הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

16.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/4219

⸱

31 באוקטובר 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Virology and Gene Therapy, KU Leuven, 2Department of Woman and Child, KU Leuven, 3Neurobiology and Gene Therapy, KU Leuven, 4Division of Nuclear Medicine, KU Leuven, 5Biomedical NMR Unit/ MoSAIC, KU Leuven

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פתחנו גישה ניתוחית חדשנית לממשל intratracheal של סוכני יו לעובר העכבר. מסלול המשלוח הוא יעיל יותר במיקוד ריאות העכבר העובריות מהזרקה תוך מי השפירה בשימוש נפוץ. הליך זה עד כה לא תואר במודל של עכברים.

תקציר

אספקת ריאתי בהריון של תאים, גנים או סוכנים תרופתיים יכולה לספק את הבסיס לאסטרטגיות טיפוליות חדשות למגוון רחב של מחלות גנטיות ונרכשות. חוץ ממומים מולדים או תורשתיים עם הדרישה לביטוי לטווח הארוך של הגן נמסר, כמה תנאים סביב לידה שאינן תורשתיים-, שבו ביטוי גנים לטווח קצר או התערבות תרופתית מספיק כדי להשיג השפעות טיפוליות, נחשבים כאינדיקציות עתידיות אפשריות לכך סוג של גישה. מחל מועמד ליישום של טיפול טרום לידתי לטווח קצר יכולות להיות מחסור בילוד הזמני של החלבון הפעיל השטח B גורם 1,2 יילודי מצוקה נשימתית תסמונת או פציעות hyperoxic של ריאות יילודי 3. מחל מועמד לתיקון טיפולי קבוע הן סיסטיק פיברוזיס (CF) 4, וריאנטים גנטיים של ליקויים פעילים שטח 5 ו חסר α1-antitrypsin 6. <כיתת p = "jove_content"> באופן כללי, יתרון חשוב של טיפול גנטי טרום לידתי היא היכולת להתחיל התערבות טיפולית בשלב מוקדם בפיתוח, באו אפילו לפני ביטויים קליניים של המטופל, ובכך למנוע ניזק בלתי הפיך לאדם. בנוסף, איברי עובר יש קצב תרבות תאים מוגבר בהשוואה לאיברים למבוגרים, אשר עלול לאפשר גנטי יעילים יותר או העברת תאי גזע לעובר. יתר על כן, במסירת גן הרחם מבוצע כאשר המערכת החיסונית של האדם היא לא לגמרי בוגרת. לכן, השתלה של תאים או בתוספי Heterologous של חלבון שאינו תפקודי או נעדר עם גרסה נכונה לא אמורה לגרום לרגישות חיסונית התא, הווקטור או מוצר transgene, שלאחרונה הוכח במקרה של טיפולים סלולריים והן גנטיים 7 .

במחקר הנוכחי, חוקרים בחן את הפוטנציאל ישירות לקנה הנשימה למקד העוברי בעכבר מ 'אודל. הליך זה נמצא בשימוש במודלים של בעלי חיים גדולים יותר כגון ארנבות וכבשים 8, ואפילו בהגדרה קלינית 9, אך עד כה לא בוצע קודם לכן במודל עכבר. כאשר לומדים את הפוטנציאל של ריפוי גנטי עוברי לטיפול במחלות גנטיות כגון CF, מודל העכבר הוא מאוד שימושי כהוכחה של המושג ראשון בגלל הזמינות הרחבה של זנים שונים מהונדסים לעכבר, embryogenesis המתועדים היטב וההתפתחות עוברת, פחות מחמירים תקנות אתיות, הריון קצר וגודל ההמלטה גדול.

דרכי גישה שונה כבר תאר למקד ריאות מכרסם העובריות, כולל הזרקה תוך 10-12 מי שפירה, הזרקה (אולטרסאונד מונחה) intrapulmonary 13,14 ועירוי לוריד לתוך כלי צק חלמון 15,16 או וריד טבור 17. הליך הכירורגים החדשני שלנו מאפשר לחוקרים להזריק את הסוכן של בחירה ישירה לקנה נשימת העכבר העוברי המאפשרלאספקה ​​יעילה יותר לדרכי הנשימה מטכניקות קיימות 18.

