מאמר שיטה

אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס

15.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4042

⸱

5 באפריל 2012

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University , 2Department of Cell Biology and Anatomy and the Hotchkiss Brain Institute, Faculty of Medicine, University of Calgary

במאמר זה

סיכום

מעגלים עצביים מאורגנים מבחינה טופוגרפית עם פרופילים מולקולריים ספציפיים לתאים פונקציונליים. כאן, אנו מספקים את הצעדים המעשיים והטכניים של חשיפת הטופוגרפיה המוח העולמי באמצעות גישה צדדי wholemount מכתים immunohistochemical. אנו להדגים את התועלת של השיטה באמצעות cytoarchitecture מבינים היטב ואת המעגלים של המוח הקטן.

תקציר

ארכיטקטורת הסלולר חזר היטב הבין של המוח הקטן לעשות את זה במערכת מודל אידיאלי לחקר הטופוגרפיה המוח. בבסיס cytoarchitecture אחידה יחסית הוא מערך מורכב של תחומים parasagittal של גנים ביטוי החלבון. מידור המולקולרי של המוח הקטן ניצבת ארגון אנטומי ופונקציונלי של סיבים מביא. כדי להעריך במלואה את המורכבות של הארגון cerebellar מיקדנו בעבר הגישה מכתים wholemount לניתוח קצב העברת נתונים גבוה של מומים דפוסים במוח הקטן העכבר. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ריאגנטים, כלים וצעדים מעשיים מועילים בהצלחה לחשוף דפוסי ביטוי חלבונים במוח הקטן העכבר למבוגרים באמצעות immunostaining wholemount. הצעדים מודגשת כאן להדגים את התועלת של שיטה זו באמצעות ביטוי zebrinII / aldolaseC כדוגמה כיצד הטופוגרפיה קנס של המוח יכול להתגלות שלהקונפורמציה יליד תלת מימדי. מתואר גם הם עיבודים לפרוטוקול המאפשרים הדמיה של ביטוי החלבון תחזיות מביא ו cerebella גדול של מחקרים השוואתיים של הטופוגרפיה מולקולרית. כדי להמחיש יישומים אלה, נתוני מכתים מביא של המוח הקטן עכברוש כלולים.

