Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות

סיכום

השיטה יעילה השתלת רקמות בגודל מוגדרת ועקבית בין planaria מתואר. היא כללה גם תיאור של איך להשתמש בטכניקה immobilization להשתלה ניתן להתאים, בשיתוף עם מגן עופרת, הקרנה חלקית של בעלי חיים.

תקציר

Planarian, השטוחה מים מתוקים, הוכיחה להיות מערכת רב עוצמה לנתח התחדשות מטזואניים ו תא גזע ^1,2 ביולוגיה. התחדשות Planarian של כל רקמות חסרים או פגומים מתאפשרת על ידי בתאי גזע בוגרים כינה neoblasts ^3. למרות אלה בתאי גזע הוכחו בוודאות להיות pluripotent ומסוגלים לשחזר להפליא של כל בעל חיים ^4, ההטרוגניות בקרב האוכלוסייה לתאי גזע ואת הדינמיקה של התנהגות הסלולר שלהם נותרו לא פתורות, במידה רבה. בשל ריבוי והפצה רחב של בתאי גזע ברחבי תוכנית הגוף planarian, שיטות מתקדמות של subpopulations מניפולציה בתאי גזע לצורך מחקר מולקולרי ומתפקד in vivo יש צורך.

השתלת רקמות הקרנה חלקית שתי שיטות שבו subpopulation בתאי גזע planarian ניתן לבודד למחקר נוסף. הטכניקה לכל אחד יש יתרונות ברורים. Tהשתלת הנושא מאפשר הקדמה של בתאי גזע, לתוך שורה תמימה, כי הם או מטבעו שונה גנטית או טופלו בעבר פרמקולוגית. לחלופין, הקרנה חלקית מאפשר בידוד בתאי גזע בתוך הפונדקאי, זה לצד זה לרקמות ללא בתאי גזע, ללא הקדמה של פצע או עכוז של שלמות רקמות. באמצעות שתי השיטות, ניתן לחקור את הגורמים תאים אוטונומיים ולא אוטונומיים הנובעות בקרת התא פונקציות, כגון התפשטות, בידול, והגירה.

הן רקמות להשתלה ^5,6 ו חלקית קרינה ⁷ שימשו היסטורית בהגדרת רבים של שאלות על התחדשות planarian שנותרו תחת מחקר היום. עם זאת, טכניקות אלה נשארו underused בשל אופי מייגע ובלתי עקבית של השיטות הקודמות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מייצגים צעד גדול קדימה בהפחתת זמןND המאמץ הנדרש כדי reproducibly לייצר מספר רב של בעלי חיים מורכבים או מוקרן באופן חלקי עם efficacies מתקרב 100 אחוז. אנו מכסים את כל התרבות של בעלי חיים גדולים, חוסר תנועה, לקראת הקרנת חלקית, השתלת רקמות, אופטימיזציה של התאוששות בעלי חיים. יתר על כן, העבודה המתוארת כאן ממחיש את היישום הראשון של שיטת הקרנה חלקית לשימוש עם planarian ביותר למד נרחב, Schmidtea mediterranea. בנוסף, רקמות יעיל השתלת ב planaria פותחת את הדלת לבדיקה תפקודית של subpopulations של בתאי גזע נאיבי או מטופלים מבחני repopulation, אשר כבר זמן רב את שיטת תקן הזהב של מנסה לאמוד את הפוטנציאל למבוגרים בתאי גזע אצל יונקים ^8. אימוץ רחב של שיטות אלו יהיה ללא ספק להוביל להבנה טובה יותר של התנהגויות הסלולר של בתאי גזע בוגרים במהלך הומאוסטזיס רקמה והתחדשות.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה מצביע על שימוש בחומרים העלולים להיות מסוכנים (עופרת chloretone). לרכוש, לקרוא, ופעל MSDS עבור כל החומרים העלולים להיות מסוכנים.

