מאמר שיטה

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

DOI:

10.3791/4208

⸱

1 באוקטובר 2012

 ,  ,  ,  , 
1Center for Inflammatory Bowel Diseases, Division of Digestive Diseases, David Geffen School of Medicine, The University of California Los Angeles, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת מח עצם מספקת דרך לשנות את הגנוטיפ של תאים שמקורם במח עצם. אם הגן של העניין בא לידי ביטוי בשני תאי מח עצם ותאים שמקורם במח שאינם נגזרים עצם, השתלת מח עצם יכולה לשנות את התאים שמקורם במח עצם לגנוטיפ שונה מבלי לשנות את גנוטיפ התאים לא נובע מח העצם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין את תפקידו של גן בהתפתחות הדלקת במעי גס, השווה את התגובות של עכברי סוג פראי ועכברי נוקאאוט החסרים הגנטית של ריבית לקוליטיס. אם הגנים של האינטרס מתבטא בשני תאי מח עצם ותאי שמקורם נובעים מח עצם שאינם של המארח, עם זאת, ניתן להבחין את התפקיד של גן של עניין בתאי מח עצם ומקורם במח עצם שאינו תאים שהופקו על ידי טכניקת השתלת מח עצם. כדי לשנות את הגנוטיפ מח העצם נגזר תאים של עכברים, מח העצם המקורי של עכברי נמען נהרסו על ידי הקרנה ולאחר מכן הוחלף על ידי מח עצם מתורם החדש של גנוטיפ השונה. כאשר מח עצם פראי מסוג עכברי תורם הושתל בעכברי נוקאאוט, אנו יכולים לייצר עכברי נוקאאוט עם ביטוי גנים פראי מסוג תאים שמקורם במח עצם. לחלופין, כאשר מח עצם מתורם עכברי נוקאאוט הושתל בעכברי נמען סוג פראי, עכברי סוג פראי ללא גנים של האינטרס להביעממח עצם תאים שמקורם יוצרו. עם זאת, השתלת מח עצם לא יכולה להיות 100%. לכן, אנו מנוצלים מקבץ של בידול מולקולות (CD) (CD45.1 וCD45.2) כסמנים של תאי תורם ומקבל כדי לעקוב אחר שיעור תאי מח עצם מתורם נגזרים בעכברי נמען והצלחה של השתלת מח עצם. עכברי סוג פראי עם CD45.1 עכברי גנוטיפ ונוקאאוט עם גנוטיפ CD45.2 היו בשימוש. לאחר ההקרנה של עכברי נמען, את תאי מח העצם של תורם גנוטיפים שונים שהחדירו לתוך עכברי הנמען. כאשר מח העצם החדש מחדש להשתלט על חסינותה, העכברים היו לערער על ידי סוכן כימי (נתרן גופרתי dextran, DSS 5%) כדי לגרום לדלקת מעי גס. הנה גם אנחנו הראינו את השיטה כדי לגרום לדלקת המעי גס בעכברים ולהעריך את תפקידו של הגן של עניין הביע מתאי שמקורם של מח עצם. אם הגנים של האינטרס מהתאים שמקורם העצם ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות המחלה (כגון coliTIS), הפנוטיפ של עכברי נמען עם השתלת מח עצם ניתן לשנות באופן משמעותי. בתום ניסויי קוליטיס, מח העצם נגזר תאי דם ובמח עצם תויגו עם נוגדנים נגד CD45.1 וCD45.2 והיחס הכמותי שלהם לקיום יכול לשמש כדי להעריך את ההצלחה של השתלת מח עצם על ידי cytometry זרימה. השתלת מח עצם מוצלחת צריכה להראות רוב מכריע של גנוטיפ תורם (בטווח של מולקולת סמן תקליטור) על הגנוטיפ נמען הוא במח העצם והדם של עכברי נמען.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. לפני שאתה מתחיל, שיקולים טכניים

