Heterotypic תלת ממדי במבחנה מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

סיכום

אנו מתארים שיטות לקביעה במבחנה מודלים תלת מימדיים heterotypic מרכיבים fibroblasts בשחלות והשחלות משטח רגיל או תאי אפיתל סרטן שחלות. אנו דנים בשימוש במודלים אלה ללמוד אינטראקציות stromal-האפיתל המתרחשים במהלך התפתחות סרטן שחלות.

תקציר

סרטן שחלות אפיתל (EOCs) הם הגורם המוביל למוות ממחלה ממארת גינקולוגית בחברות מערביות. למרות התקדמות בטיפול ניתוחי וטיפולי הכימותרפיה משופרים מבוססים-Platinum, חל שיפור קטן בשיעורי הישרדות EOC במשך יותר מארבעה העשורים ^1,2. בעוד בשלב I. גידולי בעלי סיכויי הישרדות 5-שנה> 85%, שיעורי הישרדות בשלב III / המחלה הרביעית הם <40%. לפיכך, השיעור הגבוה של תמותה לEOC ניתן היה להפחית באופן משמעותי אם גידולים התגלו בשלבים מוקדמים יותר, הניתנים לטיפול, עוד ^3-5. כיום, בסיס הגנטי וביולוגי המולקולרי של התפתחות מחלה בשלב מוקדם הוא הבין היטב. באופן ספציפי יותר, מעט מאוד ידוע על תפקידו של המיקרו במהלך חניכת גידול, אך גורמי סיכון ידועים לEOCs (למשל גיל וזוגיות) מצביעים על כך שmicroenvironment ממלא תפקיד מרכזי בהיווצרות המוקדמת של EOCs. לכן פתחו מודלים תלת ממדיים heterotypicשל שניהם שחלה הנורמלית ושל סרטן שחלות בשלבים מוקדם. לשחלה הנורמלית, אנחנו משטח שיתוף תרבותי נורמלי שחלות אפיתל (יפסיד) ופיברובלסטים נורמלים סטרומה (INOF) תאים, שהונצחו על ידי תמרת retrovrial של המקטע הקטליטית של holoenzyme telomerase האנושי (hTERT) כדי להאריך את תוחלת החיים של תאים אלה בתרבות. למודל בשלבים הראשונים של שינוי שחלות האפיתל תא, ביטוי יתר של אונקוגן CMYC בתאים יפסידו, שוב בשיתוף עם תאים בתרבית-INOF. מודלי heterotypic אלה שמשו כדי לחקור את ההשפעות של הזדקנות והזדקנות על השינוי והפלישה של תאי אפיתל. כאן אנו מתארים את הצעדים מתודולוגיים בפיתוח של אלה מודל תלת ממדי; מתודולוגיות אלה אינן ספציפיות להתפתחות של שחלה נורמלית ורקמות סרטן שחלות, ויכולות לשמש כדי לחקור סוגי רקמות אחרים שבו אינטראקציות תא סטרומה ואפיתל הן בסיסיות היבט של תחזוקת רקמות ודיפיתוח sease.

פרוטוקול

איור 1 מדגים סקירה של תהליך העבודה המתוארת להלן.

1. בידוד של Fibroblasts שחלות הרגילים והארכת תוחלת חיים במבחנה על ידי Overexpression של מקטע קטליטי של Holoenzyme hTERT

