הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

סיכום

השתלת מח עצם מספקת דרך לשנות את הגנוטיפ של תאים שמקורם במח עצם. אם הגן של העניין בא לידי ביטוי בשני תאי מח עצם ותאים שמקורם במח שאינם נגזרים עצם, השתלת מח עצם יכולה לשנות את התאים שמקורם במח עצם לגנוטיפ שונה מבלי לשנות את גנוטיפ התאים לא נובע מח העצם.

תקציר

כדי להבין את תפקידו של גן בהתפתחות הדלקת במעי גס, השווה את התגובות של עכברי סוג פראי ועכברי נוקאאוט החסרים הגנטית של ריבית לקוליטיס. אם הגנים של האינטרס מתבטא בשני תאי מח עצם ותאי שמקורם נובעים מח עצם שאינם של המארח, עם זאת, ניתן להבחין את התפקיד של גן של עניין בתאי מח עצם ומקורם במח עצם שאינו תאים שהופקו על ידי טכניקת השתלת מח עצם. כדי לשנות את הגנוטיפ מח העצם נגזר תאים של עכברים, מח העצם המקורי של עכברי נמען נהרסו על ידי הקרנה ולאחר מכן הוחלף על ידי מח עצם מתורם החדש של גנוטיפ השונה. כאשר מח עצם פראי מסוג עכברי תורם הושתל בעכברי נוקאאוט, אנו יכולים לייצר עכברי נוקאאוט עם ביטוי גנים פראי מסוג תאים שמקורם במח עצם. לחלופין, כאשר מח עצם מתורם עכברי נוקאאוט הושתל בעכברי נמען סוג פראי, עכברי סוג פראי ללא גנים של האינטרס להביעממח עצם תאים שמקורם יוצרו. עם זאת, השתלת מח עצם לא יכולה להיות 100%. לכן, אנו מנוצלים מקבץ של בידול מולקולות (CD) (CD45.1 וCD45.2) כסמנים של תאי תורם ומקבל כדי לעקוב אחר שיעור תאי מח עצם מתורם נגזרים בעכברי נמען והצלחה של השתלת מח עצם. עכברי סוג פראי עם CD45.1 עכברי גנוטיפ ונוקאאוט עם גנוטיפ CD45.2 היו בשימוש. לאחר ההקרנה של עכברי נמען, את תאי מח העצם של תורם גנוטיפים שונים שהחדירו לתוך עכברי הנמען. כאשר מח העצם החדש מחדש להשתלט על חסינותה, העכברים היו לערער על ידי סוכן כימי (נתרן גופרתי dextran, DSS 5%) כדי לגרום לדלקת מעי גס. הנה גם אנחנו הראינו את השיטה כדי לגרום לדלקת המעי גס בעכברים ולהעריך את תפקידו של הגן של עניין הביע מתאי שמקורם של מח עצם. אם הגנים של האינטרס מהתאים שמקורם העצם ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות המחלה (כגון coliTIS), הפנוטיפ של עכברי נמען עם השתלת מח עצם ניתן לשנות באופן משמעותי. בתום ניסויי קוליטיס, מח העצם נגזר תאי דם ובמח עצם תויגו עם נוגדנים נגד CD45.1 וCD45.2 והיחס הכמותי שלהם לקיום יכול לשמש כדי להעריך את ההצלחה של השתלת מח עצם על ידי cytometry זרימה. השתלת מח עצם מוצלחת צריכה להראות רוב מכריע של גנוטיפ תורם (בטווח של מולקולת סמן תקליטור) על הגנוטיפ נמען הוא במח העצם והדם של עכברי נמען.

פרוטוקול

1. לפני שאתה מתחיל, שיקולים טכניים

1. אנו ממליצים להשתמש בשני עכברי C57/BL6 סוג פראי ועכברי נוקאאוט לניסוי כי עכברים עם מולקולות CD מתאימות ניתן לרכוש מיצרני העכברים גדולים.
2. מכיוון שקשה לעקוב אחר עכברי הסוג פראי ועכברי נוקאאוט ליטול תאים תורמים לאחר השתלת מח עצם, יש צורך להשתמש CD45.1 עכברים לייצג עכברי סוג פראי. (CD45.1 מניית C57/SJL WT עכברי ג'קסון מעבדות # 002014).
3. רוב מושבות עכבר הן CD45.2. עכברי נוקאאוט שייכים לCD45.2 גנוטיפ (CD45.2 מקור WT עכברים לחלופין: ג'קסון מעבדות מנייה # 000664). קביעת גנוטיפ CD45.1 או CD45.2 יכולה להתבצע באמצעות cytometry זרימה של מח עצם ודם היקפי כאמור בסעיף 7 בפרוטוקול זה.
4. עכברים לאחר ההקרנה התפשרו חסינות. שמור עכברים במתקן חופשי הפתוגן.
5. מבצע של irradiator דורש אבטחה המיוחדת clearancדואר והכשרה. כדי לחסוך זמן בתהליכי הכשרה ואישור, עדיף לשתף פעולה עם מעבדה עם טכנאי מוסמך שמסוגל לפעול irradiator.
6. מוסדות רבים יש מעבדות cytometry זרימה עם טכנאים מנוסים. כדי למזער את בעיות עם ניתוח cytometry זרימה, עדיף לדון בתכנית ניסוי cytometry הזרימה שלך עם הטכנאי המנוסה לפני שאתם מתחילים.
7. עכברים חולקו באופן זה (10 עכברים בכל קבוצה):