פרוטוקול

1. הזדווגות של עכברים לקבל שלב הריון רצוי

עכברי NMRI הריון הזדווג זמן כדי שהם 18 ימים (E18) בהריון (הריון כולל E19.5) בזמן הניתוח. לפני ואחרי הניתוח הם שוכנו בכלובים עליונים מסננים בטמפרטורת חדר רגיל ואור יום נורמלי עם גישה חופשיה למים ולאכול.

2. (IT) הזרקת Intratracheal עוברית (איור 1)

  1. ראשון להגיש את עכבר NMRI הריון להרדמה כללית עם 1.5% isoflurane בתערובת של O 2 ב1.5 ליטר / דקה. רמת isoflurane תלוי בגיל ובלחץ של העכבר, אבל באופן כללי isoflurane צריך להיות ברמה שמעמידה את בעלי חיים במדינת ההרדמה. ואז לשים את העכבר על הריון כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת גוף במהלך ניתוח.
  2. הניתוח כולו מתבצע על ידי שני מנתחים. מנתח אחד יבצע את הנתיחה של עכבר ההריון והחשיפה הבאה של העובר דואר להזרקת intratracheal. המנתח השני יבצע הזרקת intratracheal העובר עצמו. ההליך הניתוחי מבוצע באמצעות מכשירים סטריליים וטכניקת aseptic.
  3. לחטא את הבטן עם יודיד povidone ולבצע laparotomy חציון לחשוף את הרחם להריון. Exteriorize קרן רחם אחת בכל פעם ולספור את מספר צקי הריון. עובר אחת לקרן מופעל על ונבחר על סמך המיקום האופטימלי להחצנה של ראש העובר בשלבים הבאים. העובר המתאים ביותר נבחר על ידי הדמיית דרך קיר הרחם. האף של ראש העובר צריך להצביע למנתח שיזריק לתוך קנה הנשימה לאחר חשיפת ראש העובר ולתקן אותו לאחור (כמוסבר בשלב שלאחר מכן 2.5).
  4. ראשית תעבור 6-0 פוליפרופילן תפר מחרוזת (Prolene) ארנק של כ 1 סנטימטר הקוטר דרך דופן רחם ואת קרומי העובר (מי השפיר membranדואר והקודקודית צק חלמון) מעל האזור שבו מאוחר יותר בראש העובר יהיה חשוף דרך. תפר זה שומר על העובר קבוע בתוך הרחם החל בכתפיים. בשלב הבא, עושה חתך ברחם בתוך מחרוזת הארנק של כ 0.8 סנטימטר באמצעות מספריים חדים.
  5. לוחץ בעדינות את הראש ובצווארו של העובר דרך hysterotomy. משוך את תפר מחרוזת ארנק עדינות בחוזקה סביב הצוואר ולתקן אותה בעמדה עם 2 מלקחיים Micro-יתוש. ראש העובר נשמר בhyperextension ידי 5-0 polyglactin 910 תפר (Vicryl) על שני מלקחיים להציב לתוך הפה באזור הלסת העליונה.
  6. תחת מיקרוסקופ זום סטריאוסקופית (גדלת x10) לקנה הנשימה של העובר הוא מדמיין על ידי ביצוע חתך צוואר אנכי באמצעות נתיחה חדה ובוטה. החתך באזור צוואר אורכו כ 5 מ"מ. זה חתך שטחי, כמו הרקמה שמתחתיו היא מבותרת נוספת באמצעות נתיחה בוטה להגיע לקנה הנשימה.
  7. תחת חזון ישיר מבעד למיקרוסקופ זום סטריאוסקופית, להזריק בהיקף כולל של 30 μl של חומר (למשל חרוזי ניאון או וקטור ויראלי) לקנה הנשימה באמצעות מזרק זכוכית המילטון μl 50 עם מחט 30 סול דיאז. לאחר הסרת המחט, זרימה מינימאלית של הנוזל המוזרק מבטיחה הזרקה נכונה. החתך אינו סגור לאחר הזרקה.
  8. כדי להחליף את הראש ברחם, להפעיל לחץ עדין על האף. הצוואר הולך ראשון חזרה אל הרחם, ואחריו את הראש. האף הולך באחרון. בשלב הבא, לסגור את hysterotomy ידי הידוק מחרוזת הארנק. אז מזריק כולל של כ 0.5 מ"ל של תמיסה פיזיולוגית לתוך החלל מי השפיר כדי למנוע oligohydramnios. כדי לעשות זאת, הכנס מחט לתוך החתך בתוך מחרוזת הארנק. בשלב בא, לסגור את התפר סביב המחט, לאחר שמוזרקת תמיסת מלח. בשלב אחרון, יחזור בו את המחט, ואחרי סגירת עמ לחלוטיןurse מחרוזת.
  9. סגור את הקיר האימהי בטן (הצפק ושכבת שריר פנימית וחיצונית) ועור עם תפר פועל Vicryl 5-0 בשתי שכבות נפרדות. לאחר מכן, לחדור את החתך בxylocaine 0.2% להקלה על כאבים שלאחר הניתוח. מומלץ להשתמש בעצירות (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג או SC-IP) להקלה על כאב שלאחר ניתוח. לא ולא tocolytics אנטיביוטיקה מניעתי משמשים. העכברים נשמרים על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) עד שהם התאוששו באופן מלא (כ 1 שעות).

