$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הלה התאים גוברת להפקת נשק גרעיני
- צלחת תאים הלה על שלוש צלחות 150 מ"מ עם DMEM התקשורת השלימו עם 10% ו 1% FBS פניצילין / סטרפטומיצין. לגדול ב 37 ° C חממה עם CO 2 עד 5% תאים הם confluent 90%.
טיפ, פיצול תאים 1:10 מהצלחת היבול confluent ו -3 ימים לאחר פיצול.
עצה, צלחת נוספת ניתן לגדל במקרה שאין מספיק תאים עם שלוש צלחות (לדוגמה, אם התאים הם פחות מ 90% confluent).
2. הכן וצננו פתרונות תמצית גרעיני
- להכין פתרונות טריים כמתואר בטבלה 2.
- Aliquot 10 מ"ל של מאגר hypotonic לתוך צינור פלקון 15 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל של מאגר מלח גבוהה 1 מ"ל של מאגר דלת מלח לתוך צינורות 1.5 מ"ל Eppendorf. לצנן את מאגרים על קרח. מוסיפים את כמויות מתאימות של PMSF ו DTT למאגר זה מיד לפני השימוש (ראה
3. איסוף תאים הלה להפקת גרעיני
- Aspirate מדיה מן התאים ולשטוף את התאים פעם אחת עם 13 מ"ל של בטמפרטורת החדר 1X PBS לכל צלחת.
- Aspirate לשטוף PBS.
עצה, לשאוב כמה שיותר PBS ככל האפשר על ידי aspirating 1, ולאחר מכן עומדת צלחת בצד שלה, מחכה כמה שניות, ו aspirating את השאר.
- באמצעות מרים התא, מגרדים תאים לקצה התחתון של הצלחות, ולאחר מכן להעביר את התאים צינור Eppendorf. להימנע בועות. 3 לוחות של תאים השרוטות צריך להתאים את צינור 1 1.5 Eppendorf מ"ל.
עצה, קל יותר להעריך את עוצמת הקול של תאים אם צינור Eppendorf משמש. על סולם, השתמש צינורות פלקון.
- סרכזת על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 5 דקות ב 100 XG כדי גלולה התאים.
4. יופי תאים הלה במאגר hypotonic
בזהירות לשאוב PBS מן התא גלולה ולהעריך את נפח תא ארוז (PCV) על ידי הסתכלות על הדרגתיות על הצינור. שלוש צלחות confluent של תאים הלה לוותר על 500 μl של PCV. הוסף פי 2 PCV מאגר hypotonic כדי גלולה התא. לוחצים בעדינות resuspend התאים. השתמש Pipetman P1000 בעדינות resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה אם יש צורך בכך. סרכזת על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 5 דקות ב 100 XG כדי גלולה התאים. * התאים יהיה החלו להתנפח בזמן הזה, לבין נפח התא צריך להיות עכשיו על μl μl-1000 750. בזהירות לשאוב מאגר hypotonic ולהוסיף מאגר hypotonic חדש בנפח סופי של 1.5 מ"ל. Resuspend התאים. דגירה התאים נפוחים resuspended על קרח למשך 10 דקות. 5. Lyse תאים באמצעות Homogenizer Dounce
- השתמש מאגר hypotonic לשטוף dounce ולאחר מכן לצנן אותו על קרח. נגב יבש העלי עם WIP משימה עדינהER (למשל Kimwipe). הסר חוצץ הנותר מן dounce באמצעות 1000 micropipette μl עצה המורחבת.
- העברת תאים נפוחות לתוך dounce. לאט לאט להזיז את העלי חזק של dounce למעלה ולמטה 5 פעמים כדי lyse התאים, להיות זהיר, כדי למנוע בועות.
- Assay עבור תמוגה התא באמצעות aliquot 5 μl של תאים dounce. מניחים את aliquot בצינור Eppendorf ומוסיפים נפח שווה של Trypan כחול. מכניסים את התערובת על שקף ולבדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור. גרעינים של תאים lysed יופיע כחול. כ -90% תמוגה הוא אידיאלי.