1. רקמות שחלה ניתן לאסוף בהסכמת מטופל מושכל ואישור של המועצה לביקורת המוסדית (עבור מוסדות בארה"ב). רקמות שחלה רגילות יכולות להיות שנאספו לאחר כריתת רחם כוללת בטן או כריתת רחם לפרוסקופית מוחלטת עם הבילטרלי salpingo-כריתה שחל. במחקר זה, רקמות נבדקו על ידי פתולוג, וחלק מstroma שחלות ביופסיה לתרבית תאים. דגימות רקמה של כ 2-5 מ"מ ² נקצרו מאזור המרכז של השחלה כדי לנסות להפחית את הסיכוי גם דגימת epithelia שחלות.
2. הובלת רקמת השחלה טריה למעבדת תרבית התאים בפיברובלסטים שחלות נורמלים הונצחו (לפיל) מדיום גידול, בתוספת אנטיביוטיקה וantimycotics נוספת. מדיום גידול INOF (INOF-GM) כולל: בינוני 199 וMCDB105 מעורבים ביחס 1:1, בתוספת סרום 15% שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 מיקרוגרם / המ"ל גנטמיצין ו250 ng / ml amphotericin B.
3. העבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית: הסר את כל תאי האפיתל שיישארו מחובר באופן רופף לרקמות, על ידי שטיפת המדגם עם 5 המ"ל PBS. לשאוב ולחזור פעמים נוספות.
4. להעביר את המדגם בתוספת PBS לתוך צלחת תרבות קוטר 10 סנטימטרים נקי (P100). השתמש במלקחיים סטריליות לטיפול ברקמה והמקום למנה שנייה, יבשה P100 נקיית תרבות. השתמש באזמל סטרילי לקצץ 0.5 סנטימטר ² חתיכות רקמות. הנח כל חתיכה של רקמה לP100 צלחת נפרדת ולחתוך לחתיכות נוספות <1 ² מ"מ בגודל. הוסף 20 מיליליטר INOF-GM (בתוספת אנטיביוטיקה וantimycotics), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לפקח על גדילת תא באמצעות מיקרוסקופ שלב. תאים ניתן לראות שמירה על שנינות הצלחת 24 שעתי ין.
5. Re-הזנה לאחר שבוע, הסרת כל רקמה שאינה חסידה של שאיפה. לאחר מכן, refeed תרבויות פעמים בשבוע. תאים ליצור מושבות, בדרך כלל בתוך 1-3 שבועות. ברגע המושבות הללו הן גדולות מספיק כדי שחבורה (רגע שהם מגיעים סביב 500 מיקרומטר), לבודד את השיבוטים באמצעות דיסקי שיבוט טריפסין מצופים.
   אשר תאים הם 100% fibroblastic וללא מזהמים סלולריים אחרים על ידי ציפוי מדגם של שורת תאים על גבי זכוכית וביצוע coverslips מכתים חיסוני פלורסנט סמן fibroblastic (FSP), סמן אפיתל (Pan-cytokeratin) וסמן תא האנדותל (פון Willenbrand הפקטור VIII).
6. מעבר שחלות פיברובלסטים תא נורמלי עיקרי (נוף) מבודד מP100 מנה אחת ל 3 מנות P100 לפני תמרת retroviral של hTERT יום אחד. מראש עשה-supernatants הנגיפי ניתן לרכוש, או מיוצר בבית תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לתאי HEK293T שיתוף transfecting-(ראהtarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
   supernatants retroviral ניתן להפיק באמצעות pBABE-hygro-hTERT הווקטור (Addgene). הסר NOFs מהחממה ואז לשאוב את מדיום תרבות התא. הוסף 3 מ"ל של supernatant ויראלי לכל מנה: צלחת אחת מקבלת hTERT-רטרווירוס, מנת ^nd 2 מקבלת GFP-רטרווירוס והמנה 3 מקבלת שום וירוס. כיסוי supernatants הנגיפי עם INOF-GM המכיל polybrene לתת ריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל. תאים מחדש להאכיל למחרת עם מדיום חדש. ימים לאחר הדבקה, מתחיל בחירה עם מינון נמוך (10 U / ml) hygromycin B. לאחר שבעה ימים ניתן להגדיל מינון זה עד 20 U / ml; בחירה צריכה להיות מלאה בתוך 10-14 ימים.
7. שיבוטים מבטאים hTERT או GFP יכולים להיות מבודדים על ידי שיבוט טבעת רגע שהם מגיעים סביב 500 מיקרומטר. שורות תאים דורשות אפיון נוסף כדי לאשר את הביטוי המוצלח של hTERT ושימור של תכונות קו תא ראשוניות. זה כרוך: (א)לאשר פעילות telomerase באמצעות PCR-ELISA ואורך הטלומרים, בדרום כתם או PCR ^6,7, (ב) המאשר את הביטוי של סמנים קריטיים (למשל immunostaining עם נוגדן אנטי הפאן cytokeratin לזהות תאי אפיתל, ועם אנטי נוגדן פיברובלסטים משטח חלבון לfibroblasts) דומה בין תאים ראשוניים וhTERT הונצחו-; (ג) המאשר את התאים לא מראה מאפיינים של הפיכת גידולים (למשל באמצעות מבחני צמיחה עצמאיים מעגנים): (ד) הארכת אישור של תוחלת חיים במבחנה נצפתה . תאים להביע hTERT אך לא GFP-להביע hTERT fibroblasts שחלות הנורמליות הנציח (INOFs) צריכים לעקוף הזדקנות replicative אך לא neoplastically להשתנות ובנוסף תאי INOF צריכים לשמור על הביטוי של חלבון משטח פיברובלסטים אך לא סמנים האפיתל כגון cytokeratin (איור 2) .

