כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתוך המעי מתגוררים אוכלוסיות ייחודיות של תאים חיסוניים מולד אדפטיבית המעורבים בקידום הסובלנות כלפי פלורה commensal ו אנטיגנים מזון תוך במקביל צפוי להישאר לעלות תגובות דלקתיות כלפי 1,2 פתוגנים פולשניים. תאים מציגי אנטיגן, במיוחד DCS ומקרופגים, ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס החיסון במעי באמצעות יכולתם לחוש כראוי להגיב החיידקים 3-14. בידוד יעיל של DCS ומקרופגים מעיים הוא שלב קריטי לאפיון הפנוטיפ ותפקוד של תאים אלה. בעוד שיטות יעילות רבות של בידוד תאים חיסוניים מעיים, כולל DCS ומקרופגים, תוארו 6,10,15-24, רבים מסתמכים על פי digestions ארוכים שעלולים להשפיע לרעה על שטח פני התא אנטיגן הביטוי, כדאיות התא, ו / או תשואה התא. כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של מספר רב של viabl, דואר DCS מעיים ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע ישירות על ידי מכתים תאים במערכת העיכול מבודדים עם ספציפיים נוגדנים חד שבטיים הקרינה, שכותרתו עבור ניתוח רב צבע זרימת cytometric. יתר על כן, DC טהור מאוד מקרופגים אוכלוסיות מבודדות ללימודי תפקודית ניצול CD11c ו CD11b מגנטי פעילה חרוזים סלולריים מיון ואחריו מיון התא.
פרוטוקול
1. דיסקציה ודיסוציאציה בתאי האפיתל במעי
הכנת חומרים כימיים וציוד:
- חם Ca 2 + / 2 + Mg ללא PBS (CMF PBS) לטמפרטורת החדר.
- ע"א חם 2 + / 2 מ"ג + ללא HBSS עם FBS 5% (CMF HBSS / FBS) ו - 2 מ"מ EDTA לטמפרטורת החדר.
- חם Orbital שאכר אל 37 ° C.
הער....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
איור 3. גורמים חשובים עבור אופטימיזציה של התשואה התא אנטיגן ביטוי על פני השטח. תשואה תא אנטיגן ביטוי פני מושפעים ישירות על ידי כל תקופת עיכול רקמות, המאפיינים הספציפיים של collagenase, תואר של רקמות מיותרות, ונוכחות או העדר דלקת, אשר עשויים להשפיע על שלמות רקמות cellularity. עיכול רקמת ממושך עלול לגרום כדאיות התא ירד אנטיגן ביטוי פני השטח תוך כדי עיכול רקמות מספקת עלולה לגרום מיעוט של תאים לניתוח. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
אנו מודים אהרון ריי (אוניברסיטת אמורי המחלקה לרפואת ילדים בריאות לילדים של Core תזרים אטלנטה) עבור מיון התא. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AA01787001, פיתוח קריירה פרס מ קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה, מרכז המחקר אמורי-Egleston לילדים זרע מענק TLD
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| 1X PBS, Ca 2 + - ו - Mg 2 + ללא | |||
| האנק של פתרון מאוזן מלח (HBSS) עם פנול אדום | פישר סיינטיפיק | SH3001603 | |
| סודיום ביקרבונט | סיגמא | S6014 | |
| HEPES 1M ב NaCl 0.85% | Lonza | 17-737E | |
| העובר שור בסרום (FBS) | אטלנטה ביולוגיות | S11150H | חום מומת |
| 0.5m EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenasה סוג השמיני | סיגמא | C2139 | |
| אני DNase | רוש | 14785000 | הפתרון במלאי: 100mg/ml |
| LIVE / מת קיט אפשר לתקן אקווה Cell המלח הכתם על עירור 405 ננומטר | Invitrogen | L34957 | השתמש ב 1:1000 |
| CD45-PerCP מב (30F11) | BD | 557235 | השתמש ב 1:100 |
| CD103-PE מב (M290) | BD | 557495 | השתמש ב 1:100 |
| FcγRIII / II מב (2.4G2) | BD | 553141 | השתמש ב 1:200 |
| CD11c-APC מב (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | השתמש ב 1:100 |
| MHC-II (I-AB), Alexa פלואוריד 700 MAB | eBioscience | 56-5321-82 | השתמש ב 1:100 |
| CD11b eFluor-450MAB (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | השתמש ב 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 מב (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi BIOTEC | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi BIOTEC | 130-052-001 | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטי | BD פלקון | 352098 | |
| רשת אחת חוט מסננת | Chefmate | ||
| קטן שוקל סירה | פישר סיינטיפיק | 08-732-116 | |
| תא 100 מיקרומטר מסננת | BD פלקון | 352360 | |
| תא 40 מיקרומטר מסננת | BD פלקון | 352340 | |
| 5 מ"ל קלקר מסביב התחתונה צינורות | BD פלקון | 352235 | השתמש ב 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop מסלולית שאכר | Thermo Scientific | ||
| LS טור MACS | Miltenyi BIOTEC | 130-042-401 | |
| LSR II | BD | ||
| FACSAria II | BD |
מקורות
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
