הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

סיכום

אאוקריוטים חיידקים הם גם מקור של פחמן photosynthetically הנגזרות ואת הדף מינים טורפים ב לצמיתות מכוסי קרח אגמים אנטארקטיקה. דו"ח זה מתאר תרבות והעשרה הגישה לבודד מטבולית אאוקריוטים חיידקים צדדי מן האגם אנטארקטיקה, אגם בוני, ומעריך את הפוטנציאל אורגניים קיבוע פחמן באמצעות assay radioisotope עבור Ribulose-1 ,5-bisphophate פעילות oxygenase (RuBisCO) carboxylase.

תקציר

אגם בוני הוא אחד רבים לצמיתות מכוסי קרח אגמים הממוקם בעמקים יבש מקמרדו אנטארקטיקה. כיסוי קרח רב שנתי שומרת על עמודת המים מרובדת כימית שלא כמו גופים אחרים בפנים הארץ של מים, בעיקר מונע קלט חיצוני של פחמן וחומרים מזינים מן הזרמים. Biota חשופים ללחצים סביבתיים רבים, בהם חסר כל השנה תזונה חמורה, בטמפרטורות נמוכות, גוון קיצוני, hypersalinity ו -24 שעות חושך בחורף ^1. אלה תנאים סביבתיים קיצוניים להגביל את biota באגם בוני כמעט אך ורק מיקרואורגניזמים ^2.

חד תאיים אאוקריוטים חיידקים (המכונה "protists") הם שחקנים חשובים אופניים biogeochemical העולמי ³ ו ממלאים תפקידים אקולוגיים חשובים רכיבה על אופניים של פחמן האגמים יבשים העמק, כובש את שני התפקידים הראשיים שלישוני של האינטרנט המזון הימית. ב יבש העמק אינטרנט מימיים מזון, protists כי אני לתקןפחמן norganic (autotrophy) הם המפיקים הגדולים של פחמן אורגני עבור אורגניזמים organotrophic ^{4, 2.} Phagotrophic או protists heterotrophic המסוגלים בליעת חיידקים protists קטנים יותר לשמש הטורפים הטובים ביותר במארג המזון ^5. לאחרונה, שיעור ידוע של האוכלוסייה הפרוטיסטי מסוגל חילוף החומרים mixotrophic משולב ^{6, 7.} Mixotrophy ב protists כולל היכולת לשלב יכולת הפוטוסינתזה עם בליעה phagotrophic של מיקרואורגניזמים טרף. צורה זו של mixotrophy שונה חילוף החומרים mixotrophic במינים חיידקים, אשר בדרך כלל כרוך מומס ספיגת מולקולות פחמן. כרגע יש מבודד לפרוטיסטים מעט מאוד מן האגמים הקוטב לצמיתות קרח כתרים, ומחקרים של גיוון הפרוטיסטי ואקולוגיה בסביבה קיצונית זו היה מוגבל ^{8, 4, 9, 10, 5.} הבנה טובה יותר של גמישות מטבולית הפרוטיסטי על מארג מזון פשוט יבש האגם העמק יסייע בפיתוח מודלים של ROLE של protists במחזור הפחמן העולמי.

העסקנו תרבות והעשרה הגישה לבודד protists phototrophic פוטנציאל mixotrophic מאגם בוני. בעומק דגימה בעמודת המים נבחרו בהתבסס על המיקום של הייצור מקסימה ראשונית הפרוטיסטי פילוגנטי מגוון ^{4, 11,} כמו גם משונות הגורמים העיקריים המשפיעים אביוטי trophic לפרוטיסטים מצבים: עומק דגימה רדודים מוגבלים עבור החומרים המזינים העיקריים, בעוד דגימה עומק עמוקות יותר מוגבלים על ידי זמינות האור. בנוסף, דגימות אגם מים נוספו עם סוגים שונים של מדיה צמיחה כדי לקדם את הצמיחה של מגוון רחב של אורגניזמים phototrophic.

RuBisCO מזרז את קצב הגבלת צעד בנסון קלווין Bassham (CBB) מחזור, מסלול העיקרי שבאמצעותו אורגניזמים autotrophic לתקן פחמן אורגני ולספק פחמן אורגני על רמות גבוהות יותר trophic רשתות המזון הימית ¹² ו יבשתי. במחקר הנוכחי, Wדואר להחיל assay radioisotope שונה עבור דגימות מסוננות ¹³ כדי לעקוב אחר פעילות carboxylase המרבי כ-proxy עבור פוטנציאל קיבוע הפחמן צדדיות מטבולית בתרבויות בוני אגם העשרה.

