בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים אחרים במבחנה ו In vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית
במאמר זה
סיכום
תקציר
העברה יעילה של גנים למערכת העצבים המרכזית (CNS) היא חשובה לחקר תפקודי גנים, למידול מחלות נוירולוגיות ולפיתוח גישות טיפוליות. וקטורים לנטיביריים הם כלים אטרקטיביים להחדרה (transduction) של נוירונים וסוגי תאים אחרים ב-CNS, מכיוון שהם מחדירים גנים הן לתאים המתחלקים והן לתאים שאינם מתחלקים, תומכים בביטוי מתמשך של טראנסגנים, ובעלי קיבולת אריזה גדולה יחסית ורעילות נמוכה 1-3. וקטורים לנטיביריים שימשו בהצלחה להחדרה של סוגי תאי עצב רבים in vitro 4-6 ובבעלי חיים 7-10.
נעשו מאמצים ניכרים לפיתוח וקטורים לנטיביריאליים עם בטיחות ביולוגית ויעילות משופרות להעברת גנים. וקטורים לנטיביריאליים מהדור השלישי הנוכחי, אשר הם חסרי יכולת שכפול ועצמיים-מבטלים (SIN), מוצגים ב-איור 1. האלמנטים הנדרשים לאריזת הווקטור מחולקים לארבעה פלסמידים. בפלסמיד ההעברה הלנטיביריאלי, אזור ה-U3 ב-5' long terminal repeat (LTR) מוחלף בפרומוטר חזק מנגיף אחר. שינוי זה מאפשר שעתוק של רצף הווקטור ללא תלות בחלבון HIV-1 Tat, הנדרש בדרך כלל לביטוי גנים של HIV 11. סימון האריזה (Ψ) חיוני לתהליך ה-encapsidation, והאלמנט התגובתי ל-Rev (RRE) נדרש להפקת וקטורים בטיטר גבוה. ה-central polypurine tract (cPPT) חשוב ליבוא גרעיני של DNA הווקטור, תכונה הנדרשת להעברה (transducing) של תאים שאינם מתחלקים 12. ב-3' LTR, הרצפים בעלי הבקרה ה-cis הוסרו לחלוטין מאזור ה-U3. מחיקה זו מועתקת ל-5' LTR לאחר שעתוק הפוך, מה שמוביל להשבתה שעתוקית של שני ה-LTRs. פלסמיד pMDLg/pRRE מכיל את הגנים HIV-1 gag/pol, המספקים חלבונים מבניים וטרנסקריפטאז הפוך. pRSV-Rev מקודד ל-Rev, הנקשר ל-RRE לצורך ייצוא יעיל של RNA מהגרעין. pCMV-G מקודד לגלייקופרוטאין של נגיף הסטומטיס הוסיקולרי (VSV-G), המחליף את HIV-1 Env. VSV-G מרחיב את הטרופיזם של הווקטורים ומאפשר ריכוז באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה 13. כל הגנים המקודדים לחלבונים עזריים, כולל Vif, Vpr, Vpu ו-Nef, מושמטים ממערכת האריזה. ייצור ומניפולציה של וקטורים לנטיביריאליים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ה-NIH למחקר הכולל DNA רקומביננטי (http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf). ייתכן שיידרש אישור מוועדה מוסדית לבטיחות ביולוגית וכימית לפני שימוש בווקטורים לנטיביריאליים. וקטורים לנטיביריאליים מופקים בדרך כלל על ידי קוטרנספקציה של תאי 293T עם פלסמיד העברה לנטיביריאלי ופלסמידי עזר המקודדים לחלבונים הדרושים לאריזת הווקטור. ניתן להשיג פלסמידי העברה לנטיביריאליים ופלסמידי עזר רבים מ-Addgene, מאגר פלסמידים ללא מטרות רווח (http://www.addgene.org/). פותחו מספר שורות תאי אריזה יציבות, אך מערכות אלו מספקות גמישות נמוכה יותר ויעילות האריזה שלהן יורדת בדרך כלל עם הזמן 14, 15. ערכות טרנספקציה זמינות מסחרית עשויות לתמוך ביעילות טרנספקציה גבוהה 16, אך הן עלולות להיות יקרות מאוד עבור הכנות של וקטורים בקנה מידה גדול. שיטות של שיקיעה בסידן פוספט מספקות טרנספקציה יעילה ביותר של תאי 293T, ולכן מהוות גישה אמינה וכלכלית לייצור וקטורים לנטיביריאליים.