פרוטוקול

1. בעלי חיים זלוף ו Dissection המוח הקטן

  1. בהתאם חלבון, זלוף עשוי להיות חיוני מכתים 1,2 מוצלח. זלוף Transcardiac היא פולשנית, לא הישרדות הליך הדורש שימוש נכון של חומרי הרדמה. הכשרה נכונה, אישור מוסדי, ואישור IACUC כל הדרוש לפני שתנסה את ההליך. זה תמיד רעיון טוב להתייעץ עם וטרינרים המוסד לקבל עזרה בזיהוי דרישות הניסוי ורכישת אימונים נכונה. לפני ההליך, בעלי חיים צריך להיות בהרדמה עמוקה ולא מגיבים לגירויים כגון ברגל או קמצוץ הזנב. באמצעות מספריים לעשות חתך בעור הבטן הקיר שריר ואז להמשיך לפתוח את בית החזה על ידי חיתוך צמוד רק עצם החזה מכל צד. בנוסף, הניסוי יכול ליצור מרחב עבודה פנימי גדול יותר על ידי חיתוך fascia סביב הסרעפת. על ידי הרמת הבטן החזה הקיר superiorly, בלב עכשיו יהיה חשוף. לעשות חתך קטן דרך העלייה הימנית כדי לאפשר לדם לזרום החוצה ומיד להכניס את המחט זלוף אל החדר השמאלי. משאבת ההידרוסטטי הבסיסי הוא העדיף לספק את הפתרונות זלוף (ראה לוח 1 לפרטים נוספים). ראשית, לשטוף את הדם עם פוספט 0.1M בופר סליין (PBS, ראה טבלה 3) עד שהנוזל פועל ברורה. לאחר מכן, כבה את משאבת ההידרוסטטי, לעבור במהירות את צינור אספקת פתרון למיכל של paraformaldehyde 4% (PFA, ראה טבלה 3) מדולל PBS ולאחר מכן הפעל את המשאבה שוב, כדי לספק את מקבע. השימוש במשאבה אין צורך: עם בפועל, שני מזרקים מלאים PBS ו - 4% PFA ניתן להשתמש כדי לספק את הפתרונות לאט.
  2. זה קריטי כדי לנתח בזהירות את המוח של הגולגולת ללא החדרת כל נגעים לרקמות. אפילו חתכים קטנים למוח במהלך דיסקציה בהדרגה להרחיב את הסדקים נראים לעין, כינוגדנים מלכודת ולגרום מכתים artifactual במהלך עיבוד של הרקמה (למשל כוכביות אדומים איור 2). עבור והניתוחים המוח הקטן, זה אופייני לחתוך את העור כלפי מטה באמצע הראש ואז בעדינות להקניט את דשי חוץ לחשוף את הגולגולת. חותכים את הגולגולת מן הקדמי אל האחורי לאורך קו האמצע הגב, וגם רוחבית לאורך שני הצדדים של הגולגולת. לא לחתוך מעבר גבחת כמו זה מסתכן מוכנים לעצור המוח הקטן. באמצעות מלקחיים בעדינות להרים הקדמי של הגולגולת מן המוח נזהרים שלא לקרוע רקמת המוח המחובר קרומי המוח. לנתק את עצבי הגולגולת בצד הגחוני של המוח.
  3. ההפרדה של המוח הקטן משאר המוח חשוב משתי סיבות. ראשית, היא מאפשרת בדיקה של דפוסי הביטוי של אונות הקדמי, אשר מוסתרים מן העין על ידי colliculi באתרו. השנייה היא כי הפרדת רקמות לתוך אזורים קטנים ומבודדים, מאפשר מ 'בצר קיבוע מלא, מה שיכול להקל על צביעה של חלבונים מסוימים. במהלך שלב זה לנתיחה הסופי, יש להיזהר שלא לגעת במוח הקטן בקצות המלקחיים. הכנס את קצות זוג מלקחיים למרכז את colliculi עליונים ונחותים. עם סט שני של מלקחיים לאט להקניט משם colliculi נחות מן המוח הקטן. לאחר מכן, להניח את המוח הקטן, כך הצד הקדמי שלו פונה כלפי מטה ואת גזע המוח הוא מצביע מעלה. הכנס את מלקחיים לתוך החדר 4 בין גזע המוח לבין אונות ט / X של המוח הקטן. חותכים את peduncles ידי צובט עם מלקחיים את שני הצדדים ואז בעדינות להרים את המוח הקטן מן גזע המוח. ברגע המוח הקטן מבודד, לאחר לתקן את זה על ידי טבילה PFA 4% ב 4 ° C למשך תקופה מינימלית של 24-48 שעות. המוח הקטן ניתן לאחסן PFA 4% לאורך זמן. קרומי המוח יש להסיר לפני או אחרי מכתים את ניראות טובה יותר של דפוסי הביטוי.אם הנסיין בוחר להסיר את קרומי המוח לפני צביעה יש סבירות גבוהה כי המוח הקטן יהיה פצע במהלך התהליך. קילוף קרומי המוח בסוף ההליך מכתים הרבה יותר פשוט כי הם הופכים להיות קלים יותר לאיתור לאחר שהם רוכשים מכתים רקע חלש ולהיות שברירי שלאחר עיבוד.

2. עיבוד רקמות עבור מכתים Wholemount

בגלל הגישה מכתים wholemount לוקח יותר מכתים immunohistochemical סעיפים רקמות, כדאי לתכנן את ציר הזמן עבור כל אחד הניסויים כפי שמוצג בלוח השנה למשל בתנאי (טבלה 2). לפני שמתחילים, יש דברים מרכזיים שכדאי לזכור. 1) את microtubes המכילים רקמות צריך לסובב על nutator בכל עת, אלא בתהליך ההקפאה / הפשרה. 2) כמה פתרונות יש לבצע טריים עבור כל ניסוי (ראה לוח 3 מתכונים פתרון). 3)לאורך כל פרוטוקול, כאשר שינוי פתרונות, בעדינות לשפוך את הפתרון בילה במקום להסיר את המוח הקטן עם מלקחיים, אל תיגע המוח הקטן. לאחר מכן, לאחר ערבוב פתרון חדש בכלי אחר, השתמש פיפטה בעדינות כדי להוסיף את הפתרון טרי הצינור.