פרוטוקול

1. לדוגמא רכישה

1. בחר להכין את האתר הדגימה יום אחד לפני הדגימה עמודת המים. זה יאפשר מרובדת שכבות של עמודת המים לתקן לאחר הפרעות בשל קידוח חור בקרח נמס. זיהוי המיקום של האתר התרגיל על ידי GPS.
2. כדי לגשת אל עמודת המים, להתחיל לקדוח חור בקרח עם במקדחה קרח הנרתיק המצורף הרחבה 4 אינץ' הנרתיק טיסה קצת חיתוך. כדי למנוע הקפאת לקדוח חור, נסו להימנע קידוח למים נוזליים על ידי עצירת כ 4-6 ס"מ הקידוח מעל החלק העליון של עמודת המים.
3. חור קידוח יהיה צורך התרחב מ בקוטר של 15 עד 60 ס"מ לפני הדגימה. מטרה זו מושגת על ידי שימוש melter חור (דגם Hotsy) אשר מפיצה פוליאתילן גליקול מחוממת דרך צינור הנחושת. ההיתוך חור נמשכת בדרך כלל עד 18 שעות.
4. לפני הדגימה עמודת המים, להבטיח כי כל הציוד הנדרש רחוב מדגםכלי orage מורכבים באתר הדגימה. חומרי דגימה כוללים: בקבוק Niskin (קיבולת L 5-10), עם כבל כננת מעמיק מכויל, Messenger, בקבוקי מדגם מספיק לעומק כל הדגימה קירור להובלת המדגם.
5. בגין הדגימה מוקדם יותר באותו יום (~ 05:00), כמו סינון אגם מים אמורה להסתיים ביום הדגימה. איסוף דגימות מים (1-5 ליטר) ממעמקים הרצוי (עבור מחקר זה: 6 מ ', 15 מ' ו 18 מ 'עומק דגימה, נמדד ממפלס המים piezometric בחור קרח) באמצעות סמפלר Niskin מחובר מכויל יד הכננת. כדי למנוע הפרעה של עמודת המים לאסוף בעומקים רדודים לפני אלה עמוקים יותר.
6. החנות האגם דגימות צידניות ותחבורה מהאתר המדגם למעבדה בתחום באמצעות מזחלת מחובר טרקטורונים (כל רכב שטח). דוגמאות צריך להיות מעובד או התייצב (למשל עבור: הקפאה בחנקן נוזלי Flash) במעבדה בתחום הדגימה הבאה מיד.

