ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Elena Ronander; Dominique C. Bengtsson; Louise Joergensen; Anja T. R. Jensen; David E. Arnot

doi:10.3791/4073

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט

14.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4073

⸱

7 באוקטובר 2012

Elena Ronander¹^,² , Dominique C. Bengtsson¹^,² , Louise Joergensen¹^,² , Anja T. R. Jensen¹^,² , David E. Arnot¹^,²^,³

¹Centre for Medical Parasitology, Department of International Health, Immunology & Microbiology, Faculty of Health Sciences, University of Copenhagen, ²Department of Infectious Diseases, Copenhagen University Hospital (Rigshospitalet), ³Institute of Infection and Immunology Research, School of Biology, University of Edinburgh

במאמר זה

סיכום

פלואורני באתר הכלאה (דגים) כדי לזהות תעתיקי mRNA בתאים בודדים מאפשרת ניתוח של פעילות polygenic כגון שעתוק סימולטני של חבר אחד או יותר של Var משפחת multigene ב Plasmodium falciparum אריתרוציטים נגועים¹. הטכניקה ניתנת להתאמה, וניתן להשתמש בסוגים שונים של גנים, תאים ואורגניזמים.

תקציר

הידבקות של אריתרוציטים Plasmodium falciparum הנגועים (IE) לקולטנים אנדותל אדם במהלך זיהומי מלריה מתווכת על ידי ביטוי של PfEMP1 גרסות חלבונים המקודדות על ידי גני var.

הפלואידים פ falciparum הגנום מטפח כ 60 גני var שונים אשר אחד בלבד כבר האמינו שעבד לכל תא בכל פעם בשלב הדם של הזיהום. איך רגולציה סותרת כזה של שעתוק הגנים var מושגת לא ברור, כפי שהוא זיהוי גני var בודדים או תת קבוצות של גנים הקשורים לvar קולטנים שונים והתוצאה של מחייב הפרש בתוצאה הקלינית של פ זיהומי falciparum. לאחרונה, הפרדיגמה שעתוק מוציאות כבר נקראה בספק על ידי מבחני שעתוק המבוססים על פ פרט זיהוי תמליל falciparum בinf אחתתאי האריתרוציטים ected באמצעות רנ"א ניאון כלאה באתר (FISH) ניתוח של שעתוק הגנים var ידי הטפיל בגרעינים בודדים של פ falciparum ^1-IE.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע המתודולוגיה RNA-FISH לניתוח של שעתוק הגנים var בגרעינים בודדים של פ falciparum נגוע אריתרוציטים אדם. השיטה מבוססת על השימוש בdigoxigenin וביוטין שכותרתו RNA באמצעות בדיקות antisense TSA פלוס מערכת פלואורסצנטי פלטת ² (פרקין אלמר), ניתוחים מיקרוסקופים ונבחר טריים פ falciparum IE. בשיטת כלאה באתר ניתן להשתמש כדי לפקח על שעתוק ורגולציה של מגוון רחב של גנים הביע בשלבים השונים של פ מחזור חי falciparum וניתן להתאמה למינים אחרים מלריה טפיל ואורגניזמים אחרים וסוגי תאים.

פרוטוקול

1. דור של אריתרוציטים הנגועים הנבחרים טרי

עבור assay זה, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות בעת שימוש בתרבויות שנבחרו זה עתה לביטוי פני PfEMP1 חלבון. בניסוי המסוים הזה 3D7 פ שושלת falciparum נבחרה באמצעות נוגדנים ספציפיים כמתואר ¹ בעבר.

יום 1

200 μl הקציר של תאי דם ארוז מפ falciparum התרבות המכילה 2-5% אקספלורר שלב מאוחר על ידי צנטריפוגה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר.
Re-להשעות גלולה בדם של 2 מ"ל 37 ° C 0.75% פתרון חם ג'לטין בצינור סטרילי 14 מ"ל, ולצאת לדקות 15-20 על 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר IE אינו הנגוע וטבעת שלבים למשקעים.
לקצור את IE בשלב מאוחר, כלומר את השלב העליון, לתוך צינור חדש מ"ל 14 ולשטוף פעמים עם 10 מ"ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה.
לדלל 50 μl של אנטי PfEMP הספציפי1 נוגדנים ב2 מ"ל של 37 ° C תקשורת RBC-לשטוף ולסנן סטריליים החמימה.
מערבב את IE השטוף בשלב מאוחר עם נסיובי עוקר בדילול המלא בצינור סטרילי 14 מ"ל ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
ספין למטה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר, ולשטוף פעמים עם 10 מ"ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה.
שטוף 50 μl של חלבון Dynabead השעיה פעמים עם תקשורת RBC-שטיפה באמצעות-15 DynaMaq מגנט.
Resuspend את Dynabeads ב300 תקשורת μl RBC-לשטוף ולהוסיף אותם לאקספלורר השטוף בשלב מאוחר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
העברת הצינור למגנט DynaMaq-15. השאר למשך 1-2 דקות ולהסיר את כל הנוזלים.
Resuspend את Dynabeads במיליליטר 4-5 המדיה RBC-שטיפה. העברת הצינור בחזרה אל המגנט ולהשאיר אותה במשך 1-2 דקות לפני ההסרה כל הנוזלים. חזור על שלב כביסת פעם אחת.
להעביר את החרוזים המכובסים לו 25 סנטימטרים ² סטרילי תרבותלאסק מכיל 200 תאי דם μl ארוז טרי אדומים. הוסף 5-6 מ"ל של Albumax תקשורת בתרבות. אחסן לילה בCO 5% ₂ ב 37 ° C.