2. ציפוי של תרבות ורקמותמנות E עם PolyHEMA עבור תרבות תא ללא חסיד

1. כדי להכין את פתרון polyHEMA, לשקול את polyHEMA 1.5 גרם, ומקום לבקבוק סטרילי. הוסף אתנול 95 מיליליטר ביולוגיה מולקולרי כיתה מוחלטת ומי 5 מיליליטר תא תרבות כיתה מזוקק. הידרוג polyHEMA יתמוסס בתכולת המים של הפתרון, ואתנול לעקר את ההכנה.
2. הנח את פתרון polyHEMA בwaterbath על 65 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. זה עשוי להימשך עד לשעות 8. שים לב שפתרון polyHEMA לא ניתן לאחסן לפרקי זמן ארוכים ולכן תמיד צריך להיות מוכן טרי.
   פתרון בעיות: פתרונות של polyHEMA דורשים זמני דגירה ארוכים על 65 ° C. באופן קבוע להפוך את פתרון polyHEMA לערבב. הצמיגות נצפתה בחלק התחתון של בקבוק הזכוכית מציינת polyHEMA אינו מתמוסס באופן מלא ודגירה נוספת על 65 מעלות צלזיוס נדרשה.
3. עבודה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, מנות תרבות רקמות מעיילות עם פתרון polyHEMA. כל sizדואר של צלחת רקמת תרבות, בקבוק או צלחת multiwell יכול להיות מצופה עם polyHEMA. נפחים מומלצים של פתרון polyHEMA הנדרש לכל כלי מוצגים בטבלה 2.
4. אפשר מנות תרבות תאים לייבוש בתוך מכסה מנוע הזרימה למינרית. פעולה זו עשויה להימשך 2-3 ימים. נדנדה עדינה על פלטפורמת נדנדה יכולה לשמש כדי להבטיח אפילו ציפוי של מנות גדולות יותר בגודל או צלוחיות. אם מתייבש פתרון polyHEMA מהר מדי את פני השטח לא יכולים להיות חלק. כדי להימנע מכך, להבטיח את המכסה של המנה / בקבוק נשאר על אורך תהליך הייבוש.
5. מרח שכבה שנייה של polyHEMA ולאפשר לו להתייבש כמתואר לעיל.
   פתרון בעיות: חורים בציפוי polyHEMA יכולים להתרחש, במיוחד כאשר צלחות להתייבש מהר מדי. פעמי ציפוי הצלחות עם polyHEMA מסייעות לכיסוי פערים או סדקים בציפוי מכוסה לפני השימוש. צלחות בדרך כלל לוקחות 2-3 ימים לכל מעייל polyHEMA להתייבש ולכן צריך להיות מוכנות לפחות שבוע לפני שהם יהיו הצורך בתרבית תאים.
6. צלחות PolyHEMA מצופות ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר עד שימוש.

הערה: פתרוני 1% agarose, מומסים ב1X PBS וautoclaved לעקר, יכולים לשמש גם למאכלים סלולארי תרבות מעייל כדי ליצור משטח שאינו חסיד לculturing 3D לטווח קצר (פחות משבוע). ציפוי agarose של צלחות רבות גם יוצר משטח קעור שמקדם את היווצרות אליפטית יחידה לכל גם לשורות תאים רבות. עם זאת, לתרבויות 3D כבר ציפוי polyHEMA מומלץ כagarose ציפוי לעתים מתפורר לאחר תקופות ארוכות יותר תרבות.