2. DevelopmeNT תרבויות העשרה

1. לגידול של תרבויות העשרה, להתרכז 0.5-1 ליטר של מים באגם על 47 מיקרומטר 0.45 מ"מ גודל הנקבוביות מסננים polyethersulfone באמצעות סינון עדין (<0.3 ATM). אם המגוון של הקהילה טבעי הוא הרצוי, לסנן מדגם 2 על 47 מ"מ 0.45 מיקרומטר מסננים גודל הנקבוביות polyethersulfone ופעל על פי פרוטוקולים Bielewicz et al. ⁴ לגיוון פילוגנטי eukaryote.
2. להעביר את מסנן צינור 50 מ"ל בז סטרילית המכילה ~ 20 מ"ל של מים מסוננים האגם שנאספו עומק הדגימה כמו מסנן. לשטוף בעדינות תאים מסנן באמצעות פיפטה סטרילית.
3. להעביר את ההשעיה תא 25 ס"מ ² בקבוק תרבות סטרילית התא. מוסיפים מים מסוננים האגם נאספו מעומק כל דגימה כדי להגדיל את נפח תרבות מ"ל 45. הגדרת מספר משכפל את עומק דגימה אם enrichments על התקשורת והתרבות השונים הרצוי.
4. מוסף התרבות עם צלוחיות של 50Xפתרונות terile לריכוז הסופי של 1X של התקשורת והתרבות הבאים: בינוני בסל של מודגש, BG11 ו-F / 2. אם טיפוח של אורגניזמים mixotrophic נדרש, הגדרת שני כלי F/2-supplemented ולהוסיף 2-3 גרגרי אורז סטרילית לאחד את צלוחיות.
5. דגירה צלוחיות תרבות בטמפרטורה נמוכה (4 ° C) irradiance נמוכה (20 פוטונים μmol מ ^-2 מכלל ^-1) בצמיחה טמפרטורה מבוקרת חממה לפחות 4 שבועות באנטרקטיקה לפני המשלוח למעבדה שלך בארה"ב. אם מבודד הם הרצוי, 250 צלחת μL של תרבות והעשרה על צלחות אגר המכילות מדיה צמיחה המתאימים לאחר הדגירה שבועות 2.
6. למשלוח בארה"ב, העשרה העברת תרבויות לצינורות סטריליים 50 מ"ל פלקון. משלוח הבקשה הדרישה של "לא לקפוא" ו - "לשמור על קור רוח" על משלוח הבקשה. בעוד תהליך משלוח מ אנטארקטיקה היא מהירה יחסית (2 שבועות בדרך האוויר מסחרי) ואמין מאוד, קיימת אפשרות של אובדן איבר אניןהאיזמים במהלך ההובלה. לכן, החוקרים אולי כדאי לשמור על subsample לפני המשלוח, כך הפסד של מינים מסוימים במהלך תהליך משלוח ניתן להעריך.
7. עם ההגעה בארה"ב, העברת 5 מ"ל של תרבות והעשרה לתוך 45 מ"ל של התקשורת צמיחה המתאימים בקבוק 125 מ"ל, Erlenmeyer סטרילית כתרים עם ספוג סטרילי. תרבויות העשרה יש לשמור על עמידה תרבויות בטמפרטורה מבוקרת תא הצמיחה הסביבה (לשכת צמיחה יומי, VWR) בשעה 4 ° C/20 פוטונים μmol m ^-2 s ^-1. תרבויות יש להעביר מדיה טריים מדי 30 יום.

3. Lysate תא חילוץ מתוך Enrichments מסוננים

1. מסנן 5 מ"ל של תרבות והעשרה על 25 מ"מ Whatman GF / F מסנן באמצעות ואקום עדין (<10 PSI). מסנן עשוי להיות מאוחסן במשך מספר שבועות ב -80 ° C לפני הפעילות RuBisCO מנסה לאמוד.
2. חותכים את המסנן למקטעים 4-5 במספריים פלדה סטריליים ולהעביר את חתיכות עם מלקחיים סטריליות על צינור 2 מ"ל כובע בורג מלא חמישית באופן מלא עם 0.1 מ"מ בקוטר Zirconia / סיליקה חרוזים.
3. להוסיף 1.25 מ"ל של מיצוי מאגר מסנן (50 bicine מ"מ, 10 mM MgCl _2, 1 mM EDTA, 5 מ"ג / מ"ל BSA, ו -0.1% טריטון X-100, הוסיפו חדש: 10 מ"מ NaHCO _3, 10 mM DTT, 3.3 mM aminocaproic חומצה, benzamidine 0.7 מ"מ, ה-pH 7.8) ¹³ ולשבש תאים באמצעות מקצף Minibead שלוש פעמים בשנות ה -30 על הגדרת מהירות 48. כדי למנוע חימום של המדגם, beadbeating חלופי עם הדגירה 1 קרח דק.
4. סרכזת slurry מסנן דק '2 ב XG 3000 ב 4 ° C כדי ליצור גלולה רופפת של GF / F סיבים המסנן הקיר פסולת התא.
5. הסר aliquot 200 לטבול μL וב μL 800 של אצטון קר כקרח 90%. למדוד כלורופיל שניתן להפיק (CHL) ב ספקטרופוטומטר בערכים אורך גל של 664 ננומטר ו ^-14 ננומטר 647. העברת supernatant לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
6. סרכזת remaining supernatant על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב XG 15,000 ולהעביר supernatant (להימנע גלולה של קרומים תאיים מסיסים ונשאר GF / F סיבים סינון) כדי צינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל. Lysate זה תא מסיסים עשויים כעת לשמש assay פעילות carboxylase RuBisCO.
7. Lysate ניתן לאחסן ב -80 ° C, לאחר תוספת של גליצרול 12.5% ​​והקפאה פלאש בחנקן נוזלי. אובדן הפעילות עשויה להתרחש לאחר ההקפאה / הפשרה מחזורים רבים, תלוי ברגישות של אנזימים lysate. לכן, הפעילות של lysate טרי לעומת קפוא יש לבדוק לפני התא גדול בקנה מידה lysate עקירות.