קבוצה		תורם מח עצם לנמען	טיפול
	BM חילופים	CD45.1 WT לCD45.2 KO	DSS קוליטיס
B			שליטת מים רגילה
ג	BM חילופים	CD45.2 KO לCD45.1 WT	DSS קוליטיס
D			שליטת מים רגילה
E	התחזות	CD45.1 WT לCD45.1 WT	DSS קוליטיס
F			שליטת מים רגילה
סול	התחזות	CD45.2 KO לCD45.2 KO	DSS קוליטיס
H			שליטת מים רגילה

* המחשה קצרה של פרוטוקול ניסוי, מוצגת באיור 1.

2. הקרנת עכברי נמען

1. עכברים הם התרבו והמשיכו במתקן לפתוגן חופשי. עכברים שמים בעוגת הקרנת autoclaved עם מסנן. הנח את עכבר אחד בכל חריץ של עוגת הקרנה. הנח את העוגה לirradiator ולוודא פטיפון והעוגה פונים.
2. הפעל את משאבת האווירלאוורור. סגור את דלת irradiator ולנעול אותו.
3. להקרין את העכברים עם 1000 ראד (שהוא שווה ערך ל 10 Gy) סביב 10 דקות (תלוי במקור קרינה וזמן מחצית חיים). מנקודת זמן זו, עכברים המוקרנים הם חיסוני נפגעים, והיו לו חסינות חלשה נגד זיהום. לאחר הקרנה, לקחת את העוגה ומניח במכל סטרילי לתחבורה לבטיחות ביולוגית קבינט במתקן בעלי חיים. הימנע מחשיפת העכברים לסביבה חיצונית כדי למזער את הסיכוי לזיהום.
4. בbiosafety הממשלה, להעביר את העכברים בכלובי עכברי autoclaved עם מצעי autoclaved (4 עכברים לכלוב הוסיפו מים סטריליים חדשים עם השעית sulfatrim -. 3.12 מ"ל למיליליטר מים 100).
5. לעטוף את בקבוק המים עם רדיד אלומיניום כאנטיביוטיקה היא רגישה לאור. Shake לערבב את בקבוק פתרון sulfatrim גם לפני טעינתו לכלוב.

3. חילוץ תורם מח עצם

1. להקריב את עכברים עם דו תחמוצת הפחמן או isoflurאהה ואז לטבול בתמיסה 1:200 לנזול. לרסס את העכברים עם אתנול 70% כדי להרטיב את העור ועצמות לנתח פתוחות.
2. משרה את מכשירי הנתיחה באתנול 70% לעיקור.
3. לבצע נתיחה בארון בטיחות ביולוגי. ישתמש בכלים סטריליים הנתיחה לחשוף את עצם הזרוע, עצם הירך, השוקה ועצמות שוקית, חופשי מצירוף שרירים ורצועות.
4. חתך פתוח בשני הקצוות של עצמות להראות מח העצם האדום. החזק את עצמותיו במלקחיים. שטוף את מח העצם האדום עם PBS הקר עם מזרק 3 מ"ל ומחטי 25G לצלחת פטרי. לשטוף משני קצות עצמות להניב תאי מח עצם יותר.
5. השתמש 6 מיליליטר מזרקים ו18G1 / 2 מחטים לשבור תקעי מח עצם אדומים בשאיפה ופליטה חוזרות ונשנים. העברת מח עצם עם 50 צינורות מ"ל פלקון.
6. ספין מח העצם למטה ב1800 סל"ד למשך 5 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant, resuspend גלולה ידי vortexing לשניות 5-10.
7. דלל חיץ תמוגה RBC 10X עם מים סטריליים. מודעהד 1X RBC תמוגה החיץ (5 מ"ל לעכבר תורם), מערבולת שוב למשך 5 שניות ולהמשיך בדיוק 3 דקות בטמפרטורת חדר.
8. לאחר 3 דקות, למלא את הצינורות עם 20 המ"ל PBS הקר כדי לעצור את תמוגה ומערבבת. יוצק את התוכן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר ישירות לתוך צינור חדש 50 מ"ל פלקון.
9. יש לשטוף את הצינורות המקוריים עם 5 מ"ל של PBS ויעביר למסננת תא גם כן. למעלה עד 50 מ"ל עם PBS ומערבב.