3. תוך מי שפירת הזרקה עוברית (IA)

  1. ראה 2.1
  2. לחטא את הבטן עם יודיד povidone ולבצע laparotomy חציון לחשוף את הרחם להריון. Exteriorize קרן רחם אחת בכל פעם ולספור את מספר צקי הריון.
  3. הזרקת IA יכולה להתבצע על כל העוברים וזה לוקח פחות זמן לבצע. יתר על כן, עמדתו של העובר אינה critiקלוריות בהשוואה להזרקת intratracheal. כדופן הרחם הוא שקוף למחצה, המבנים העובריים כגון ראש, גפיים ועמדת זנב ושליה הם יפה לעין.
  4. שימוש באותה המחט ומזרק כאמור לעיל (2.7), להזריק 30 μl של חומר באזור הפה העוברי. ניתן לעשות זאת בקלות אם בין הראש וforelimbs העוברי, או בין הגפיים התחתונים והזנב. ההזרקה מבוצעת רק לאחר בחינה מדוקדקת של המיקום של המחט על מנת להבטיח שאין מבנים עובריים נמצאים במגע עם הקצה בזמן ההזרקה.
  5. הרחם משנה את מיקומו בחלל הבטן והקיר ועור הבטן עצומה כמתואר לעיל (2.9).

4. הערכה של עוברים הזריקו וטיפוח-צלב

  1. להרוג את הסכר באמצעות 36 שעתי שיטת המתת חסד אושרו לאחר ההתערבות העוברית (בE19.5). נקע צוואר רחם בלי נוסףהרדמה תהיה השיטה הטובה ביותר, כמו כל הצורות האחרות של המתת חסד הכוללות הרדמה (למשל isoflurane, פנטוברביטל) תהיינה להרדים או אפילו להרוג את העוברים, שהיית רוצה להימנע ממנו בכל העת. לספק את העוברים המופעל בניתוח קיסרי. העוברים פעלו מזוהים ברחם בעמדתם. צקים שפירים ממוספרים, החל בסוף השחלות של רחם bicornuate.
  2. לאחר לידה, את הקריטריונים הבאים משמשים כדי להעריך את הכדאיות של העוברים: הנוכחות (1) פעימות לב, (2) צבע עור הוורוד (לעומת כחלון) ו (3) תנועות ספונטניות. הנח גורים רק מגשימים את הקריטריונים האלה בהמלטה של ​​אמו מאמצת המכילה גורים ישנים של יום אחד. מניסיון אנו יודעים כי גורים עם לב פעימת צבע חלש, כחלון עור ו / או תנועות ספונטניות מינימאליות לעתים קרובות לא ישרדו בשל דחייה מההמלטה של ​​אמו המאמצת או על ידי קניבליזם האימהי.
  3. לאחר הלידה oצבע גלוי fa באמצעות IT או הזרקת IA (מולקולות ניאון אדומה, לדוגמה), ניתן להבטיח הזרקה נכונה על ידי הנוכחות של הצבע הזה (הצבע הוורוד מfluospheres הזריק האדום) בבית החזה (בהזרקה ישירה לריאות לאחר IT הזרקה, או על ידי שאיפה לריאות לאחר הזרקת IA) או חלל בטן (בבליעה). הדבר זה מתאפשר בשל העובדה שהעכברים ילודים הם חצי שקופים המאפשרים להערכת vivo של הריאות והקיבה.
  4. סמן את הגורים הוזרקו כהלכה עם דיו הסיני מתחת לעור מעל בסיס הזנב. שם את כל הגורים, שמקיימים את הדרישות שהוזכרו ב4.2 בהמלטה של ​​אמו המאמצת.
  5. כדי להבטיח קבלה והישרדות של הגורים המופעל במקסימליים, להשאיר לא יותר מ 10 גורים בהמלטה בסך של אמו המאמצת (שני 1 יום גוריו הישנים, כמו גם את גורי צלב טפח-). לפני צבת הגור פעל עלזה בהמלטה של ​​אמו המאמצת, לכסות אותם במצעים מאמו המאמצת, המכיל גם הצואה ושתן כדי להסתיר את ריחות הלא מוכרים.
  6. הנח את הכלוב בסביבה שקטה ולא להפריע לגורים לפחות 12 שעות (לילה).
  7. למחרת, להעריך בזהירות את שיעור ההישרדות של טיפוח על ידי ספירה כל הגורים, מה שהופך את ההבחנה בין הגורים של האם המאמצת ואת הגורים המופעל ב( מסומן בדיו סיני ובממוצע קטן יותר מהגורים האחרים). למזער את זמן המניפולציה של גורים אלה כדי למנוע דחייה על ידי אמו וכדי להימנע מהיפותרמיה. באופן כללי, אם גורים לא היה חלב בקיבה שלהם (שהוא גלוי בשל האופי השקוף למחצה של גורי בני יומם), התחזית היא ענייה מאוד להישרדות נוספת של בעלי חיים אלה.