2.1 יום 1:

  1. לתקן את המוח הקטן ב 3 תיקון של דנט בטמפרטורת החדר במשך 6-8 שעות מתנדנד בעדינות על nutator. אם מתנול הוא הרסני אנטיגן, שקול החלפת שלבים דרך 2.1a 2.3a עם שיטת אחזור אנטיגן. חום מאגרים המשמש אחזור אנטיגן יעזור להכין את הרקמה לחדירה נוגדנים.
  2. המוח הקטן בליץ בליץ של דנט ב 3 בלילה ב 4 ° C.

2.2 יום 2:

  1. מייבשים המוח הקטן בשני סיבובים של MeOH 100% בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כל אחד.
  2. לאחר מכן, כדי לשפר את החדירה של פתרונות, בכפוףרקמה לסדרה של ההקפאה / הפשרה מחזורים. בזהירות להניח את הצינור במיכל עם קרח הקפאה יבשה למשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר את הצינור ולהשאיר אותה בטמפרטורת החדר על הספסל במשך 15 דקות. שלב ההקפאה / הפשרה יש לבצע ארבע פעמים (לפחות).
  3. לאחר שעבר הפשרה של רקמה, הצב את הצינור לתוך המקפיא -80 ° C למשך הלילה.
  4. רקמת ניתן לאחסן לתקופות ממושכות של זמן -80 ° C או מיד לפני או אחרי ההקפאה / הפשרה צעדים. אחרת, פרוטוקול יש להמשיך.

2.3 יום 3:

  1. Rehydrate המוח הקטן על ידי שטיפה ב% 50% MeOH/50 PBS, 15% MeOH/85% PBS, ו 100% PBS עבור 60-90 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
  2. לאחר מכן, למבוגר העכבר cerebella, בכפוף רקמות עיכול אנזימטי עם 10μg/ml proteinase K ב PBS למשך 2-3 דקות. לא צעד העיכול הכרחי cerebella של בעלי חיים צעירים (P5 או הצעיר העכבר). עוד digestion מוצע על מוחות גדולים יותר. למשל, מערכת העיכול יכול להיות גבוה כמו 5-6 דקות המוח הפרימטים 4.
  3. לאחר העיכול, מיד לשטוף את המוח הקטן של PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר כדי להסיר את ק proteinase
  4. לחסום את הרקמות PMT (ראה לוח 3) לילה ב 4 ° C. אבקת חלב היא לעתים קרובות הבחירה הראשונה בעת בחירת סוכן חסימת לעבודה חלבון כי זה זול, יעיל מוריד כתמים רקע, ובדרך כלל לא מפריע מחייב נוגדנים או גישה אנטיגן. סרומים בעלי חיים יכול לשמש גם, אם כי הנסיין צריך להיות מודע העלות הנוספת וחייבים 1 לבדוק את איכות סרום בין תגובתי נוגדנים ויכולת לייצר אות אופטימלי יחס רעש.

2.4 יום 4-5:

  1. דגירה רקמות נוגדנים ראשוניים בדילול ב PMT בתוספת DMSO 5% למשך 48 שעות ב 4 ° C (largאה cerebella ידרוש פעמים דגירה גדל).

2.5 יום 6:

  1. לשטוף את המוח הקטן 2-3 פעמים למשך 2-3 שעות כל אחד ב PMT ב 4 ° C להסיר נוגדנים מאוגד ראשוניים.
  2. לאחר מכן, דגירה רקמות נוגדנים משניים בתמיסה המכילה DMSO PMT עם 5% ב 4 ° C למשך הלילה (cerebella גדול מהן יהיה זמני דגירה גדל).

2.6 יום 7:

  1. לשטוף את המוח הקטן 2-3 פעמים למשך 2-3 שעות כל אחד ב PMT ב 4 ° C.
  2. תן רקמות לשטוף הסופי עם PBT (ראה לוח 3) למשך 1-2 שעות. צעד זה מסיר עודפי החלב ומשפר את בהירות מכתים.
  3. לבסוף, דגירה רקמות DAB (3,3 '-diaminobenzidine) פתרון עד עוצמת מכתים האופטימלי הוא הגיע. המוצר התגובה החום צריך להיות בבירור בתוך ~~~HEAD=NNS 10 דקות. עדיף להשתמש DAB בחושך כאור גורם אב צבע כדי precipitaטה, אשר יכול להגביר מכתים רקע.