4. ספירת תאי תורם מח עצם

1. הוסף 100 μl של Trypan כחול לצינור אפנדורף ו100 μl של השעית מח עצם לצינור ותמהיל אפנדורף. פיפטה את תערובת התא המוכתמת לhemocytometer.
2. כמות התאים מחושבת על ידי ספירה כוללת חי מח עצם תא בצינורות פלקון = מספר תא כתם ב16 ריבועים x 2 (בשל דילול הכחול Trypan) x 10000 x 50 מ"ל
3. ספין למטה תאי מח העצם ב50 צינורות מ"ל פלקון ב2000 סל"ד למשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. הסר את supernatant. מבוססעל ספירת התאים כלל, resuspend הגלולה עם PBS ל1 x 10 ⁸ תאים למ"ל

5. עירוי לעכברי נמען

1. לחמם את עכברי הנמען בפנקס חום ותחת מנורת חימום. לשים את עכברי נמען בעוצר. להזריק 1 x 10 ⁷ תאים לכל עכבר ב100-200 μl דרך וריד.
2. הזרקה של מח עצם מתורם יש לעשות בין 4-24 שעות לאחר הקרנה.
3. שמור עד 4 עכברים שהוזרקו לכלוב. לשמור על עכברי הנמען הזריקו בכלובי autoclaved במי אנטיביוטיקת מטופלים-במשך 4 השבועות הראשונים במתקן בעלי חיים חופשי הפתוגן ולאפשר לעכברים להחזיר חסינות. כלובים לשנות את מים, שטופל באנטיביוטיקה ואוכל כל 4 ימים כדי לשמור על היגיינה.

6. אינדוקציה של קוליטיס והערכה של קוליטיס

1. 4 שבועות לאחר השתלת מח עצם וקרינה, לעבור למים רגילים ללא אנטיביוטיקה ולשמור על עכברים עבור 2 שבועות נוספים כדי להחזיר אותם רגיליםבטן מיקרופלורה.
2. 6 שבועות לאחר הזרקת מח עצם, למדוד משקל גוף ראשוני. יש עכברים מקבלים 5% סולפט dextran בשתיית מים כרצונך כדי לגרום לדלקת מעי גס. יש עכברים מקבלים מי שתייה רגילה רק כקבוצת ביקורת נורמלית.
3. כעבור 5 ימים, לסגת דם היקפי, להעביר לצינורות מצופים הפרין (Vacutainer) ולשמור על קרח. ברכת הדם מגיל 4 עכברים לצינור 1. שלב 300 μl דם עם 300 μl של חיץ מכתים תא = 600 μl. לחלק את הדם ל5 צינורות Eppendorf, כל אחד עם 100 μl.
4. להקריב את העכברים עם דו תחמוצת הפחמן או isoflurane. הערכת ציוני ניזקים מקרוסקופיים (נא עיין בפרסום אחר יופיטר וידאו לפרטי ^1). למדוד שינוי במשקל גוף. אורך מעי מידה ועובי עם קליפר הדיגיטלי. שים לב מרקם צואה (קשה, רך או בכלל). קבע דם סמוי בצואה עם Hemooccult. לנתח רקמות מעי גס ולתקן בפורמלין עבור H & E מכתימה.
5. לנתח 1 הירך boנה לעכבר, לחלץ מח עצם ולשטוף את מוח העצם בקור PBS באמצעות מחט 25G ומזרק 1 מ"ל. 4 מח עצם ברכה מתחבר לצינור 1 ולשמור על קרח.
6. יוצק את מח העצם לצלחת פטרי, גזירת תוספת מח העצם עם מחט 18G ו5 מיליליטר מזרקים מספר פעמים עד שלא תקע מח עצם הוא הווה.
7. ספין למטה עם 1,500 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסרת supernatant ו resuspend תא עם חיץ מכתים μl 600. מחלק את מח עצם resuspended ל 5 צינורות Eppendorf, כל אחד עם 100 μl.

7. איכות פיקוח של השתלת מח עצם על ידי זרימת cytometry

1. כל תווית דוגמיות של דם או # 1-5 מח עצם:
2. מכין את תערובת נוגדנים לכל צינור מתאים בחושך.