4. RuBisCO פעילות carboxylase מסנן Assay

1. העברת 125 μL של lysate מסיסים אל צינור 15 מ"ל שווי microcentrifuge בורג (CAP לא צריך) כי כבר קר על הקרח. לקבלת דוגמיות שליטה שליליות, להוסיף 125 lysate מסיסים μL עד 15 מ"ל צינור כובע בורג microcentrifuge, אבל לא להוסיף מצע (בשלב 4.7). לרוץלשכפל את התגובות של כל דגימות בקרות שליליות.
2. הכן 10 מ"ל של חיץ assay טרי (50 מ"מ Bicine-NaOH, pH 8.0, 50 מ"מ NaHCO _3, 25 מ"מ MgCl ₂₎ ומקררים על קרח. מספיק למאגר assay עבור כל דגימות בקרות שליליות (100 μL לדגימה / בקרת פלוס 100 תוספת μL) למבחנה 5 מ"ל aliquot. לבצע את כל השלבים הבאים מתחת במנדף.
3. הוסף 40 μL לאא ¹⁴ CO ₃ (500 μCi / מ"ל) לכל מ"ל של חיץ assay למאגר aliquoted ולשמור על חיץ על הקרח.
4. הסר 10 μL של למאגר assay המכיל ¹⁴ C ו לדלל אותו מ"ל 1 של חיץ assay. לאחר היפוך לערבב, להוסיף 100 μL של תערובת מדוללת 1:100 ל 3 מ"ל של הנצנץ השני Bio-Safe לספור קוקטייל בבקבוקון נצנץ. הפוך לערבב. ספירת נצנץ (Beckman LS6500) צריך להיות מעל 18,000 עותקים לדקה לפני המשך assay.
5. כאשר מספיק לאא ¹⁴ CO ₃ נוספה למאגר assay,להעביר את צינורות תגובה אמבטיה יבש מראש ל 25 מעלות צלזיוס, דגירה של 3-5 דקות.
6. הוספת 100 חיץ assay μL על lysates ו דגירה במשך 5 דקות במהירות של 25 ° C.
7. הוסף 20 μL של bisphosphate Ribulose 15 מ"מ, כדי דגימות ומאפשרים תגובה להמשיך עבור 5-10 דקות במהירות של 25 ° C.
8. הוספת 100 חומצה propionic μL (100%) (פישר) כדי לעצור את התגובה. סרכזת שעה 1 XG ב 2000 למצות מאוגדים ¹⁴ ג
9. להעביר את הנפח הכולל של הדגימות כדי בקבוקונים המכילים נצנץ 3 מ"ל Bio-Safe II קוקטייל נצנץ לספור. קביעת עלות לאלף הופעות של מוצרים חומצה הקצה יציבים על ידי ספירת נצנץ (ב 'ויטה, ר' Tabita תקשורת אישית).
10. חישוב שיעורי RuBisCO פעילות CHL בסיס ^14.

5. נציג תוצאות

ניצלנו culturing העשרה לבודד phototrophic קר מותאמת protists mixotrophic המתגוררים L אנטארקטיקהאייק בוני. כדי ללכוד מגוון גדול יותר של אורגניזמים, בדקנו שלושה סוגי מדיה צמיחה: בינוני בסל של מודגש (BBM) ^15, F/2-Si ימית בינוני ^{16, 17} ו BG11 בינוני ^18. בדיקה ויזואלית של תרבויות העשרה על ידי מיקרוסקופ אור גילה כי התרבויות נשלטו על ידי protists phototrophic (מסומן על ידי נוכחות של הפיגמנט כלורופיל ברוב התאים) והוא טיפח מגוון מורפולוגיות סלולריים, תלוי בעומק הדגימה שממנה נלקח הבידוד ואת סוג המדיה המשמשים התרבות (איור 1).

