתוך מרווחי הזמן של 15 דקות. הדבר מספק שיפור משמעותי ביעילות הזמן של בדיקה זו, תוך שמירה על כימות תת-תאי ברזולוציה גבוהה וכן על הפרמטרים הקינטיים הדרושים כדי ללכוד את פרטי ההתנהגות המיטוכונדריאלית בסביבתה הציטוארכיטקטונית הטבעית.

דינמיקה מיטוכונדריאלית ממלאת תפקיד בתהליכים תאיים רבים, כולל נשימה, ויסות סידן ואפופטוזה1,2,3,13. מבנה הרשת המיטוכונדריאלית משפיע על תפקוד המיטוכונדריה ועל האופן שבו הן מקימות אינטראקציה עם שאר התא. רשתות מיטוכונדריאליות, העוברות תהליכי חלוקה ומיזוג מתמידים, מקבלות צורות שונות הנעות בין רשתות ממוזגות מאוד לרשתות מפוfragmented יותר. באופן מעניין, מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, Charcot Marie Tooth 2A ואטרופיה אופטית דומיננטית נמצאו במתאם עם מורפולוגיה מיטוכונדריאלית משובשת, ובייחוד רשתות מפוfragmented4,10,13. לעיתים קרובות, בעקבות הפיצול (fragmentation), המיטוכונדריה הופכות לדה-פולריזיות, וצבירה של תופעה זו מובילה לפגיעה בתפקוד התא18. הוכח כי פיצול מיטוכונדריאלי (fission) מהווה אות המדרבן את התא להתקדם לעבר אפופטוזה. הוא יכול גם לספק מנגנון להפרדת מיטוכונדריה דה-פולריות ולא פעילות כדי לשמור על חוסנה של מרבית הרשת14. מנגד, מיזוג (fusion) של מיטוכונדריה מוביל לשיתוף של חלבוני מטריקס, מומסים, mtDNA והמדרג האלקטרוכימי, ונראה כי הוא מונע התקדמות לאפופטוזה9. השפעתם של פיצול ומיזוג מיטוכונדריה על ההומאוסטזיס התאי ובסופו של דבר על תפקוד האורגניזם דורשת הבנה מעמיקה יותר, ולכן נדרשים פיתוח ואופטימיזציה מתמשכים של הדרכים לאיסוף מידע על תופעות אלו.

בדיקות קיימות של היתוך מיטוכונדריאלי חשפו תובנות שונות לגבי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית, כאשר לכל אחת מהן יש יתרונות משלה. בדיקת היתוך היברידית המבוססת על PEG7 מערבבת שתי אוכלוסיות של תאים המסומנים באופן שונה (mtRFP ו-mtYFP), ומנתחת את כמות הערבוב והקו-לוקליזציה של פלואורופורים בתאים מותכים ורב-גרעיניים. למרות ששיטה זו סיפקה מידע בעל ערך, לא כל סוגי התאים מסוגלים להתמזג, והתנאים שבהם מוגבר ההיתוך כוללים שימוש בתרופות רעילות שעשויות להשפיע על תהליך ההיתוך הנורמלי. לאחרונה פותחה טכניקה נטולת-תאים, המשתמשת במיטוכונדריה מבודדות כדי לצפות באירועי היתוך על בסיס בדיקת לוסיפראז1,5. שניים מקווי תאים אנושיים מסומנים עם החלק הקצבי האמינו או הקרבוקסילי של Renilla luciferase, יחד עם leucine zipper להבטחת דימריזציה בעת הערבוב. מיטוכונדריה מבודדות מכל קו תאים וממוזגות. תגובת ההיתוך יכולה להתרחש ללא ציטוזול בתנאים פיזיולוגיים בנוכחות אנרגיה, טמפרטורה מתאימה ופוטנציאל ממבנה מיטוכונדריאלי פנימי. באופן מעניין, נמצא כי הציטוזול מווסת את מידת ההיתוך, מה שמעיד על כך שסיגנל תאי דרוש לוויסות תהליך ההיתוך 4,5. בדיקה זו תהיה שימושית מאוד לסריקה בthroughput גבוה לזיהוי רכיבים במנגנון ההיתוך וכן תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על דינמיקה מיטוכונדריאלית. עם זאת, יהיה צורך בבדיקות מיטוכונדריאליות מפורטות יותר של התא השלם כדי להשלים בדיקה זו in vitro ולצפות באירועים אלה בתוך סביבה תאית.