יום 2

הסר את Dynabeads מהתרבות כאשר IE שנבחר פלישה חוזרת של תאי הדם האדומים הטריים על ידי העברה כל התרבות לצינור סטרילי 14 מ"ל. שים את הצינור אל-15 DynaMaq המגנט ולצאת ל1-2 דקות. לאחר מכן, שופך את כל הנוזל בחזרה לבקבוק התרבות.
תרבות לכמה שפחות מחזורים ככל האפשר עד parasitemia של 5-10% וטפילים הן בringstage.
אקספלורר צריך להיות מנותח על ידי FACS כדי לוודא שהפנוטיפ המשטח הנכון, ביטוי חלבון כלומר של או and/orPF11_0008 PFD1235w הושג ^1.

2. הכנת הבדיקות

בדיקות antisense RNA נוצרו מהאזורים המשתנים ביותר של PFD1235w וvar PF11_0008 </ Em> גנים מפ הדנ"א הגנומי 3D7 falciparum. דנ"א הוגבר באמצעות PCR ומשובט לתוך וקטור pSPT18 או 19 לשעתוק, בהתאמה לפי התיאור של היצרן (רוש). הבדיקות (580 זוגות בסיסים (bp) ו590 BP באורך) תויגו עם Digoxigenin (DIG) או ביוטין באמצעות DIG-RNA תיוג קיט או מיקס תיוג ביוטין רנ"א, בהתאמה. אנחנו אשרנו את הספציפיות של הבדיקות הן על ידי ניתוח כתם הצפון ועל ידי ניתוח יחיד, תווית דגי ^1.

3. למרוח דקים וקיבוע של טפילים לפני הכלאה באתר

יום 1

כל הצעדים נעשים בסביבת RNase-חופשיה וכל המגיבים הם RNase חינם או מראש טופל-עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) או RNase Zap (Invitrogen). את השקופיות וחוטרי כיסוי יש לנקות עם אלכוהול כדי להסיר שומן ייצור שיורית. חשוב לבצע את הפרוטוקול ללא כל הפסקה בין צעדיםעל מנת למזער את הסיכון לזיהום nuclease.

לעשות סרט דם דק בשיטת ההפצה הסטנדרטית ^3. באמצעות העדשה אובייקטיבי שמן 100x של המיקרוסקופ, לספור את IE ולחשב את האחוז של IE בתרבות. בדקו ששלבי הטפיל הם בתיאום מקורב, בטבעת והשלבים מוקדמים של trophozoite מחזור IE. אלה הם mRNA הגן var להביע מראש שכפול, שלבים חד nucleate, ומתאים למבחנים בודדים סלולריים דגי שעתוק מסוג זה.
העברה 50 μl של התרבות הטפילה, בparasitemia של 5-10%, לצינור 1.5 מ"ל RNase ללא אפנדורף. צנטריפוגה לדקות 1 ב2000 סל"ד בטמפרטורת חדר.
הסר את המדיה ולהוסיף pH 50 μl PBS 7.2 במי DEPC טופל. להתסיס את הצינור בעדינות. חזור על שלב שקיעת צנטריפוגלי פעמים כדי לשטוף את התאים חינם מתקשורת ופסולת תא.
לעשות ארבע מריחות דקות באיכות טובה. לכל כתם, כתם להפוך לאחד אל11 קוטר מ"מ אחד הטוב של 4 שקופיות טובות, ארבע שקופיות זכוכית כלומר בסך הכל, במכסת מנוע RNase חינם (שלב קריטי). גל מחליק לרגע באוויר לייבוש. הפוך שלוש שקופיות נוספות לשקופית שלילית בקרות אחד להכתמת בדיקה אחת לכל גן רלוונטי אחר באמצעות בדיקה ספציפית, שקופית אחרת לטיפול RNase ושקופית המכילה 3 אקספלורר לא מבטא את הגן של עניין. השאר את השקופיות לייבוש על הספסל במשך 10-20 דקות.
תקן את הסרטים הדקים על ידי הוספת 60 μl של פתרון קיבעון המכיל paraformaldehyde 4% וחומצה אצטית קרחונים 5% לבארות. השאר למשך 10 דקות על הספסל בטמפרטורת חדר.
שטוף את השקופיות ב2x SSPE חיץ למשך 5 דקות על ידי תסיסה עדינה בטמפרטורת חדר. בקצרה סילוק נוזלים עודפים על ידי נגיעה בבארות המכילות את התאים בעדינות במגבת נייר.
לכסות את השקופיות עם פפסין 0.01% ב0.01 M HCl עבור 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס (צעד מאוד קריטי). שטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
לדלל את תמיסת RNase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. לכסות על כתמי בקרה השליליות עם 60 μl של פתרון RNase. דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
פנה מייד לצעד ההכלאה.