3. תלת ממדי (3D) שהניב spheroids heterotypic מחדש האכלה של תרבויות 3D

1. שחזר ולהרחיב תרביות תאי אפיתל INOF ובמבחנה כדי להכין מספיק תאים להקמת שספרואידים heterotypic 3D. ל" תרבויות המוניות "אנחנו בדרך כלל זרעים 2-4x10 ⁶ INOFs לP100 מנה ו0.5-1x10 ⁶ תאי אפיתל לתת סטרומה: ra אפיתלTio של 4:01. תאים גדלים בINOF בינוני INOF צמיחה (INOF-GM) ללא גנטמיצין או amphotericin ב 'אם תרצו, ניתן pretreated תאי פיברובלסטים לפני תרבות 3D (למשל לזירוז הזדקנות, תאים יכולים להיות מטופלים עם מינונים תת קטלניים של מי חמצן ).
2. לשטוף צלחת polyHEMA יבשה עם 5 מ"ל בופר פוספט המלוח (PBS) למשך 5 דקות. לשאוב PBS ולהחליף עם 15 המ"ל INOF-GM.
3. בינתיים, trypsinize הונצח תאי פיברובלסטים שחלות רגילים לנתק אותם ממנת התרבות, אחרי 3-5 דקות לנטרל את טריפסין עם נפח שווה של התרבות ותקשורת גלולת תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 450 למשך 5 דקות.
4. השלך את supernatant. צור השעית תא בודד על ידי resuspending התא גלול ב 5 המ"ל INOF-GM, ומערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing בעדינות. קביעת ריכוז תא על ידי ערבוב השעית 10 μl תא ו10 μl trypan כחול וספירה באמצעות hemocytometer. הדרה הכחולה Trypan ניתן להשתמשד לזהות תאים חיים.
5. הוסף ⁶ תאי INOF 4x10 למדיום כבר חלק לצלחת polyHEMA המצופית. הפוך את וליום תרבות התקשורת עד 20 מ"ל באמצעות נפח מתאים של טרי INOF-GM ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. תאים מתחילים לצבור לשספרואידים תאיים בתוך 24 שעות. היווצרות אליפטית יכולה להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ שלב.
   ספירה מדויקת של מספרי אליפטית בתנאי תרבות המונים היא קשה, אבל אנחנו מעריכים שנקבל 50-100 שספרואידים כאשר ⁶ תאי 4x10 סטרומה מצופים. גדלי אליפטית בדרך כלל נעים 80-250 מיקרומטר.
6. מחדש להאכיל את תרבויות אליפטית כל 2-3 ימים על ידי הצבת הצלחות בזווית בפיפטה הממוקמת בתוך מכסה מנוע הזרימה למינרית. אפשר הספרואידים להתיישב. זה עשוי להימשך עד 20 דקות. מוציא בזהירות את התקשורת המותשת עם 5 מ"ל פיפטה, עד שרק כ 4 מ"ל יישאר בצלחת. הקפד לא לשאוב הספרואידים. Re-הזנה עם 16 מ"ל הטרי INOה-F-GM ולחזור לחממה.
7. ביום 7, להוסיף תאי האפיתל לשספרואידים פיברובלסטים ליצור תרבויות heterotypic כדלקמן. הכן השעיות של תאי אפיתל שחלות (phenotypically רגיל או שינה) על ידי trypsinization כפי שתואר בסעיף 3.4-3.5. קביעת ריכוז תאים באמצעות hemocytometer. לשטוף פעם בINOF-GM כדי למנוע מגורמי גדילה המתבצע מעל מן תקשורת צמיחת אפיתל.
   במעבדה שלנו, משטח שחלות נורמלי שורות תאי אפיתל (OSEC) נאספו בהסכמת מטופל מושכלת משחלות הוסרו על ידי כריתת רחם כוללת בטן או כריתת רחם לפרוסקופית מוחלטת עם הבילטרלי salpingo-כריתה שחל. שחלות היו מוברשות עם cytobrush סטרילי כדי לאסוף את האפיתל. שורות תאים ראשוניות הוקמו וtransduced עם hTERT שימוש בגישה שתוארה לעיל. פרטים של תרבות OSEC ב 2D, 3D והנצחת OSEC ניתן למצוא בהפניות 10 ו 11.
8. כדי ליצור SPH heterotypiceroids, תרבויות מחדש הזנה הראשונה של שספרואידים פיברובלסטים בלבד. אז לחסן תרבויות פיברובלסטים אליפטית עם 1x10 ⁶ תאי אפיתל ביחס 04:01 פיברובלסטים לתאי אפיתל. תרבות הספרואידים heterotypic בINOF-GM.
9. Re-להאכיל תרבויות heterotypic כל 2-3 ימים ל14 ימים נוספים.