# 1 אין נוגדן
# 2 שליטת אלוטיפ FITC μl 30 + 30 μl PE אלוטיפ בקרה + 15 CD16/32 חסימת μl
# 3 30 FITC μl CD45.1 Ab + 15 CD16/32 חסימת μl
# 4 30 PE μlCD45.2 Ab + 15 CD16/32 חסימת μl
# 5 30 FITC μl CD45.1 Ab + 30 μl PE CD45.2 Ab + 15 CD16/32 חסימת μl

תוסיף דבר לדם או # 1 דגימת מוח עצם

הוסף 5 μl של תערובת נוגדנים # 2 לכל דם או # 2 דגימת מוח עצם

הוסף 3 μl של תערובת נוגדני # 3 לכל דם או # 3 דגימת מוח עצם

הוסף 3 μl של תערובת נוגדנים # 4 לכל דם או # 4 דגימת מוח עצם

הוסף 5 μl של תערובת נוגדנים # 5 לכל דם או # 5 דגימת מוח עצם

3. שמור בחושך בקרח למשך 30 דקות.
4. הוסף 2 מיליליטר חיץ 1X RBC תמוגה לכל צינור. לשמור בסוד על קרח במשך 15 דקות.
5. ספין למטה התאים ב 1500 סל"ד, 5 דקות ב 4 ° C. (3.8 הרוטור GH, 1500 סל"ד = 350 XG) הסרת supernatant. Resuspend הגלולה עם חיץ 500 μl תא מכתים בזמן הקצר הכהה, אז המערבולת.
6. בדקו CD45.1 (המייצג WT) וCD45.2 (המייצג KO) בדם immunostained ודגימות מח עצם על ידי cytometry זרימה. בחר FITC לייצג WT CD45.1 וPE לייצג KO CD45.2.
7. לנתח את תוצאות cytometry הזרימה באמצעות תוכנת FlowJo. חישוב יחס FITC: PE יחס או PE: יחס FITC כדי לקבוע אם גנוטיפ התורם גנוטיפ הדומיננטי בדם ומוח עצם.

תוצאות

אם הגנים של האינטרס ממלא תפקיד משמעותי בתאי מערכת חיסוניים במהלך פיתוח של קוליטיס, העכברים שקבלו מח עצם של גנוטיפ השונה באמצעות השתלת מח עצם (WT לKO KO או לWT) צריך להיות תגובה שינתה לקוליטיס DSS. אחד הפרמטרים החשובים ביותר לקביעת החומרה של קוליטיס היא צביעת H & E של רקמות המעי הגסות. שינויים גסי רקמות מבנה וסימנים של דלקת ניתן להעריך כמותית ידי שיטת ניקוד E היסטולוגיה H &. קריטריונים עבור H & E ניקוד היסטולוגיה למודל קוליטיס DSS יכולים למצוא כאן ^2. לחלופין,...

דיון

גישת השתלת מח עצם זה מתאים למחקר אימונולוגיה של דלקת מעי גס, זיהום, סרטן, השמנת יתר ומחלות אחרות. ניסוי השתלת מח עצם זה נחוץ כאשר הגנים של האינטרס מתבטא הוא במח העצם נגזר ותאים שאינם מח עצם נגזרות וגנים של האינטרס הוא חשוד לתווך מחלה על ידי תאים מאו אוכלוסייה. לדוגמה, מיקרוביאלית פפטיד cathelicidin מוצג לווסת קוליטיס האקוטי. אבל זה בא לידי הביטוי בשני תאי האפיתל ותאי מערכת חיסון (כגון מקרופאגים). ואז השתמשנו בהשתלת עצם כדי להגדיר אילו אוכלוסייה של תאי מודולציה קוליטיס החריף בעכברי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
חיץ מכתים תא	Biolegend	# 420201
חיץ תמוגה RBC 10X	Biolegend	# 420301
FITC עכבר אלוטיפ שליטה	Biolegend	# 400207
PE עכבר אלוטיפ שליטה	Biolegend	# 400211
PE אנטי עכבר CD45.2	Biolegend	# 109807
FITC אנטי עכבר CD45.1	Biolegend	# 110705
אנטי עכבר CD16/32 חסימה	Biolegend	# 101301
מסננת תא 40 מיקרומטר	Fisherbrand	# 22363547
PBS 1X	# 1860454
הפארין	Fisherbrand	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (פישר)
לנזול IC	Andwin מדעי	NC9745686 (פישר)
Vaccutainer	BD	# 8000813
העכבר עוצר	בריינטרי מדעי	# הטלביזיה-150
Irradiator	JL שפרד ואיגודים	סמן לי 68A
cytometer זרימה	BD	BD FACSCanto השני
מבחנת cytometer זרימה	בז	# 352052
קליפר הדיגיטלי	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult תקשוב	Beckman Coulter	G0328QW