5. נציג תוצאות

המערך הכולל של הניסוי מתואר בFigurדואר 2.

קביעת הנפח האופטימלי לזריקת intratracheal

כדי לקבוע את הנפח האופטימלי לזריקת ה-IT, אנו אמפיריים בחרנו כרכים שונים נעים בין 10, 20-30 μl (n = 3/volume). לזיהוי קל, בחר להחדיר מולקולות ניאון אדומות (fluospheres, בדיקות מולקולריות, ליידן, הולנד) אבחנו 100 ננומטר. לאחר הזרקת ה-IT בE18 עוברים ישנים, הריאות נקצרו 24 שעות מאוחר יותר, נקבעה בparaformaldehyde הלילה ב 4 ° C ומיקרומטר 6 חלקים קפואים נעשו 4%. חוטי גרעינים ותקטינו הוכתמו Hoechst 33258 (סיגמה אולדריץ, Bornem, בלגיה) ואלקסה פלואוריד 488 phalloidin (Invitrogen, Merelbeke, בלגיה) בהתאמה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. תמונות confocal נעשו באמצעות מיקרוסקופ Biorad זיו 2100 Confocal עם LaserSharp2000.6 תוכנה על ידי Carl Zeiss. פלואורסצנטי יחסית (יחס בין אדום לכחול fluospheres קרינה מייצג וstainin הגרעיניגרם, בהתאמה) היה לכמת באמצעות ImageJ תוכנה מקוונת (איור 3). למרות שבזמן הניתוח עוברי, זרימה חוזרת התגלתה רק לאחר הזרקה של 30 μl, המציין עודף של נוזלים המוזרקים, 30 μl נתן את הסכום הגבוה ביותר של אות ניאון בparenchyma הריאות כלכמת על ידי מדידת הקרינה היחסית (ניתוח שונה , השוואות לכל זוג סטודנטים באמצעות מבחן t של, * p <0.05, *** p <0.001).

הערכה כמותית של fluospheres ברקמת ריאה וbiodistribution לדרך העיכול

בשלב בא, אנחנו רוצים להשוות את היעילות של מיקוד ריאות עכבר העובריות לאחר IT לעומת הזרקת IA. כדי לעשות זאת, 30 μl של fluospheres נמסרו לריאות העכבר העובריות לאחר אותו או הזרקת IA בE18 עכברי NMRI הריון (n = 5 לכל קבוצה). הזרקת IT הביאה משלוח גבוה משמעותי של fluospheres לריאות של העובר לעומת IA. מסלול (1.43 ± 0.56 ו 0.05 ± 0.02 פלואורסצנטי יחסית (יחס של fluospheres לHoechst בהתאמה, ניתוח שונה, מבחן t של הסטודנט, *** p <0.001) (איורים 4 AC). עוברי קבוצת ביקורת שמשו לנורמליזציה של ניאון רקע אות. דרך העיכול הייתה חיובית עבור ה-IT ואת החיות המוזרקות IA (איור 4 ד). לא פלואורסצנטי האדום נצפה ברקמות אחרות מעוברים שטופלו או בפקד החיים השליליים (נתונים אינם מוצגים).