2.7

כאשר עוצמת מכתים האופטימלי הוא הגיע, לעצור את התגובה על ידי הנחת המוח הקטן של PBS עם אזיד הנתרן 0.04%. הרקמה עשוי להיות מאוחסן לטווח ארוך בפתרון זה. אזיד הנתרן הוא מעכב חזק של התפתחות חיידקים, אך יש להימנע עד שלב זה כמו גם מעכב peroxidase חזרת.

2.8 הגברה אופציונלי ההליך:

בעקבות פרוטוקול רגיל אבל את הפעולות הבאות יש לבצע במקום צעדים 2.5b-2.7 לעיל.

  1. דגירה רקמת לילה ב 4 מעלות צלזיוס ביוטין, מצומדות נוגדנים משניים PBST (ראה לוח 3) עם DMSO 5%.
  2. שוטפים את הרקמה למשך 2-3 שעות כל אחד ב 3-4 של PBST שינויים בטמפרטורת החדר.
  3. דגירה המוח הקטן בן לילה ב 4 ° C בתמיסה ABC מורכבת PBST.
  4. שוטפים את הרקמה למשך 2-3 שעות כל אחד בהחדר הטמפרטורה משתנה 3-4 של PBS.
  5. דגירה הרקמה בתמיסה טרי שהוכן DAB, כפי שתואר לעיל.
  6. כאשר מכתים הוא אופטימלי, לעצור את התגובה על ידי שטיפת המוח הקטן של PBS עם אזיד הנתרן 0.04%.

3. הדמיה רקמות ויטראז

  1. תמונות Wholemount ניתן ללכוד באמצעות, למשל, מצלמת הלייקה DFC3000 FX רכוב על סטראו MZ16 FA לייקה לייקה פועל יישום תוכנה סוויטה FX. אם תרצה, מיקרוסקופיה deconvolution ניתן לרכוש תמונות רצופות מספר רב של מטוסים מוקד שונים, כאשר כל תמונה שיש רק lobule אחת בפוקוס חד. לאחר מכן, את התמונות ניתן לדחוס לתוך ערימה אחת ותוכנה שניתנו להסיר עיוות. תמונה מורכבת הסופי להמחיש המוח הקטן ביטוי דפוסי משטח עם דפוסים הכל גלוי מוקד ברור.
  2. רקמה צבעונית Wholemount יש צילמו תוך שקוע PBS (או אחר בינוני זה ייתןמקדם שבירה אופטימלי). על מנת למקם בקלות wholemount הדמיה, להפוך את הג'ל אגר 1% בצלחת פטרי פלסטיק. חותכים חורים קטנים לתוך הג'ל. החורים תאפשר המוח הקטן להיות תקועה אוריינטציה הרצוי.
  3. נתונים גולמיים מיובאים לתוך Adobe Photoshop CS4 ומותאמים רמות הניגודיות והבהירות.

בעלי חיים

כל המחקרים בוצעו על בעלי חיים על פי פרוטוקול שאושר חיה IACUC על פי הנחיות מוסדיים על אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה. זכר ונקבה outbred שוויצרי וובסטר (Taconic, באולבני, ניו יורק) עכברים נשמרו במושבה שלנו משמשים כל המחקרים. חולדות בוגרות מורדמים, נמסרו באדיבות על ידי ד"ר ירדן Bryen (אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה). כל החיות היו לפחות בן חודש.

4. נציג תוצאות

המוח הקטן הוא ממודר על ידי הביטוי המולקולרי לארבעה אזורים רוחביים:באזור הקדמי (AZ: ~ אונות IV), אזור מרכזי (CZ: ~ אונות VI-VII), האזור האחורי (PZ: ~ אונות VIII-IX הגבי) ואת אזור קשרי (ניו זילנד: ~ אונות הגחון IX ו-X ) 5. כל אזור מכיל מגוון ייחודי של פסים parasagittal 1,2,5,6 (איור 1). הביטוי ZebrinII בתאים פורקינג' מגלה פסים AZ ו PZ (איור 2) וביטוי אחידה CZ ו NZ (איור 2). ארגון parasagittal של תאים פורקינג' ניצבת הטופוגרפיה בשטח הטרמינל של סיבים מביא. תמליל קוקאין, אמפטמינים ו-מוסדר (CART) פפטיד מתבטא תת קבוצות של סיבים טיפוס (איור 3 א ') כי פרויקט פסים של דנדריטים פורקינג' תאים בשכבה המולקולרית של קליפת המוח הקטן 7 (איור 3 ב). עם שינויים מתאימים, כגון הגברה 7, פרוטוקול wholemount מאפשר הדמיה של דפוסי olivocerebellar בלי לביתד כמה שחזורים, מייגעים זמן רב ממקטעים רקמות מכתים (איור 3 ב).