בפרוטוקול זה, אנו מייצרים וקטורים לנטיביריים באמצעות טרנספקציה משותפת של תאי 293T עם ארבעה פלסמידים המבוססת על עיקרון שיקיעת סידן פוספט, ולאחר מכן ביצוע טיהור וריכוז באמצעות אולטרסנטריפוגציה דרך כרית סוכרוז 20%. טיטרי הוקטורים נקבעים באמצעות ניתוח מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) או באמצעות qPCR בזמן אמת. הייצור והטיטרציה של וקטורים לנטיביריים בפרוטוקול זה יכולים להסתיים תוך 9 ימים. אנו מספקים דוגמה להחדרה (טרנסדוקציה) של וקטורים אלה לתרביות של נאוקורטקס עכברי המכילות הן נוירונים והן אסטרוציטים. אנו מדגימים כי וקטורים לנטיביריים תומכים ביעילות גבוהה של טרנסדוקציה וביטוי גנים ספציפי לסוג התא בתרביות ראשוניות של תאים ממערכת העצבים המרכזית (CNS).
פרוטוקול
1. אריזות של וקטורים lentiviral
וקטורים lentiviral המיוצרים על ידי cotransfection של וקטור העברת lentiviral ו פלסמידים אחרים הנדרשים האריזה לתוך התאים 293T בשיטה סידן פוספט transfection. אנו משתמשים 10 100 מ"מ בתרבית רקמה מנות בפרוטוקול זה. זה יכול להיות scaled למעלה או למטה בהתאם יישומים. קו תא 293T נשמרים שונה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM) עם גלוקוז גבוה (4,500 מ"ג / ל '), השלימו עם סרום 10% שור עוברית (FBS), 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ב 37 ° C חממה עם 5% CO 2.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, הראינו את הייצור של וקטורים lentiviral ויישום של וקטורים אלה בתרבויות המוח. הראינו יעיל תא סוג ספציפי התמרה עם וקטורים המיוצרים בשיטות אלה. כאשר היזם synapsin משמש, ביטוי של GFP הוא בהחלט נוירון מסוים. כאשר היזם GFAP משמש, ביטוי של GFP הוא אך ורק האסטרוציטים. אם לא ביטוי סוג ספציפי התא נדרש, האמרגן בכל מקום ניתן להשתמש. מצאנו גם ubiqutin ו קינאז phosphoglycerate (PGK) מקדמי יכול לנהוג ביטוי גבוהה רמת גן בתרבויות שבמוח 6. ביטוי גנים מונע על ידי וקטורים lent.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המוח NIH תכנית אב Core מענק (p30 NS057105, BJS) כדי אוניברסיטת וושינגטון, תוכנית פרויקט גרנט NS032636 (BJS) ועל ידי מרכז התקווה הפרעות נוירולוגיות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| בסרום שור עוברית | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM | |
| טריפסין-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| סודיום בוטיראט | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadimethrine ברומיד (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 293T תאים | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 תאים | ATCC | CCL-121 | |
| פלקון 100 x 20 מ"מ רקמת תרבותה מנה | BD Biosciences | 353003 | |
| 1 x 3 ½ בצינור צנטריפוגות polyallomoer | Beckman Coulter- | 326823 | |
| 0.2 מיקרון המסנן המזרק | קורנינג | 431219 | |
| QIAamp DNA מיני קיט | Qiagen | 51304 |
מקורות
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