4. עיבוד להדמיה וניתוח מולקולרי

1. טכניקות שונות יכולות לשמש כדי לנתח הספרואידים heterotypic. עבור הדמיה, מומלץ ששספרואידים נקצרים ממנת התרבות עם פיפטה 25 מ"ל. Pipetting לאט יהיה למזער את הסיכויים של כוחות גזירה לפגוע בארכיטקטורה של אליפטית. Spheroids אז ניתן לכבס בPBS וpelleted ידי עדינות צנטריפוגה XG ב 100 למשך 10 דקות; כוחות צנטריפוגליים גבוהה עלולים לפגוע הספרואידים. לחלופין, תרבויות ניתן להעביר צינור 50 מ"ל בז והרשו להם להתיישב, ואז מדיום הגידול הוסר.
   1. לimmunohistoכימיה, שספרואידים לתקן עם ניטראלי שנאגרו פורמלין למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. גלולת הספרואידים ולהחליף את הפורמלין עם אתנול 70%. תהליך לפרפין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים לרקמות אנושיות. שספרואידים פרפין מוטבע-יכולים להיות נותחו, ומוכתמים עם או hematoxylin וeosin או סמנים מולקולריים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה הסטנדרטית (איור 3).
   2. לחלופין, שספרואידים נשטפו בPBS ניתן לתקן בparaformaldehyde 4% (שהוכן ב PBS), מוטבעים בטמפרטורה בינונית אופטימליים חיתוך אוקטובר והצמד הוקפא לחתך קפוא וכתמי immunofluorescent.
2. לניתוחים מולקולריים, הספרואידים ניתן לקצור, pelleted ושטפו פעמים ב PBS לפני lysing תאים לDNA, RNA או מיצוי חלבון.
3. לניתוח על ידי cytometry זרימה, שספרואידים ניתן לכבס בPBS וניתק על ידי טריפסין או עיכול accutase ב 37 ° C. כדי לעשות זאת, להטביע את צינור פלקון המכיל שספרואידיםנה waterbath כדי להקל trypsinization. ניתוק מוחלט של שספרואידים לתוך השעית תא בודדה יכול להיות מקודם על ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה עם טיפ 1 מיליליטר פיפטה. היזהר שלא מעל trypsinize התאים.

לנטרל את התגובה עם נפח שווה של מדיום התרבות ולהסיר גושי תאים על ידי העברת ההשעיה דרך מסננת תא מיקרומטר 40-70. תאים גלולים, לשטוף עם PBS, ולמנות resuspend את המספר הרצוי של תאים בחיץ FACS. כתם תאים בהתאם להוראות יצרן.