figure-protocol-1
באיור 1. א ZebrinII / aldolaseC ביטוי מגלה להקות sagittal בסעיפים רוחביים של המוח הקטן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. ב ZebrinII / aldolaseC באה לידי ביטוי אך ורק somata תא פורקינג' ו דנדריטים. קנה מידה בר = 150μm (GL = שכבת פרטנית, PCL = שכבת פורקינג' התא; מ"ל = שכבה מולקולרית).

figure-protocol-2
איור 2. המוח הקטן wholemount מוכתם עבור ZebrinII / aldolaseC מראה פסים פורקינג' התא בתמונות של הקדמי (AZ), מרכז (CZ), ו האחורית (PZ) אזורים של המוח הקטן. כאן אנו גם להראות דוגמה תוצאה שלילית של מוכנים לעצור המוח הקטן. מכתים artifactual וכתוצאה מכך ניתן ללמודעם כוכביות אדומות. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ (LS = סימפלקס lobulus; PML = paramedian lobule: COP = קופולה pyramidis).

figure-protocol-3


איור 3. עגלת א באה לידי ביטוי טיפוס מסופי סיבים בשכבה המולקולרית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (מ"ל = השכבה המולקולרית, PCL = שכבת פורקינג' התא; GL = שכבת גרגרי) ב אימונוהיסטוכימיה Wholemount הביטוי עגלת בניו זילנד. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ (COP = קופולה pyramidis; PML = paramedian lobule; PFL = paraflocculus: FL = flocculus).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תיארנו את הפרטים הטכניים הדרושים מכתים wholemount מוצלח באמצעות גישה immunohistochemical תכליתי עבור ביטוי חושפני חלבון במוח המתפתח ומבוגרים. על ידי שימוש בגישה זו, מורכבים דפוסי הביטוי מולקולרית ניתן לנתח והטופוגרפיה המוח מוערך ללא צורך מייגעים זמן רב נהלים חתך רקמות.

פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לחשוף את הביטוי בדוגמת של מספר חלבונים סלולריים פורקינג' אצל אדם מבוגר הן 1,2,8,9 ועכבר מוקדם לאחר הלידה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו מה למסור.

תודות

מ"א נתמך על ידי החוקר חדש הזנק כספים אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה של הישיבה יוניברסיטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומרים פונקציה בפרוטוקול
זלוף המשאבה (פישר Scientific/13-876-2) מאפשר טפטוף עקבי ואיטי.
חד עצה מספריים (FST/14081-08) שימוש כללי זלוף ו לנתיחה.
בלאנט, עצה מלקחיים (FST/91100-12) כדי לייצב את הלב על החדרת המחט זלוף.
מלקחיים (FST ידי דומון AA/11210-10) לשימוש במהלך דיסקציה של המוח מהגולגולת כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח. אלה הם חיוניים, כי יש להם קצה מעוגל מעט, המסייע לצמצם פגיעה במוח הקטן במהלך לנתיחה.
Nutator (פישר סיינטיפיק) משמש כדי לשמור על רקמת בתנועה בתקופות הדגירה.
1.5 מ"ל צינור (Sarstedt / בורג שווי מיקרו Tube) כל הצעדים של שלוtochemistry פרוטוקול להתקיים microtubes אלה. תחתית מעוגלת מבטיח כי המוח הקטן נשאר בתנועה.
כף מחוררת (FST/10370-17) נהג להחזיק wholemounts ב microtubes תוך בעדינות decanting את הפתרון בילו.
לייקה MZ16 מיקרוסקופ FA נהג לבחון מכתים wholemount.
לייקה DFC3000 FX המצלמה נהג ללכוד תמונות wholemount.

טבלה 1.