טכניקה לניטור דינמיקה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים נמצאת בשימוש כבר תקופה מסוימת והיא מבוססת על GFP המכוון למיטוכונדריה וניתן להפעלה פוטו-כימית (mtPAGFP)6,11. עם ביטוי של mtPAGFP, חלק קטן מרשת המיטוכונדריה עובר הפעלה פוטו-כימית (10-20%), והתפשטות האות לשאר רשת המיטוכונדריה נרשמת מדי 15 דקות למשך שעה באמצעות דימות קונפוקאלי בשיטת time lapse. כל אירוע מיזוג מוביל לדילול של עוצמת האות, מה שמאפשר כימות של קצב המיזוג. למרות שמיזוג וביקוע מתרחשים ללא הרף בתאים, טכניקה זו מנטרת רק מיזוג, שכן ביקוע אינו מוביל לדילול של אות ה-PAGFP6. סימון משותף ברמות נמוכות של TMRE (במינון של 7-15 nM בתאי INS1) מאפשר כימות של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. כאשר מיטוכונדריה נמצאות במצב של היפר-פולריזציה הן קולטות יותר TMRE, וכאשר הן עוברות דפולריזציה הן מאבדות את צבע ה-TMRE. מיטוכונדריה שעברו דפולריזציה אינן בעלות פוטנציאל ממברנה מספיק ונוטות לא להתמזג ביעילות, אם בכלל. לכן, ניתן לעקוב אחר מיטוכונדריה הממזגות באופן פעיל באמצעות רמות נמוכות אלו של TMRE9,15. הצטברות של מיטוכונדריה שעברו דפולריזציה וחסרות אות TMRE עשויה להוות סימן לפוטוטוקסיות או למוות תאי. ריכוזים גבוהים יותר של TMRE הופכים את המיטוכונדריה לרגישות מאוד לאור לייזר, ולכן יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מסימון יתר ב-TMRE. אם השפעת הדפולריזציה של המיטוכונדריה היא נושא העניין, ניתן להשתמש בטכניקה המעסיקה רמות מעט גבוהות יותר של TMRE ואור לייזר אינטנסיבי יותר כדי לגרום לדפולריזציה של מיטוכונדריה באופן מבוקר (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). כדי להבטיח שרעילות עקב TMRE אינה מהווה בעיה, אנו מציעים לחשוף תאים טעונים (3-15 nM TMRE) לפרמטרי הדימות שבהם ייעשה שימוש במערך (אולי 7 ערימות של 6 חתכים אופטיים ברצף), ולהעריך את בריאות התאים לאחר שעתיים. אם המיטוכונדריה נראות מפוצלות מדי ותאים מתים, ניתן להשתמש במסמנים מיטוכונדריאליים אחרים, כגון dsRED או Mitotracker red, במקום TMRE.

שיטת ה-mtPAGFP חשפה פרטים על התנהגות הרשת המיטוכונדריאלית שלא ניתן היה להדגים בשיטות אחרות. לדוגמה, ידוע כעת כי איחוי מיטוכונדריאלי יכול להיות מלא או חולף, כאשר תכולת המטריקס יכולה להתערבב ללא שינוי במורפולוגיה הכללית של הרשת. בנוסף, ידוע כי ההסתברות לאיחוי אינה תלויה במשך המגע ובממדי האורגנלה, ומושפעת מניידות האורגנלה, מפוטנציאל הממברנה ומהיסטוריה של פעילות איחוי קודמת8,15,16,17.