  1. אנו ממליצים להשתמש בשני עכברי C57/BL6 סוג פראי ועכברי נוקאאוט לניסוי כי עכברים עם מולקולות CD מתאימות ניתן לרכוש מיצרני העכברים גדולים.
  2. מכיוון שקשה לעקוב אחר עכברי הסוג פראי ועכברי נוקאאוט ליטול תאים תורמים לאחר השתלת מח עצם, יש צורך להשתמש CD45.1 עכברים לייצג עכברי סוג פראי. (CD45.1 מניית C57/SJL WT עכברי ג'קסון מעבדות # 002014).
  3. רוב מושבות עכבר הן CD45.2. עכברי נוקאאוט שייכים לCD45.2 גנוטיפ (CD45.2 מ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אם הגנים של האינטרס ממלא תפקיד משמעותי בתאי מערכת חיסוניים במהלך פיתוח של קוליטיס, העכברים שקבלו מח עצם של גנוטיפ השונה באמצעות השתלת מח עצם (WT לKO KO או לWT) צריך להיות תגובה שינתה לקוליטיס DSS. אחד הפרמטרים החשובים ביותר לקביעת החומרה של קוליטיס היא צביעת H & E של רקמות המעי הגסות. שינויים גסי רקמות מבנה וסימנים של דלקת ניתן להעריך כמותית ידי שיטת ניקוד E היסטולוגיה H &. קריטריונים עבור H & E ניקוד היסטולוגיה למודל קוליטיס DSS יכולים למצוא כאן 2. לחלופין,.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישת השתלת מח עצם זה מתאים למחקר אימונולוגיה של דלקת מעי גס, זיהום, סרטן, השמנת יתר ומחלות אחרות. ניסוי השתלת מח עצם זה נחוץ כאשר הגנים של האינטרס מתבטא הוא במח העצם נגזר ותאים שאינם מח עצם נגזרות וגנים של האינטרס הוא חשוד לתווך מחלה על ידי תאים מאו אוכלוסייה. לדוגמה, מיקרוביאלית פפטיד cathelicidin מוצג לווסת קוליטיס האקוטי. אבל זה בא לידי הביטוי בשני תאי האפיתל ותאי מערכת חיסון (כגון מקרופאגים). ואז השתמשנו בהשתלת עצם כדי להגדיר אילו אוכלוסייה של תאי מודולציה קוליטיס החריף בעכברי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק פיילוט ובדיקת היתכנות מאוניברסיטת UCLA-CURE מרכז, קרוהן וקוליטיס קרן פרס אמריקה פיתוח קריירה (# 2691) והמכון הלאומי לבריאות NIDDK K01 (DK084256) מימון לכב וואי Koon של.

פעולת הקרנת מח העצם נעזרה בברנרד לוין ומטבח סקוט של UCLA מרכז לחקר איידס עכבר / מתקן Core כימרה אנושי. פעולת זרימת cytometry נעזרה במתקן Core וקטור-UCLA.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

biomedicals MP

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים
חיץ מכתים תא Biolegend # 420201
חיץ תמוגה RBC 10X Biolegend # 420301
FITC עכבר אלוטיפ שליטה Biolegend # 400207
PE עכבר אלוטיפ שליטה Biolegend # 400211
PE אנטי עכבר CD45.2 Biolegend # 109807
FITC אנטי עכבר CD45.1 Biolegend # 110705
אנטי עכבר CD16/32 חסימה Biolegend # 101301
מסננת תא 40 מיקרומטר Fisherbrand # 22363547
PBS 1X # 1860454
הפארין Fisherbrand # BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (פישר)
לנזול IC Andwin מדעי NC9745686 (פישר)
Vaccutainer BD # 8000813
העכבר עוצר בריינטרי מדעי # הטלביזיה-150
Irradiator JL שפרד ואיגודים סמן לי 68A
cytometer זרימה BD BD FACSCanto השני
מבחנת cytometer זרימה בז # 352052
קליפר הדיגיטלי Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult תקשוב Beckman Coulter G0328QW

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameli....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bone Marrow TransplantationFlow CytometryColitis InductionDextran SulfateCD45 1 CD45 2 MarkersWild Type MiceKnockout MiceBone Marrow IsolationHistology AnalysisCell Staining

מאמרים קשורים