למשל לוח שנה לניסוי wholemount טיפוסי
יום 1 דנט של תיקון, בטמפרטורת החדר, 8 שעות דנט של אקונומיקה, 4 ° C, בן לילה
יום 2 100% MeOH, בטמפרטורת החדר, 2x, 30 דק 'כל אחד 100 MeOH%, פריז / הפשרה,
4x, 30 דקות min/15 		n = "2"> MeOH 100%, -80 ° C, בן לילה
יום 3 50% MeOH/50% PBS, בטמפרטורת החדר, 60-90 דקות 15% MeOH / PBS 85%, בטמפרטורת החדר, 60-90 דקות 100% PBS, בטמפרטורת החדר, 60-90 דקות 10μg/mL proteinase K ב PBS, בטמפרטורת החדר, 2-3 דקות 100% PBS, בטמפרטורת החדר, 3x, 10 דק 'כל אחד PMT, 4 ° C, בן לילה
יום 4-5 PMT + 1 ° נוגדנים + 5% DMSO, 4 ° C, 48 שעות
יום 6 PMT, 4 מעלות צלזיוס, 2-3X, 2-3 שעות כל אחד PMT + 2 ° נוגדנים + 5% DMSO, 4 ° C, 24 שעות (או להתחיל צעדים הגברה עם ABC מורכבים)
יום 7 PMT, 4 מעלות צלזיוס, 2-3X, 2-3 שעות כל אחד PBT, בטמפרטורת החדר, 2 שעות דגירה ב DAB טרי PBS עד מכתים האופטימלי הוא דמיינו
_content "> לוח 2.

מתכונים (* = להכין טרי בכל פעם)
PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) 0.1M פוספט שנאגרו מלוחים במים deionized. ה-pH 7.2 (טבליות סיגמא: P4417)
PFA (Paraformaldehyde) עשה קפוא מאוחסנים כפתרון 20% ולאחר מכן מדולל ל -4% ב PBS לפתרון העבודה (פישר סיינטיפיק, T353)
דנט של * מקבע 3 4 חלקים מתנול
1 dimethylsulfoxide חלק (DMSO, פישר סיינטיפיק, D159-4)
דנט של בליץ 3 * 4 חלקים מתנול
1 dimethylsulfoxide חלק (DMSO, פישר סיינטיפיק, D159-4)
1 30% מי חמצן חלק
עיכול אנזימתי 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של proteinase K (Roche Diagnostics, 03115828001) ב PBS.
PBST PBS המכיל:
0.1% tween-20 (Fisheמחקר מדעי, BP337, טריטון יכול לשמש גם במקום Tween-20 בכל המקרים).
PMT 25 * PBS המכיל:
2% שומן אבקת חלב רזה (הציפורנים העדיף)
0.1% tween-20 (פישר סיינטיפיק; BP337)
PBT 25 * PBS המכיל:
0.2% (Sigma, B9001S) אלבומין בסרום שור
0.1% tween-20 (פישר סיינטיפיק; BP337)
DAB * ממיסים 1 ל -10 מ"ג של 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich, D5905) ב 40 מ"ל של PBS. הוסף 10 μl של מי חמצן 30% ליזום תגובה).
ABC קומפלקס פתרון Vectastain KIT (וקטור Laboratories, Inc, PK-4000)

לוח 3.

מקורות

  1. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
  2. Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2006).
  3. Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development. 105, 61-74 (1989).
  4. Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri. J. Anat. 204, 257-269 (2004).
  5. Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).
  6. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  7. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).
  8. Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).
  9. Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum. Cerebellum. 10, 409-421 (2011).
  10. Larouche, M., Hawkes, R. From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation. Cerebellum. 5, 77-88 (2006).
  11. Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development. J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).
  12. Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis. Development. 138, 1207-1216 (2011).
  13. Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse. Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).
  14. Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry. Brain Res. 1222, 106-117 (2008).
  15. Marzban, H., Hawkes, R. On the architecture of the posterior zone of the cerebellum. Cerebellum. 10, 422-434 (2011).
  16. Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum. J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).
  17. Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4. J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).
  18. Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease. J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).
  19. Sarna, J. R., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse. Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).
  20. El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis. Development. 135, 2981-2991 (2008).
  21. Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).
  22. Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest. Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).
  23. Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2. Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).
  24. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).
  25. Davis, C. A. Whole-mount immunohistochemistry. Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ZebrinII AldolaseCProteinase KDAB

מאמרים קשורים