בכתב יד זה, אנו מתארים מתודולוגיה להרחבה (scaling up) של הפרוטוקול שפורסם בעבר המשתמש ב-mtPAGFP וב-15nM TMRE8, במטרה לבחון מספר תאים בו-זמנית ולשפר את יעילות הזמן של איסוף הנתונים מבלי להקריב את הרזולוציה התת-תאית. דבר זה התאפשר הודות לשימוש בבמה אוטומטית של מיקרוסקופ ובתוכנה ניתנת לתכנות לרכישת תמונות. תוכנת Zen מבית Zeiss מאפשרת למשתמש לסמן ולעקוב אחר מספר תאים ייעודיים המבטאים mtPAGFP. ניתן להפעיל פוטו-אקטיבציה בכל אחד מהתאים הללו באזור עניין (region of interest) מסוים, ולנטר ערימות של חתכים קונפוקאליים עבור אות mtPAGFP וכן עבור TMRE במרווחי זמן מוגדרים. ניתן להשתמש במערכות קונפוקאליות אחרות לביצוע פרוטוקול זה, בתנאי שקיימת במה אוטומטית ניתנת לתכנות, אינקובטור עם CO2, ואמצעי להפעלת פוטו-אקטיבציה של ה-PAGFP; לזרן מולטי-פוטוני או ללייזר דיודה של 405 nm.

פרוטוקול

1. פלייט תמונה הכנה

  1. INS1 התרבות התאים RPMI התקשורת המכילים 10% תקן בסרום שור עוברית, 1% לפניצילין, סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 5 מ"מ NaHCO 3, 2 HEPES מ"מ, חומצה pyruvic 2 מ"מ, ו 11 גלוקוז mM עד המפגש 80%.
  2. Trypsinize את בתרביות תאים INS1 עם טריפסין 0.05% ואת צלחת אותם על פולי-D-ליזין coverslip קרקעית צלחות מצופה הדמיה (מפגש 30-40%).
  3. לאפשר צלחות להגיע מפגש 60-80% (~ 2 ימים) ולהוסיף מטריקס המיטוכונדריה ממוקד (COXVIII) adenoviral PA-GFP של 24 שעות (משרד הפנים = 5). שערי המדיה המאפשרים לתאים לגדול עוד 2 ימים לפני הדמיה.
  4. ביום הדמיה, להוסיף 7-15 TMRE nM ללוחות הדמיה, וכן לאזן דקות לפחות 45.
  5. במהלך סיבוב הפעם חממה (השלב ​​העליון החממה נעשה שימוש כאן) ולאפשר מיקרוסקופ כדי לאזן ל 37 מעלות צלזיוס במשך שעה בערך 1. הפעל CO 5% 2.

2. הדמיה פרמטרים של מיקרוסקופ LSM 710 Zeiss Confocal

  1. לאחר מיקרוסקופ יש equilibrated, בכרטיסייה רכישה, לחץ על "כלים להראות ידני", פתח הדמיה להקים הפאנל, ובחר "מצב הערוץ" ולעבור לעקוב אחר כל "מסגרת".
  2. בלוח נתיב האור, בחר LSM מצב הערוץ. עבודה מסמל את הדגימה כלפי מעלה, בחר "אחוריים", MBS 690 +, ו-MBS 488. בחלק התחתון של הפאנל, בחר "T-PMT" כדי לאפשר הדמיה של שדה בהיר או ערוץ DIC.
  3. סיום התאמת פרמטרים נתיב האור על ידי הגדרת טווח עבור צבע GFP כדי 490-540 ננומטר ל 580-700 ננומטר עבור צבע TMRE.
  4. במצב הרכישה, השתמש 512 × 512 פיקסלים סריקה שדה, 4x הממוצע, ולבחור גורם הזום (אשר מומלץ לשמור על עקביות לצורך כיול).

3. אופטימיזציה של פרמטרים הדמיה

  1. באמצעות תוכנית apochromat 100x (1.4 NA) העדשה אובייקטיבי, focלנו התאים באור הלוגן, לא אור ניאון, כדי להגן על המיטוכונדריה של phototoxicity.
  2. מסך PA-GFP להביע תאים באמצעות חריר פתוח מקסימאלי וסריקה למצוא את התאים שנמצאים ירוק בהיר יותר.
  3. מצא את ההספק הנמוכה ביותר של לייזר 2-פוטון צריך להפעיל את PA-GFP לייעל את הפרמטרים הדמיה להבטיח כי האות לא להרוות את הגלאי. בדוק את האות PA-GFP colocalizes עם האות TMRE עבור כמה Z-Series. איבוד אות TMRE מציין שלילת קוטביות phototoxicity המיטוכונדריאלי, או, ותאי מציג מאפיינים אלה לא אמור לשמש לניתוח.
  4. מצא את התא PA-GFP להביע ולציין גורם הזום.
  5. הגדר את טווח Z-Series לאסוף 6 פרוסות (טווח זה צריך לספק את כל 10 תאים מסוים, אלא אם כן Z-להתמקד נקבע כל עמדה).
  6. שמור את שיטת הדמיה עבור כל תא (תא 1, תא 2 וכו ').