עצה, מספר הפעמים התאים יש dounced ישתנה בהתאם אטימות של dounce. בעת ביצוע בפרוטוקול זה בפעם הראשונה, לקבוע את מספר פעמים כדי dounce ידי ביצוע צעד 5.3 לאחר שבץ כל אחד עם dounce. לא יתר על המידה dounce, douncing מוגזמת תהרוס גרעינים.
- להעביר את התאים lysed כדי מראש Chilleד Eppendorf הצינור ספין 4 ° C microfuge 5 דקות ב 1500 x גרם. גלולה המכילה את הגרעינים. בזהירות להעביר supernatant לצינור חדש מבלי לשבש את הגרעינים. Supernatant מכיל את הציטופלסמה.
עצה, הציטופלסמה יכול לשמש הוא או עיבוד נוסף כדי S100 באמצעות ספין אותו במהירות גבוהה המשמש תמציות בתפזורת (ראה 1 להכנת S100 פעיל מ תמציות בתפזורת).
6. מלח חלץ את גרעיני
- לאמוד את היקף גרעיני ארוז (PNV) על ידי הסתכלות על הדרגתיות על הצינור. PCV של μl 500 בדרך כלל מניבה PNV של μl 400.
- הוסף ½ X PNV של מאגר מלח נמוכה כדי גרעינים ידי הוספת טיפ micropipette לחלק התחתון של הצינור ולאט לאט גמירה לתוך מאגר גרעיני תוך ערבוב בעדינות. לא pipet מעלה ומטה. קפיצי בעדינות את הצינורות על מנת לוודא כי היא גלולה resuspended לחלוטין לפני המשך הצפת דלת מלח.
- הוסף ½ X PNV של מאגר מלח גבוהה ובמהירות לערבב 1 זמן על ידי צינור היפוך. לא לרעוד. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
עצה לעתיד עדין עם גרעינים כאשר הם מאגר מלח גבוהה, כדי למנוע lysing אותם.
- ספין על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 15 דקות על 18,000 X גרם. Supernatant הוא תמצית מלח גבוהה גרעינית (HS-NE). שלוש צלחות של תאים בדרך כלל תשואה 500-600 μl של HS-NE.
7. להתרכז Dialyze תמצית גרעיני
- העברת 500 μl של HS-NE לתוך צונן מיני centricons (Amicon) ו - 50 דקות ספין על 4 מעלות צלזיוס microfuge על 14,000 X גרם. מרחב מיני centricon (Amicon) ולמקם אותו צינור Eppendorf חדש. ספין דקות 2 ב 4 ° C 1000 XG להתאושש HS-NE. HS-NE יהיה מרוכז כדי μl כ 115.
- שימוש Pipetman P200, להעביר 45 aliquots μl של HS-NE לתוך מיני דיאליזה Slide-A-Lyzers, ומניחים אותם 500 מ"ל של מאגר דיאליזה צונן. ודא התחתון של Slide-A-Lyzer מיושר עם החלק התחתון של מצוף. מערבבים במשך 1-2 שעות ב 4 ° C. NE יופיעו מעונן אחרי דיאליזה.
עצה, האם לא צנטריפוגות כדי להסיר משקע עכור הוא ציין כי לאחר דיאליזה, כמו צנטריפוגה זה מפחית את הפעילות של מיצוי.
- NE ניתן להשתמש מיד או aliquoted. Aliquots יש פלאש קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C. NE ניתן לאחסן לעבור לפחות שני מחזורי ההפשרה ההקפאה, מבלי לאבד את הפעילות.