4. כלאה של בדיקות RNA על שקופיות קבועות

יום 1

הכן קאמרי הכלאה, כגון ThermoStar 100 HC4 או תיבת קצה פיפטה ריקה לשים בתנור נקי, על ידי ריסוס עם RNase Zap ומנגב אותו נקי במגבת נייר. מלא את הערוצים של חדר ההכלאה או התחתון של התיבה עם מי DEPC טופל כדי לוודא שהשקופיות לא תתייבשנה במהלך הכלאה. סגור את החדר ומחמם עד 48 מעלות צלזיוס
לדלל את החקירות בפתרון ההכלאה לריכוז סופי של 12 ng / μl. לפגל פתרון החללית על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בבלוק חימום. מייד לצנן על קרח.
בקצרה אוויר תיבש את השקופיות אחרי כביסת SSPE 2x. מוציא בזהירות את הנוזל עודף סביב הבארות במגבת נייר.
פתח את תא ההכלאה ולמקם את השקופיות בבית הבליעה. תחול אחת או בשתי הבדיקות בהיקף כולל של 60 μl לטוב. זהירות לכסות טיפת הנוזל עם תלוש כיסוי RNase-חופשי באמצעות מלקחיים סטריליים.
סגור את התא ולהכליא את השקופיות ב48 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 שעות במשך הלילה.

5. נטיית נוגדן והגברת קרינה

יום 2

השלבים הבאים מבוססים על מערכת TSA פלוס פלטת קרינה מפרקין אלמר. כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר.

שטוף את השקופיות 3 פעמים בTNT חיץ למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
חסום את הבארות ב150 μl של חיץ TNB למשך 30 דקות.
לדלל את נוגדן HRP-מצומדות α-DIG במאגר TNB ביחס של 1:100 ונוגדן HRP-מצומדות α-ביוטין במאגר TNB, ביחס של 1:500. הסר את כל חיץ TNB עודף מהשקופיות עם ממחטת נייר. כאשר גילוי 2 תעתיקים בו זמנית, שני הנוגדנים יכולים ללכת מייד. למרוח כמות כוללת של 100 μl של פתרון נוגדן לTNB היטב ולכסות בזהירות עם פתק כיסוי. דגירת השקופיות עבור 2 שעות.
הסר את התלושים לכסות בזהירות. שטוף את השקופיות בTNT חיץ 3 פעמים למשך 5 דקות.
דלל את FITC-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500 ולהחיל 100 μl של פתרון לכל באר. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות.
הסר את המכסה מחליק בזהירות ולשטוף את השקופיות 3 פעמים למשך 5 דקות בחיץ TNT ידי תסיסה עדינה.
דלל את Cyan3-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500. הוסף לμl 100גם בפתרון זה. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות.
הסר את המכסה מחליק בזהירות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במהירות על ידי טבילה בחיץ TNT.
שטוף את השקופיות 3 פעמים עם חיץ TNT למשך 5 דקות.
לטבול את השקופיות במהירות במי DEPC טופל.
השאר את השקופיות לייבוש באוויר. הר את השקופיות עם ריאגנט אנטי לדעוך מכיל DAPI. לאטום את הפינות של תלושים לכסות עם לק.
את השקופיות מוכנות כעת למיקרוסקופיה. שמור את השקופיות מכוסות בנייר האלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס, אם הניסוי הוא להסתיים ביום למחרת. איטום מלא של הצדדים של השקופיות יכול להתבצע 24 שעות לאחר ההחלה מגיבה נגד הדהייה. זה יאפשר את השקופיות שצלמו עד שבוע לאחר הפרוטוקול הושלם.

6. ויזואליזציה של בדיקות הכלאה

הפעל מיקרוסקופ. מיקרוסקופ immunofluorescence סטנדרטי הוא sufficient לסוג זה של ניסוי, אבל אם יש לך גישה למיקרוסקופ confocal אתה יכול גם להשתמש בזה לתמונות 3D או כדי לקבל קטעי וידאו של התאים המוכתמים שלך. אפשר מיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-30 דקות. כבה את המחשב ואת התוכנה.
בדקו את איכות הצביעה במיקרוסקופ immunofluorescence. בחר מקום המכיל כמה טפילים.
התאם את הרווח של כל ליזר באופן ידני. התאם פיקסל להתעכב כדי 4-6 מ ^'-1 של ^-1 והצעדים ל512 x 512 פיקסלים.
קח תמונת בדיקה באמצעות המסגרת למבדה. להסתגל רווח הליזר.
קח מינימום של 20 תמונות טובות של תאים בודדים ניאון. לפחות 2-5 תמונות של שדה המכיל 5-20 טפילים נדרשות על מנת לקבל סקירה הוגנת של אחוז הטפילים חיוביים.