1. התרבות בעלי חיים, בחירה ולאחר הכנה

1. לתרבות חיה ושימוש טיפול planarian מים (1x מלחי Montjuïc ⁹⁾ בטפי להחדרת נוזלים העברת פלסטיק.
2. מיני biotype Schmidtea mediterranea ניתן להשתמש כאשר העלה במעבדה בתנאים תרבות נורמליים ^10. כדי לייצר דגימות מיניים בגודל הדרוש, ש ' mediterranea העלה בטמפרטורת החדר בתנאים רגילים ⁹ צריך להיות מוזן על לתדר כפול משולש רגיל (2-3 פעמים בשבוע) במשך חודש עד חודשיים לפני השימוש. לחילופין, בעלי חיים מיניים נמאס בתדירות רגילה נשמרות על 10 מעלות צלזיוס לזמן בלתי מוגבל על מנת להגביר את הגודל הממוצע שלהם.
3. בחר הבהמה אשר בין 1 עד 2 ס"מאורך יותר מ 2 מ"מ ואז להרעיב חיות 3-7 ימים לפני השימוש.
4. אם ביצוע כל טיפול תרופתי או רדיולוגי על המארחים, תורמים המיועדים, או בעלי חיים מוקרן באופן חלקי, לבצע טיפול (ים) בשלב זה.
5. אם הטיפול התרופתי בוצעו כי נדרש להאכיל את החיות, להרעיב חיות נוספות 3 עד 7 ימים לפני השימוש.

2. הכנת פתרונות וחומרים

1. הכן פתרון chloretone, הרדמה מקומית קלה, על ידי המסת 0.1-0.2% w / v chloretone במים planarian ומצמררת פתרון קרח.
2. אם ביצוע הקרנה חלקית בלבד, עבור לשלב 2.7. על השתלת רקמת להמשיך לשלב 2.3.
3. באמצעות מבער בונזן, לכופף בקוטר 0.75 מ"מ הפנים, המשמש לחיתוך רקמות השתל, ו 0.7 מ"מ קוטר חיצוני, המשמש ליצירת חור המארח אשר יקבל את השתל, צינורות נימי ל 90 מעלות זווית ב 1-2 ס"מ מסוף EAפרק צינור. כדי לשמור חומרים, לכופף את שני הקצוות של הצינור בכל נימי ולשבור אותם במחצית לייצר שני כלים. יש להיזהר שלא הלהבה הקצוות מאוד של החצוצרות.
4. חותכים את המסמכים הבאים משתמשים הגדלים המתאים:
   • שחור נייר פילטר (חתוך כ מלבנים. 2.5 ס"מ X 1.5 ס"מ)
   • Whatman # 3 נייר פילטר (וחותכים למלבנים. כ 2 ס"מ X 0.5 ס"מ)
   • Kimwipe (מקופל וחותכים כ צרורות. 3 ס"מ x 0.5 ס"מ x 4 רובדי)
   • סיגריה נייר גלגול (להסיר את רצועת מסטיק וחותכים למלבנים. כ 3 ס"מ X 2 ס"מ)
5. הכן פתרון שונה של Holtfreter (3.5 גר '/ ל' NaCl, 0.2 גר '/ ל' NaHCO _3, 0.05 גר '/ ל' KCl, 0.2 גר '/ ל' MgSO _4, 0.1 גר '/ ל' CaCl _2, pH 7.0-7.5) וקזאין רווי הפתרון של Holtfreter ומקררים הן 4 ° C.
6. צרף Kimwipe מקופל לריבוע של Parafilm ומניחים על צלחת קריר Peltier או מכשיר קירור אחרים הנמצאים תחת מיקרוסקופ לנתח. להרוות את Kimwipe עם Holtf צונןreter של פתרון ומקום שני מלבנים שחורים על נייר הסינון Kimwipe.
7. קו פטרי מנות עם נייר # 2 Whatman הסינון. להרטיב נייר פילטר עם הפתרון של Holtfreter וצננו את הכלים על קרח. עבור הקרנה חלקי המנה גדול אניה נייר פילטר עשוי לשמש.

3. הרדמה ו Immobilization

1. מלאו צלחת פטרי עם פתרון chloretone צונן ותולעים פיפטה לתוך צלחת. להשתלה רק להרדים מארח אחד ואחד תורם בכל פעם. עבור הקרנה חלקית רבים (n> 10) בעלי חיים יכולים להיות מורדם בבת אחת.
2. תולעים אפשר לטבול בתמיסה chloretone עד שיהפכו ללא תנועה (5-10 דקות).
3. יש לשטוף את התולעים על ידי pipetting אותם לתוך צלחת מלאה פתרון Holtfreter של צונן.
4. לשתק חיות ידי pipetting אותם על נייר פילטר שחור רווי פתרון Holtfreter של קרירה אוריינט אותם בצד הגחון למטה עם מלקחיים. אם בעלי החיים מסוגלים locבאומוטה, לספוג את הפתרון Holtfreter של עודף, מעט להקטין את הטמפרטורה של Peltier או צלחת קרה, או להגדיל את אורך הטיפול chloretone.