4. התאם את אוטומציהפרשת ד 'של התוכנית וציין את 10 תאים האם תבואי עבור Assay 1 התוך מיטוכונדריאלי שעה אחת

  1. בפאנל השמאלי של חלון multitime, בחר את לוח "חיסכון", וציין את המיקום שבו הקבצים יישמרו.
  2. בלוח "רכישה", טען את שיטת הרכישה הציל לתא 1 בתצורת סריקה, וסמן את התיבה מחסנית z. גם לבחור "סימנה Z הבינוני של מחסנית Z".
  3. בלוח "בלוקים", בחר "בלוק אחד במקום אחד". לחץ על "בלוקים להוסיף" עבור מרווח זה כדי להימדד.
  4. בלוח "העיתוי", בחר "להמתין מרווח" והקלד "0" ב "מרווח ההמתנה לפני בלוק במקום הראשון בלבד". אבני 2-4 יהיה "15 דקות" בסעיף זה.
  5. בלוח הודעות, בחר "להעביר את המוקד לטעון עמדה בין מקומות" ו "עומס לסרוק config כאשר" לעבור לוק 'או' הבא loc "לחיצה. תחת" רשימת מקומות ערוך "בחר" לנקות את כל "ולאחר מכן לבחור" מספר רב של מקומות ממונע הבמה ".
  6. Undאה פאנל "Bleach", לחץ על התיבה "אקונומיקה", וציין את קובץ ההגדרות של "config" לנתץ התפריט, יועד בחלון הראשי של התוכנה. לאחר מכן, בחלון "הלבנה", שמור את השיטה photoactivation המתאים. בלוח אזורים, בחר את ההחזר על ההשקעה עבור תא מסוים, ולהוסיף את ההחזר על ההשקעה על מנת multitime על ידי בחירת "האזור הנוכחי להוסיף לרשימה את ההחזר על ההשקעה" חלון. הקפד לבחור את המיקום אותו "החזר השקעה" לנתץ התפריט.

לעיתוי לעבוד כראוי עבור כל תא יש מרווח 15 דקות, שתי שיטות צריך להישמר. ברשימת בלוקים, הראשון יהיה בתצורת "אמיתי" photoactivation, והשאר יהיו בתצורת "מדומה" שאינו עושה שימוש בלייזר שני הפוטונים. בלוק 1 יהיה גם לחסום רק שאין עיכוב (BKIntv = 0). לכן, השיטה מתחילה סריקה 1 הבסיס, ולאחר מכן סריקה photoactivation. שאר הבלוקים יש 900 שניות BkIntv, ובכל נקודת זמן יש שתי סריקות בדיוק כמו בכל פעם 0 שניות בלבד, כדי לשמור על עקביות העיתוי.

  1. עבור כל אחד 10 תאים להיות שלאחר לאורך זמן, לבצע את הרצף:
    מצא PAGFP להביע תאים לשמירת שיטת ההדמיה שלה
    מיקום לוח-לסמן את מיקום הבמה, ציין שיטת הדמיה
    ראשי לוח-ROI לבחור אזור של אינטרס להיות בליץ photoactivated לוח-להציל את ההחזר על ההשקעה ספציפי גם לטעון אותו בתיבה ההחזר על ההשקעה:
    למחוק את ההחזר על ההשקעה ולאפס זום סריקה עד 1
    מצא את התא הבא להגדיר את הזום
    חזור על התהליך עבור 9 תאים הבאות

בדוק כי כל מיקום הבמה את כל הלבנים יש את שיטת הדמיה המתאים (סריקה תצורה) קשורים. כמו כן לוודא כי בלוק 1 במיקום זה מתאים לשיטה photoactivation המתאים ואילו השאר מכילים שיטת "מדומה". לבסוף, בחר באפשרות "הפעל".