השוואה בין הזרקת intratracheal ותוך שפיר בעקבות מסירת גן התיווך בrAAV2/6.2 ריאות העוברות

לאחר השוואת שתי שיטות המשלוח באמצעות הזרקת מולקולות ניאון, רציתי להעריך את היעילות של תמרה וביטוי גנים נגיפיים הבא אחריה וזריקת IA באמצעות וקטורי rAAV. rAAV2/6.2 קידוד גחלילית לוציפראז (fLuc) (3x10 10 / עובר GC)תחת שליטתו של עוף β-יקטין האמרגן (CBA) הוזרק IT (n = 8) או IA (n = 6) בעכברי NMRI עובריים בE18. לאחר ניתוח קיסרי והטיפוח, ששרד גורים היה במעקב על ידי הדמית פליטת אור לא פולשנית (BLI) ופיקוח על פעילות fLuc (פוטונים / 2, P / S) בשבוע 1 של גיל (איור 5). שטף הפוטון הכולל עבור קבוצת ה-IT היה גבוה באופן משמעותי מזה בקבוצת IA ושליטה השלילית (ניתוח שונה, השוואות לכל זוג סטודנטים באמצעות מבחן t של, * p <0.05). אות BLI הממוצעת בקבוצת IA לא הייתה גבוהה באופן משמעותי מאשר בקבוצת הביקורת השלילית.

הבחנה בין נכון וזריקת intratracheal עוברית שגויה

הבחנה בין נכון וincorrectI.T. הזרקה ניתן להעריך בכמה רמות. בנקודת זמן הניתוח, במהלך הזרקה לקנה הנשימה של העובר, ללא התנגדות ניתן תהיה לשים לב כאשר needlדואר ממוקם בקנה הנשימה. עם זאת, עמידות גבוהה יותר ניתן תהיה לשים לב כאשר הזרקה במרחב paratracheal. שנית, בניתוח קיסרי כעובר הוא שקוף למחצה, אפשר לראות את הריאות ולאחר מכן את הנוכחות של צבע גלוי (דיו סיני למשל, מולקולות ניאון). האפשרות אחרונה להעריך הזרקה נכונה היא על ידי הדמיה האופטית ולייתר דיוק הדמית פליטת אור. BLI הוא מערכת אלגנטית להלא פולשני ביטוי גני מעקב של בלוציפראז גחלילית גן הכתב, אך ברזולוציה מרחבית והמידע אנטומי מוגבלות. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) מספקת רזולוציה גבוהה, תמונות טומוגרפית המכילות מידע מפורט אנטומית. לכן חקרנו את השילוב של BLI עם MRI כדי לקבל תמונת שכבה, המשלבת את אות משטח BLI עם הדמיה של המבנים אנטומיים העמוקים יותר (איברים פנימיים). המטרה שלנו הייתה להשיג יותר מפורט במידע vivo של מקומיאזרוח של ביטוי גנים כדי להיות מסוגל להבחין נכון מהזרקה שגויה IT.

תמונות משולבות BL-MR נרכשו בכמה בעלי חיים הזריקו אותו עם rAAV2/6.2 CBA-fLuc וCBA-LacZnls (3x10 10 / עובר GC לכל וקטור, n = 10) בשבוע של גיל אחד (איור 6). BL ההדמיה חשפה אות שיוצאת מהצוואר ואזור בית החזה. שיתוף רישום של MRI עם ביטוי BLI ממוקם לוציפראז גן באזור הריאות בעקבות הזרקה נכונה (איור 6), אבל בצוואר ובאזור בטן לאחר הזרקה שגויה (איור 6 ב). ניתוח היסטולוגית על ידי הכתמת X-gal אשר in vivo שיתוף רישום.