4. הקרנה חלקית

הערה: בצע את השלבים הבאים כדי להכין את חיות עבור הקרנה חלקית. אם ביצוע השתלה במקום, המשך לסעיף 5.

1. מניחים צלחת פטרי צונן משלב 2.7 על קרח בדלי קרח שתתאים בתוך המקור העליון רנטגן irradiator.
2. סדר חיות הרדים בצלחת פטרי על ידי העברת נייר פילטר שחור שעליו הם משותקים. באמצעות מלקחיים להעביר תולעים הרדים ישירות עלול לפגוע בהם.
3. תחבורה מסודרים חיות למקור העליונה רנטגן irradiator ו למקם דלי קרח כך המרחק בין צינור קטודה לבעלי החיים ממוזער, ובכך למקסם את שיעור המינון האפקטיבי.
4. להוביל עמדת המגן (ים) (איור 1) בין בעלי חיים טי הקתודהUbe לפי הצורך. שילדס צריך להיות 4.5-6 מ"מ עובי, כדי לאפשר הנחתה 97-99% של קרני ה-X 325kV קרן ^11.
5. לספק רנטגן במינון. אם גזע שלם התא אבלציה מן הלא מוגן אזורים הוא הרצוי, להעביר 30 Gy או יותר באמצעות irradiator רנטגן. עבור הפניה, 30 Gy שווה 3.6 דקות ב 320 kilovolts ו -10 מיליאמפר ב Precision X-Ray בע"מ XRAD320 עם המרחק השדה אל המקור של 30 ס"מ.
6. מיד לאחר השלמת המינון, טיפול תולעים על ידי נייר פילטר שחור, חיות העברה למים planarian צונן. אפשר מים planarian לחמם לטמפרטורת החדר ואת בעלי החיים כדי לסלק את עצמם נייר פילטר שחור. הליך הקרנה חלקית הושלמה.

5. השתלת רקמות

1. בעזרת פיפטה העברת מלקחיים, לארגן המארח הרדים ותולעים התורמות על מלבנים נפרדות של נייר פילטר שחור על Kimwipe אשר מקורר על Peltiאה או קריר צלחת תחת מיקרוסקופ לנתח.
2. שימוש בקוטר 0.75 מ"מ פנימי צינור נימי לחתוך את התקע שתל מתורם, באמצעות מלקחיים, מניחים אותו על החוצה של החלק בדרך של המארח. אם החומר השתל נתקע בצינור נימי, לעקור עם מלקחיים.
3. באמצעות 0.7 מ"מ קוטר חיצוני צינור נימי להסיר את התוספת מהמחשב המארח באמצעות מלקחיים עמדת השתל לתוך החור שנותר מאחור.
4. מעבירים את המארח המושתל על מלבן נייר פילטר שחור לתוך צלחת פטרי מוכן בשלב 2.7.
5. להרטיב פיסת נייר גלגול עם פתרון קזאין Holtfreter של רווי למקם אותו על גבי המחשב המארח המושתל כמו diagramed ב איור 2 א.
6. משרים ארבע פיסות נייר המסנן בתמיסה רוויה של קזאין Holtfreter ו לשים בארגז המארח המושתל כמו diagramed ב 2B איור.
7. משרים ארבע חבילות של Kimwipe קיצוץ פתרון קזאין רווי של Holtfreter ולהניח אותםנייר פילטר משלב 5.6 (איור 2 ב). החזר את המכסה והכניס את צלחת פטרי על הקרח.
8. להעביר את התולעת התורם למים planarian להתאושש, להירפא, להתחדש.
9. כאשר כל ההשתלות הושלמו, למקם את התולעים הושתלו 10 ° C בחממה במשך הלילה.
10. למחרת בבוקר, נזהרת שלא להפריע את השתל, לחשוף את התולעת ולהעביר אותו (על נייר פילטר שחור שלה) לצלחת פטרי מלא מים planaria.
11. או לאפשר התולעת כדי לסלק את עצמו מן העיתון את המסנן בעדינות או להסיר אותה עם מלקחיים.
12. להחליף את המים פעם אחת planarian כל 2-3 ימים.