5. לנתח את עוצמת PA-GFP אותות

    כי התאים שבהם האות photoactivatable-GFP colocalizes עם האות TMRE אדום, לחסר רקע התמונות PAGFP (כאן אנו משתמשים metamorph).
  1. ואז לייצא את הנתונים ל-Excel ולחשב את עוצמת הממוצע של Z-ערימות בכל נקודת זמן. מחק חלקים אופטיים שאין להם האות.
  2. למדוד את דילול האות בערימה-Z זה על ידי חישוב אחוז האות photoactivated המקורי.

כל נקודת נתונים נסרק והקליט פעמיים, וכתוצאה מכך המידע Z-מחסנית כפול עבור כל נקודה בזמן. בדוק את Z-מחסנית ערכים מסכים. אם לא, זה מעיד על בעיה (למשל, מוקד התנועה התא).

6. נציג תוצאות

כאשר האירוע מתרחש היתוך בין פעיל ולא פעיל PA-GFP mitochondrion, PAGFP בתוך המטריקס המיטוכונדריאלי מתערבב עם המטריצה ​​הלא מסומן הופך מדולל על פני שטח גדול יותר, ולהקטין את האותעוצמת (איור 1 א). בתא INS1, ירידה משמעותית בעוצמת האות מתרחשת כל 15 דקות, עד איזון של היתוך המיטוכונדריה הושג (כ 1 שעה). ראוי לציין, כי תא איור 1B מציג colocalization כמעט שלם של PA-GFP אותות TMRE. ב מבחני אלה ריכוז נמוך מאוד של TMRE (15 ננומטר) משמש כדי לסייע למקד photoactivation של PAGFP, וגם כדי לפקח על בריאות התא. תאים עם שפע של המיטוכונדריה depolarized יהיה colocalization שלם של PAGFP ו TMRE ולא יש לנתח כי זה מציינת phototoxicity או תאים במצב גוסס.

זמן איזון היתוך המיטוכונדריה הוא בדרך כלל 1 שעות ב INS1 תאים, כאשר ~ 15% של נפח המיטוכונדריה מופעל. לפעמים, גם אם שטח קטן מואר, רוב המיטוכונדריה להיות photoactivated בשל היותו ברשת מאוד, ובמקרה זה היתוך נוספת קשה לזהות. סוגי תאים אחרים עשויים להפגין פעמים איזון שונים יש לבדוק במרווחי זמן קצרים יותר על פני תקופה ארוכה יותר כדי לאפיין את הדינמיקה המיטוכונדריה. כדי לעכב את היתוך המיטוכונדריה, תאים יכולים להיות ממוקמים בתוך סביבה lipotoxic. זה בעבר הראו כי 0.4 מ"מ palmitate שברי המיטוכונדריה, ומעכב היתוך המיטוכונדריה 9. השפעה זו ניתן לראות באיור 2, שבו המיטוכונדריה הם מקוטעת, אך את עוצמת האות של mtPAGFP לא משנה עד כמה בתנאים רגילים (איור 1). לפיכך, דילול של אות PA-GFP הוא ככל הנראה עקב היתוך המיטוכונדריה ולא ביקוע. ב סוגי תאים אחרים, מומלץ להשתמש בדרכים ידועות אחרות כדי להשרות הפיצול המיטוכונדריה, כגון להשתיק OPA1 אשר הכרחי היתוך המיטוכונדריה 14.

figure-protocol-1
באיור 1. דילול אופיינית של אות PA-GFP לאחר photoactivation במהלך assay היתוך המיטוכונדריה. א PA-GFP הופך בהדרגה דימר בשל תופעות היתוך המיטוכונדריה המובילים דילול של החלבון על פני שטח גדל והולך כמו שניתן לראות את התמונות המוקרנות 6 חלקים אופטיים לכמת כל 15 דקות. ב TMRE עם PA-GFP מראה כי המיטוכונדריה פועלים ולא depolarized. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

figure-protocol-2
איור 2. היתוך מיטוכונדריאלי עכבות עם palmitate 0.4 מ"מ מפחית את דילול של PA-GFP. תחזיות א של 6 חלקים אופטיים מראה המיטוכונדריה קצר עם עוצמת האות משתנה עם הזמן. Colocalization ב 'של PA-GFP עם TMRE המיטוכונדריה מראה כי הם לא דהמקוטב. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

דיון

שיטה זו מאפשרת הדמיה של כ 10 תאים בכל פעם, אם הרכישה מתרחשת כל 15 דקות לאחר photoactivation. מספרם המדויק של תאים יהיה תלוי כמה מהר 1 הוא מסוגל לאתר ולסמן את התאים המבטאים mtPAGFP בתוך צלחת התרבות, וכמה מהר אפשר להגדיר את כל הפרמטרים תוכנה. כדי לבצע אוטומציה לפעול בצורה חלקה גם שכבת התאים יש להשתמש משום המיועדים Z-מחסנית שולי יחולו על כל התאים.