5. נציג תוצאות

גישה זו יכולה לשמש למגוון רחב של יישומים, ולחקר ביולוגית שחלות נורמלית, כמו גם הלימוד של חניכת סרטן שחלות. יתרון עיקרי של גישה זו על פני תרבויות 3D שנוצרו באמצעות ג'ל מטריקס זמין מסחרי הוא כי fibroblasts השחלות הנורמלים לייצר מטריצה ​​שעושה את up הליבה של הספרואידים. מניסיוננו, מטריקס חומר מיוצר על ידי fibroblasts שחלות הנורמלים הוא הטרוגנית ודומה יותר למטריצה ​​של שחלה מכל ג'ל מטריצה ​​הזמינה מסחרי. במעבדה שלנו יש לנו מנוצלים תאי האפיתל שכבר הפכו באופן חלקי במבחנה באמצעות אלמנטים מוגדרים גנטיים (ביטוי יתר CMYC למשל) ושיתוף בתרבית תאים אלה עם fibroblasts שחלות נורמליות ומזדקן לחקות סרטן שחלות בשלב מוקדם בשחלה בגיל ההבלות. הנתונים שלנו מראים שmicroenvironment ההזדקנות מקדם תכונות neoplastic (ריבוי למשל) של תאי האפיתל שינו באופן חלקי (איור 3), ואילו microenvironment נורמלי מעכב התקדמות נאופלסטית ^8. המעבדה ואחרים אף נקט גישות דומות למודל תאים נורמלים שחלות אפיתל ^9, תאי אפיתל חצוצרה, מודלי צעד חכם של התקדמות נאופלסטית ^11-13 כתרבויות אליפטית homotypic. אנו צפינו כי תכונות היסטולוגית של תאים נורמלים וממאירים שלא ניתן לגילוי בעת שהתאים בתרבית כmonolayers משוחזרות כאשר תאי מעבר לתרבות אליפטית. לדוגמה, תכונות היסטולוגית של סרטן שחלות תא ברור ניתן להבחין בתרבויות 3D של קווים ברורים של תאים סרטניים בשחלות תא (איור 4), אך לא בתרבויות monolayer של אותם תאים. יתר על כן, תאים בתרבית 3D יותר מקרוב משקפים ביטוי הרקמות הספציפי החלבון ראה ברקמות עיקריות בהשוואה לאותם תאים בתרבית בתרבויות monolayer 2D מסורתיות ^9-11. גישות אלה לדוגמנות רגילה ורקמות ממאירות בשחלות מייצגות גם כלים רבים ערך לגילוי והניתוח פונקציונלי של גני רומן מועמד שחלות סרטן גידול מדכאים ואונקוגנים וסמנים ביולוגיים מולקולריים אחרים שעשויים להיות קשור לדיפיתוח sease ^10,14.

איור 1. הסקירה סכמטי של הפרוטוקול עבור culturing heterotypic 3D. צלוחיות תרבית רקמה הם מצופים פעמים עם 1% פתרון polyHEMA ולהתייבש. פלסטיק מצופה PolyHEMA נשטפים עם 1x PBS לפני מייד לשימוש. תאים נורמלים הנציחו שחלות פיברובלסטים ⁽⁶ תאי 4x10) מצופים לתוך הבקבוק עם מדיום גידול מ"ל 20. היווצרות והצמיחה אליפטית במעקב למשך 7 ימים. בשלב זה, תרבויות אליפטית פיברובלסטים מחוסנות עם 1x10 ⁶ תאי אפיתל, ושני סוגי התאים הם שיתוף תרבית-במשך 14 ימים לפני הספרואידים התאיים נקצרים ומעובד עבור יישומים במורד זרם (ניתוחים מולקולריים, הדמיה, וכו ').

איור 2. מכתים immunofluorescence של hTERT </ Em> הנציח fibroblasts שחלות נורמליות. שני fibroblasts השחלות הנורמלים הראשוני (Pr NOFs) והנציח fibroblasts שחלות הנורמלים (INOFs) חלבון מפורש פיברובלסטים ספציפיים (FSP), אינו מבטא cytokeratin-7 (CK-7) והמפורש vimentin (VIM) . סמנים של עניין מוצגים בירוק, DNA הוא מוכתם בDAPI ומוצג בכחול, הציטופלסמה counterstained עם הכחול ומוצג באדום של האוון.

איור 3. אימונוהיסטוכימיה של תאי סטרומה ואפיתל שיתוף תרבית. פנל שמאלי, monoculture אליפטית פיברובלסטים שחלות הנורמלים, מוכתם על ידי hematoxylin וeosin. תאי פיברובלסטים נורמלים תרבית השחלות לבד בשספרואידים טופס 3D המורכב של תאים בעלי מורפולוגיה המוארכת ומטריקס בשפע. זכות פנל: fibroblasts שחלות הרגילות נחשפו למי חמצן לגרום להזדקנות. תאי אפיתל שחלות שינו באופן חלקי (תפסיד ^cmyc יפסידו שיתוף תרבותיים באופן משמעותי יותר מאותם תאים לפני אינדוקצית הזדקנות (לפני מזדקן, PSN). תאים יפסידו הורים ללא ביטוי יתר CMYC להראות שום הבדל בהתפשטות כאשר משותף עם תרבית פיברובלסטים סן PSN או. נתונים אלה מראים כיבמודל שלנו במבחנת שיתוף תרבות, תהליכי הזדקנות בstroma ההשחלות עשויים לקדם את הפיתוח של ¹¹ גלולות. * P ≤ 0.05, שני זנב לזווג T-Test.