6. נציג תוצאות

מיד לאחר הקרנת planaria חלקית יופיע נורמלי מעושה. תלוי במינון נמסר גיאומטריה של מגן משמש, רקמות מוקרן עלול לסגת ואפילו להתפרק ^7. רקמת מוגן יישאר ללא שינוי. Follרגרסיה רקמות בשל ואובדן שלמות רקמות, blastema יהוו ומבנים חסרים יהיה מחדש (3A איור). אם הקטיעה נעשית באזור מוקרן באופן חלקי, רקמות מוקרן יהיה להציל (כלומר למנוע מן רגרסיה או מתפורר) (איור 3 ב). הן שלא נפגעו התחדשות במקרה קטוע יעוכב לעומת קטוע לא מוקרן planaria (איור 3 ג). אם מינון ה-X של 30 Gy נמסרה ואת בעלי החיים היה מוקרן באופן חלקי הבריאה, גזע מוצלח תא אבלציה בדגם המקביל עם מגן עופרת בשימוש ניתן לאשר 2 עד 3 ימים לאחר הקרנה חלקית על ידי הכלאה ב באתרו לתא גזע סמן Smed-piwi-1 ¹² (aka smedwi-1) (איור 4).

בבוקר לאחר השתלה, שתל מוצלחת של רקמות המושתל צריך להיות ברור Within רקמות המארח, לאחר דבק שני משטחי הגב ועל הגחון של המארח (5 א 'איור). מדי פעם, שתל תדבק אל פני השטח רק הגחון או הגב. אם ההשתלה לא הצליח לחלוטין, שום סימן של שתל יהיה גלוי מפני השטח או הגבי או הגחון של המארח (5 ב איור). זמן קצר לאחר השתלת מוצלחת של רקמת לא מוקרן לתוך המארח שהיו ablated בתאי גזע על ידי הקרנה קטלנית ^13,14, ב הכלאה באתרו של Smed-piwi-1 יגלה כי תאי גזע נמצאים בעיקר בתוך השתל (איור 5 ג ). בנוסף, שתלי מוצלחות של רקמה לא מוקרן לתוך המארחים מוקרן קטלנית תגרום ההצלה של רקמת המארח ההישרדות לטווח ארוך של המארח ^15.

באיור 1. סידור כללי של מרכיב בסיסיs עבור הקרנה חלקית. ב irradiator רנטגן עם המקור העליון רנטגן מיקומו (שפופרת קתודית) planarian הרדים ממוקם בדיוק מתחת מקור קרני ה-X בתחום ההקרנה. על מנת למקסם את שיעור ה-X המינון, המרחק בין planarian ומקור קרני ה-X צריך להיות ממוזער. המגן הראשי יש למקם בין צינור הקתודה ואת תולעת הרדים, קרוב ל תולעת כמו מעשי. המגן הראשי צריך להיות מתוכנן, מיוצר, ואת מיקומו כך שהוא מגן רקמות הרצוי אבל לגמרי חושף את שאר התולעת. מסחריים רבים מייצרת ייצרו מגינים להוביל מותאמים אישית מתוך הדיאגרמה עיצוב פשוט שלך, השתמשנו בהצלחה אלפא Systems Corp (Bluffdale, יוטה). המוביל צריך להיות עבה מספיק כדי לאפשר לכמות הרצויה של מיגון. לדוגמה, אם ליד מיגון מלא של 320 kV X-ray הקורה הוא הרצוי, המוביל צריך להיות 4.5-6 מ"מ עובי. Planarian ומגן ממוקמים עלנייר פילטר ספוג של Holtfreter בשורה צלחת פטרי הנשענת בדלי קרח. בהינתן מספיק גדול רנטגן בשדה קרינה וכמה מגינים להוביל זהים, דוגמאות רבות ניתן מוקרן באופן חלקי בבת אחת (לא בתמונה).

איור 2. בניית חדר ההתאוששות. (א ') התפוצץ נוף של תא השתלת רקמות התאוששות, מראה את כל הרכיבים בשכבות על גבי זו לאחר טבול פתרון קזאין רווי של Holtfreter. (ב) בחדר ההתאוששות הושלמה כמעט, הממחישות את מיקום הצולבות של Whatman # 3 מלבנים נייר פילטר אשר בנוחות לשים בארגז planarian הרדים, מניעת תנועה במהלך הריפוי. בנייה מדוקדקת של חדר ההתאוששות מונע תנועת בעלי חיים התייבשות, לקידום ריפוי מהיר יעילות גדולה יותר של השתלת רקמות.