8. נציג תוצאות
לאחרונה, יעילה במערכות חוץ גופית עבור צימוד שעתוק RNAP השני שחבור פותחו 2-5. מערכות אלו מועסקים תאים הלה גדל בכמויות גדולות ולכן הם לא מקובל במהירות לבחון את ההשפעות של טיפולים תאיים ספציפיים על דוגמאות רבות. על בסיס זה צריךND השירות הכללי של פרוטוקול בקנה מידה קטן תמצית (ראו דיון), הקמנו שיטה חזקה בקנה מידה קטן תמצית גרעיני. נציג נתונים המשווים II RNAP שעתוק / שחבור התגובה בתמצית בקנה מידה קטן גרעינית עם תמצית גרעיני בתפזורת מוצג באיור 2. CMV-DNA מבנה, המכיל מקדם CMV ו encodes המצע שחבור רגיל (FTZ 3, איור 2 א) שימש לניתוח. כאשר מבנה הודגר בכמויות גדולות (1-3 נתיבים) או בקנה מידה קטן (4-6 נתיבים) תמצית, רמות דומות של המתהווה מראש mRNA היו מסונתז על ידי נקודה 5 דקות זמן (איור 2, מסלולים 1 ו -4 ). בעקבות תוספת של α-amanitin לחסום שעתוק נוסף, את ביניים שחבור ומוצרים החתוכות שנצבר לאורך זמן עם קינטיקה דומה בשני סוגי תמציות (איור 2, נתיבי 2, 3, 5, 6). תוצאות אלו מייצגות מראים את היעילות של ההפיכה LED RNAP II שעתוק / שחבור מערכת דומה תמציות גרעיני בתפזורת ואת בקנה מידה קטן.
כדי להדגים את התועלת של השיטה בקנה מידה קטן תמצית, תמציות הוכנו מתאי הלה שטופלו במעכבי שחבור, E7107, או שליטה שלילית מתחם pladienolide F 6,7 ואז RNAP מצמידים II שעתוק / שחבור assay בוצע. כפי שניתן לראות באיור 3, שעתוק על ידי RNAP השנייה התרחשה ביעילות תמציות שהוכנו F הן Pladienolide ו E7107 תאים שטופלו (10 נקודות זמן דקות). לעומת זאת, שחבור התרחשו בדרך כלל תמצית מוכנה מ-F-שטופלו בתאים Pladienolide אך בוטל ב E7107 שטופלו בתאים (איור 3, 20-60 דקות נקודות זמן). נתונים אלה מספקים הוכחה של מושג על שימוש בקנה מידה קטן תמציות גרעיני לטיפול מיוחד של תאים בקנה מידה קטן.
jpg "/>
באיור 1. סכמטי של פרוטוקול בקנה מידה קטן חלץ. שלב P1. התאים גדלים כמו monolayers, קוצרים הצלחות באמצעות מרים תא נפוחות על ידי תוספת של מאגר hypotonic. שלב P2. תאים lysed באמצעות homogenizer Dounce ו centrifuged כדי גלולה גרעינים. שלב P3. גרעינים מופרדים בציטופלסמה ועוברים תעשיית מלח. שלב P4. תמצית גרעיני מרוכזת ו dialyzed. שלב P5. תוצאות מתקבלים המראים כי תמציות גרעיני תפקודית (ראה איור 2 מפורטת יותר).
איור 2. בקנה מידה קטן תמציות גרעיני הם חזקים ב assay RNAP מצמידים שעתוק / שחבור השנייה. א סכמטי של תבנית CMV-FTZ דנ"א המשמש מצמידים RNAP II שעתוק / שחבור. האמרגן CMV ואת הגדלים של אקסונים ו אינטרון מצוינים. ב השוואת מצמידים RNAPהשנייה שעתוק / שחבור assay שימוש או תמצית גרעיני בתפזורת או בקנה מידה קטן תמצית גרעיני. α-amanitin נוסף לאחר 5 דקות של שעתוק שחבור הורשה להופיע על 30 ו - 60 דקות. RNA הופק ו מופרדים על ג'ל 5% polyacrylamide denaturing ו זוהה על ידי phosphoimager. ביניים של שחבור ומוצרים מצוינים. אנדוגני U6 snRNA ו tRNA להציג בתמצית, וכי הם 32 P-שכותרתו במהלך הדגירה מצוינים. ר '3 לפרוטוקול מפורט על מערכת RNAP מצמידים שעתוק / שחבור השנייה.
איור 3. בקנה מידה קטן תמציות גרעיני שהוכנו מתאי הלה שטופלו במעכבי שחבור התרופה E7107 פגומים ב שחבור. תאים טופלו Pladienolide מיקרומטר 3 F או E7107 כמותיאר 6 ולאחר מכן להשתמש כדי להכין בקנה מידה קטן תמציות גרעיני. במהלך הזמן בוצע באמצעות assay אותו שעתוק / שחבור כמו באיור 2. ביניים של שחבור ומוצרים, ואת U6 snRNA ו tRNA מצוינים.