מדדנו שיעורי מקסימום של פעילות carboxylase catalyzed ידי RuBisCO האנזים כמו proxy עבור פוטנציאל קיבוע הפחמן. שפע CHL היה פיקוח גם הערכה של ביומסה הפרוטיסטי phototrophic (איור 2). למרות גידול של התרבויות תחת משטר הטמפרטורה / אור זהה (כלומר, 4 ° C/20 μmol m ^-2 s ^-1), קיבוע פחמן פוטנציאלו ביומסה phototrophic מגוונות דרמטי בין תרבויות העשרה. הפעילות המקסימלית RuBisCO נצפתה בתרבויות העשרה הגדלים או BBM (Enrichments 4 ו -6) או BG11 (Enrichments 13 ו -14) מדיה הצמיחה, בעוד תרבויות מועשר על המדיום F / 2 הצמיחה (Enrichments 19, 21, 23) הציג 4 - ל 34, לקפל פעילויות נמוכות carboxylase מקסימלית. הבדלים אלה לא היו בשל רמות נמוכות יותר ביומסה ה-F / 2 תרבויות, כפעילות carboxylase באה לידי ביטוי באופן CHL. יתר על כן, הפעילות RuBisCO לא לתאם עם ריכוז CHL (r = -0.023, p> .1:. איור 2, הבלעה). תרבויות BBM מחוסן עם מים באגם מ מ 6 מ 'ו 15 (Enrichments 4 ו -5) היה הגבוה ביותר CHL כמה רמות, כאשר כל התרבויות האחרות הציגו CHL נמוך יחסית, ללא תלות פעילות האנזים RuBisCO (איור 2).

באיור 1.חיידקים נציג eukaryote העשרה תרבויות אשר נבחרים לצמיחה של אורגניזמים שונים. הזהות של התרבות ניתנת השמאלי התחתון של הלוחות. כל התמונות לייצג micrographs האור שנוצר באמצעות טבילה שמן בהגדלה 1000x.

איור 2. פוטנציאל קיבוע הפחמן הקיבולת כלורופיל להפיק כמה רמות eukaryote אנטארקטיקה חיידקים תרבויות העשרה מבודד אגם בוני ו גדל על תרבות התקשורת השונים. ראה לוח 1 לפרטים התרבות הבלעה. מתאם פירסון בין כלורופיל פוטנציאל שפע קיבוע הפחמן ב eukaryote אנטארקטיקה תרבויות חיידקים העשרה.

דיון

מחקרים מולקולריים האחרונות דיווחו על מגוון גבוה של חד תאיים אאוקריוטים במגוון של סביבות ^{3, 19, 20,} אולם בשל חוסר מבודד על פני מגוון רחב של בתי גידול לפרוטיסטים התפקידים תפקודית של אותם מינים בודדים רשתות המזון בעיקר לא ידוע. במחקר זה, שתיארנו מתודולוגיות להעשיר עבור מינים של חיידקים eukaryote המציגים צדדיות חילוף החומרים מהסביבה undersampled יחסית, באופן קבוע הקרח באנטרקטיקה מכוסה באגם. התרבויות שהעשירו ממעמקים דגימה שונים אגם בוני הציג פחמן דיפרנציאלי קיבוע שיעורי הצמי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
BBM	סיגמא	B5282
BG11	סיגמא	C3061
F / 2	סיגמא	G9903
GF / F מסנן, 25 מ"מ	פישר סיינטיפיק	09-874-64
GF / F מסנן, 47 מ"מ	פישר סיינטיפיק	09-874-71
Polyethersulfone מסנן, נקבוביות 0.45 מיקרומטר, 47 מ"מ	מל מדעי החיים	61854
תא סטרילי בקבוק תרבות, 25 ס"מ 2	קורנינג	430639
Diurnaאני קאמרית הצמיחה	VWR	35960-076
Zirconia / חרוזים סיליקה, 0.1 מ"מ diamter	BioSpec מוצרים	11079101z
מיני מכה ביד	BioSpec מוצרים	3110BX
בורג יתר microcentrifuge צינור (1.5 μL)	ארה"ב מדעי	1415-8700
לאא 14 CO 3	ViTrax	VC 194	לשמור על aliquots של μL 400 ב -20 ° C
RuBP	סיגמא	R0878-100 מ"ג	ממיסים בחומצה 10 טריס-propionic מ"מ (pH 6.5)