איור 3. תוצאות נציג של הקרנה אחורית פשוטה חלקית. דובואה כפי שתוארו, ⁷ (א) 1/2 האחורי של planarians היו מוגנים עם יתרון ולאחר מכן נחשף כדי הקרנת רנטגן רקמה קדמית נצפתה לסגת חזרה לגבול בין מוקרן ו מוגן הרקמה שבה blastemas נקודות חסרות צבע נוצרו החיות החלו להתחדש. (ב) לעומת זאת, כאשר בעלי החיים היו ערופה לאחר הקרנה חלקית אותו לבצע (א '), רגרסיה רקמות לא נצפתה ואת הרקמה הנותרת הקדמי מוקרן חולץ. הכרות חיות מוקרן חלקית ראשי שהתחדשו (ב '), עם זאת, התחדשות התעכבה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת ערופים unirradiated (ג).

באיור 4. נציג outcoלי אבלציה גזע חלקי התא בעקבות הקרנת חלקי. הר שלם-In situ הכלאה (בכך) לסמן לתאי גזע Smed-piwi-1 עולה כי planaria סוג בטבע יש בתאי גזע מופץ ברחבי גופם למעט רקמה קדמית ל photoreceptors (ראש חץ) והלוע נכונה (כוכבית) ^14. (א) תבקשי Smed-piwi-1 שולט מוקרן אך מוגנים באופן מלא planaria קבוע שלושה ימים לאחר הקרנת מראה תא גזע ההפצה כי הוא נבדל מזה של planaria סוג בטבע. (ב) לעומת זאת, תבקשי Smed-piwi-1 אצל בעלי חיים, שהיו מוגנים באופן חלקי בלבד, משאיר חשופים הקדמי וגם האחורי, אך נקבעו גם שלושה ימים לאחר הקרנת הופעות שתאי גזע הם ablated מן הלא מוגן אזורים . ברים הם בקנה מידה 500 מיקרון.

איור 5. Examples של השתלת רקמת מוצלח לא מוצלח. (א ') בשידור חי תמונות של נופים הגב ועל הגחון של planarian מושתלים בהצלחה שלושה ימים לאחר ההשתלה. השתל (המצוין) נראה בבירור על שני משטחים הגב ועל הגחון, והוא מוקף ברקמה חסרות צבע מאפיין בממשק שתל המארח. (ב) במקביל, השתלות לא מוצלחות להציג שום רקמת השתל גלוי באתר ההשתלה (המצוין) ובמקום להראות וירפא, הפצע חסרות צבע, לרוחב של השתלת נכשל. שתל זה דבקה הגב או רק את פני השטח הגחון יכול להידמות השתלה מוצלחת (א ') כאשר הוא מוצג מצד אחד השתלה מוצלחת (ב') כאשר צפו השני. (ג) רקמת בר (WT) הוא סוג מורכבים לתוך המארח מוקרן כי כבר ablated בתאי גזע תושב ותאי גזע המושתלים מתגלים מאוחר יותר Smed-piwi-1 יומיים לאחר השתלת ידי משאלה,ההצלחה של השתלת מוצגת בצורה ברורה על ידי נוכחות ספציפית בתאי גזע רק או סביב מיקום השתל (ראשי חץ). ברים הם בקנה מידה 500 מיקרון.

דיון

החשיבות של חוסר תנועה

Immobilization הוא ללא ספק השלב הקריטי ביותר על ההשלמה המוצלחת של כל התהליכים האלה. אם planaria הם משותקים באופן לא תקין לפני הקרנה חלקית, הם עלולים לעבור מתחת למגן את ההובלה, ייצור תוצאות לא עקביות ולא בלבול. בנוסף, אם בעלי חיים משותקת במידה מספקת לאחר ההשתלה, תולעת המארחת צפויה להתרחק רקמת השתל, והתוצאה היא כישלון של שתל להחלים בצורה נאותה לארח. חוסר תנועה נכונה מושגת על ידי התאמת ריכוז או או...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
כללי העברת מטרת פיפטה	Samco	691
צינורות נימי (0.75 מ"מ ID)	Fhc	30-30-0
צינורות נימי (OD 0.7 מ"מ)	Fhc	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
מסנן נייר שחור	שלייכר & Schuell	10310809
Whatman # 2 מסנן נייר 1002-055	פישר סיינטיפיק	09-810B
Whatman # 3 מסנן נייר 1003-185	פישר סיינטיפיק	09-820E
סיגריה מתגלגל נייר	זיג זג, מקורי	NA
פטרימנות	VWR	82050-544
מלקחיים דומונט, Inox # 5	FST	11251-20
Chloretone	סיגמא אולדריץ'	112054
קזאין	סיגמא אולדריץ'	C3400
להוביל שילדס	אלפא מערכות קורפ, Bluffdale, UT	עיצוב מותאם אישית
XRAD-320 ביולוגית Irradiator	Precision X-Ray, צפון Branford, CT	NA