איור 4. תכונות היסטולוגית של תאים בתרבית 3D משקפות רקמות ראשוניות. () קרצינומות שחלות תא ברורות להציג מבנים אופייניים תא ברורים, אלה נעדרים כאשר קווי EOC תא ברורים גדלים על מבני פלסטיק אך דומים מתגלים כאשר אותם תאים גדלים כשספרואידים 3D ( ב). (ג) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של תאי אפיתל שחלות נורמלים שגודלו כשספרואידים במשך 14 ימים. microvilli Surface גלוי (חיצים). (ד) שספרואידים נסיובי שחלות תאי סרטן הקו, בתרבות. (A, B) ומכתים Hematoxylin eosin של פרפין נותח מוטבע רקמת גידול או שספרואידים 3D; (C) מיקרוסקופיית אלקטרונים; (ד ') שלב מיקרוסקופיה ניגוד. Spheroids יכול להיות כדורי (העיגול מקווקו)או לא סדיר בצורה, כמו במקרה של המבנה נראה בצד השמאלי של התמונה.

מנה / גודל פלייט	נפח PolyHEMA (שיחול פעמים)	נפח סופי תרבות מדיה
צלחת 6-טובה	3 מ"ל	מ"ל 5-7
צלחת 12-היטב	1.5 מ"ל	2 מ"ל
צלחת 24 היטב	500 μl	1.5 מ"ל
צלחת 48-היטב	250 μl	500 μl
צלחת 96-היטב	50 μl	200 μl
מנת התרבות P100	4-5 מ"ל	20 מ"ל
מנת התרבות P60	2-3 מ"ל	מ"ל 5-7
F25 בקבוק	2-3 מ"ל	7 מ"ל
F75 בקבוק	4-5 מ"ל	20-30 מ"ל
F175 בקבוק	15 מ"ל	30-50 מ"ל

טבלה 2. מומלץ כרכים עבור ציפוי polyHEMA וculturing 3D.

דיון

הביולוגיה של סרטן השחלות האפיתל בשלב מוקדם (EOC) הוא הבין היטב. אולי אחד המכשולים העיקריים בתחום זה במשך שנים רבות היה חוסר הבנה של מקורות הרקמות הספציפיים של המחלה, ושל המשמעות של תפקיד microenvironment בפיתוח EOC. במהלך השנים האחרונות, הוא הפך להיות ברור כי EOC הוא מחלה הטרוגנית עם תת מרובים מובחן histophathological, כנראה עם מקור תאי שונה עבור תת סוגים שונים. לדוגמה, הנתונים הנוכחיים מצביעים על כך שEOCs הרירי בדרגה גבוהה עשויה לנבוע משני תאי שחלת צינור הפרשת האפיתל ותאי אפיתל מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב	ספק	מספר קטלוגים
PolyHEMA, מתאים לתרבית תאים	סיגמה אולדריץ	P3932
אתנול כיתת ביולוגיה מולקולרי	סיגמה אולדריץ	E7023
מים סטריליים לתרבית תאים	VWR	12001-356
MCDB105	סיגמה אולדריץ	M6395
בינוני 199	סיגמה אולדריץ	M2154
סרום שור עוברי Hyclone	Thermo Scientific	SH30088.03
גנטמיצין	סיגמה אולדריץ	G1397
Amphotericin B	סיגמה אולדריץ	A2942
pBABE-hygro-hTERT	Addgene	1773
PBS	VWR	12001-766
0.25% טריפסין-EDTA	Invitrogen	25200-072
תא מסננת (40 או 70 מיקרומטר)	VWR	21008-949 21008-952
נוגדן אנטי פיברובלסטים פני חלבון, השיבוט 1B10	סיגמא	F4771
נוגדן אנטי הפאן cytokeratin (C11)	סנט קרוז	SC-8018
Polybrene (hexadimethrine רומיד)	סיגמא	107689
TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS	רוש	12013789001
TeloTAGGG Assay אורך הטלומרים	רוש	12209136001