גודלו של אזור זה photoactivation הראשונית תנחה את הזמן איזון. כדי להיות מסוגלים למדוד היתוך המיטוכונדריה, חשוב photoactivate רק 10-20% של הרשת, כך התפשטות האות לשאר הרשת ניתן לפקח לאורך זמן. אם יותר מדי של הרשת הוא photoactivated, יתכן איחוי מלאה תתרחש מהר מדי, האירוע לא ליפול בפח.

במשנה זהירות יש לנקוטלהתאים את כוח לייזר לייזר של שני הפוטונים, כמו גם ריכוז TMRE להימנע phototoxicity שמוביל שלילת קוטביות המיטוכונדריה. להבטיח את האות mtPAGFP colocalizes עם האות TMRE יכול לעזור בהערכת phototoxicity ובריאות כללית תא 8,15. תאורה באור epifluoerescent יש להימנע. במהלך חיפוש בתאים המבטאים mtPAGFP, חריר צריך להיות פתוח מקסימאלי תוך סריקה באמצעות עירור צריכת חשמל נמוכה 488nm. התאמת כוח שני פוטונים לייזר photoactivate מספיק PA-GFP כדי למדוד את האות יותר משעה 1 אך לא oversaturate כל התאים יכול להיות מסובך 8. עם זאת, הפעם יש בילה בשלב זה אופטימיזציה, כי תוכנית אוטומטית פעם אחת הוא התחיל, זה מייגע לעצור את זה, לבחור תאים נוספים, וכן לחדש.

עבור בקרת איכות, רכישת בניגוד ההפרש התערבות (DIC) תמונה (או אור מסור) כדי לפקח על התמקדות התאים יכול להיות מאודמועיל גם דרך טובה לזהות בועות שנוצרו בשמן טבילה במהלך הסריקה, זה קורה לפעמים בין התנועות של הבמה.

אמנם בשיטה זו mtPAGFP אוסף נתונים על תנועה חד כיווני של חלבונים מטריקס המיטוכונדריה של המיטוכונדריה photoactivated לאלה שאינם מסומנים, מתקבל על הדעת להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד תהליכים אחרים. לדוגמה, fluorochromes מסוימים ניתן לחבר חלבונים בממברנה לצפות התנועה הספציפי שלהם במהלך האירועים היתוך, כפי שהוכח על ABC-ME, שילוב של המתרחש על הזמן בקנה מידה שונה ערבוב של חלבונים מסיסים מטריקס 15.

גילויים

הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי Zeiss, Inc

תודות

אנו מודים מרכז טאפטס למדעי המוח המחקר, p30 NS047243 (ג'קסון), מחקר המיטוכונדריה זיקה שיתופית (mtARC) נתמך על ידי מרכז אוונס למחקר ביו הבינתחומי באוניברסיטת בוסטון רפואי קמפוס, רפואה Corporation קישור ולאחר Zeiss לתמיכה העבודה הזאת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי
COXIII adenoviral-PA-GFP ד"ר ליפינקוט מהוצאת-שוורץ
TMRE Invitrogen T669
Zeiss LSM 710 confocal Zeiss

מקורות

  1. Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
  2. Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
  3. Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  4. Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
  5. Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
  6. Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
  7. Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
  8. Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
  9. Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
  10. Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
  11. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  12. Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100(2011).
  13. Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
  14. Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
  15. Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
  16. Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
  17. Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
  18. Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שיטת mtPAGFPדימוי במיקרוסקופיה קונפוקליתפוטו-אקטיבציה מיטוכונדריאליתצביעת TMREרכישת Z-Stackבמה מיקרוסקופית אוטומטיתכימות עצימות אותניתוח דינמיקה מיטוכונדריאליתדימוי תאים חיים
מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.