הישרדות לאחר הזרקת intratracheal ותוך שפיר

  1. Fluorospheres
    ההישרדות למסירת E18 עוברי NMRI ישנים הזריקה IT או IA עם ננומטר μl 30 האדום fluorescen 100מולקולות t היו 100% בשתי הקבוצות והוגדרו כמספר עוברי חיים מוזרקים בעת הקציר, 24 שעות לאחר הניתוח העוברי (טבלה 1).
  2. rAAV וקטור
    ההישרדות למשלוח של עוברים מוזרקים IT או IA עם rAAV2/6.2, אשר מוגדר כמספר עוברי חיים בנקודת הזמן של הזרקה קיסרית סעיף 36 ח פוסט עוברית, היה 85.3% ו86.3%, בהתאמה (טבלה 1). שיעור ההישרדות של הילוד מוקדם היה 53.3% (IT) ו74.5% (IA), בהתאמה, וחושב על ידי correlating מספר גורי חי יום 1 לאחר טיפוח עם המספר הראשוני של עוברים המוזרקים. כדי להשיג שיעורי ההישרדות סופיים אלה, אנו מותאמים פרוטוקול הליך פרי הפעולה כירורגית באמצעות (1) איפת isoflurane כהרדמה במקום מנהל מתערובת של קטמין (75-IP מ"ג / ק"ג) וmedetomidine (IP 1 מ"ג / ק"ג) , (2) כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה במהלך ניתוח, (3),מיקרוסקופ סטריאוסקופית זום ו( 4) המפעילים מקבלים יותר מנוסים עם ההליך כירורגי.

figure-protocol-1
איור 1. הזרקת Intratracheal בE18 עוברי עכברים. באיור זה את השלבים העיקריים של ההליך כירורגי להזרקת IT עוברית מתוארות. בשלב ראשון קרן אחת הרחם exteriorized. בשלב הבא, תפר מחרוזת ארנק עובר דרך דופן הרחם והקרומים העובריים (קרום שפיר והקודקודית צק חלמון) מעל האזור שבו מאוחר יותר בראש העובר יהיו חשופים דרך. בשלב הבא, בראש ובצוואר של העובר הם exteriorized דרך hysterotomy, לאחר שראש העובר נשמר בhyperextension ידי 910 תפר 5-0 polyglactin על שני מלקחיים בין הלסתות. תחת מיקרוסקופ זום סטריאוסקופית (גדלת x10) לקנה הנשימה של העובר הוא מדמיין ידי ביצוע incis רוחב הצוואריון באמצעות נתיחה חדה ובוטה. בשלב אחרון, בהיקף כולל של 30 μl חומר מוזרק לתוך קנה הנשימה תחת חזון ישיר מבעד למיקרוסקופ זום סטריאוסקופית.

figure-protocol-2
איור 2. סקירה כללית של הניסוי.

figure-protocol-3
איור 3. קביעת הנפח האופטימלי לזריקת intratracheal. כדי לקבוע את הנפח האופטימלי לזריקת ה-IT, 10, 20 או μl 30 (n = 3/volume) של fluospheres האדום בגודל 100 ננומטר נוהל בE18 עוברים ישנים והריאות נקצרו 24 שעות מאוחר יותר. חוטי גרעינים ותקטינו הוכתמו Hoechst 33258 ו אלקסה פלואוריד 488 phalloidin בהתאמה. פלואורסצנטי יחסית (יחס בין אדום לכחול מייצג פלואורסצנטי fluospheres וצביעה גרעינית בהתאמה) היה לכמת באמצעות תוכנה מקוונת ImageJ. ממוצע ± סטיית תקן, ניתוח שונה, השוואות לכל זוג באמצעות מבחן t של הסטודנט, * p <0.05, *** p <0.001.

figure-protocol-4
איור 4. הערכה כמותית של fluospheres ברקמת ריאה וbiodistribution לדרך עיכול. μl 30 של fluospheres האדום נמסרה לריאות העכבר העובריות לאחר (א) או (ב) בהזרקת IA E18 עכברי NMRI הריון להשוות את היעילות של מיקוד עכבר הריאות העוברות. עוברי קבוצת ביקורת שמשו לנורמליזציה של אות רקע ניאון. חוטי גרעינים ותקטינו הוכתמו Hoechst 33258 ו אלקסה פלואוריד 488 phalloidin, בהתאמה. (ג) פלואורסצנטי יחסית (יחס בין אדום לכחול מייצג פלואורסצנטי fluospheres וצביעה גרעינית בהתאמה) היה לכמת באמצעות תוכנה מקוונת ImageJ. (ד) דרך העיכול היה חיובית עבור ה-IT ואת החיות המוזרקות IA. ממוצע ± סטיית תקן, ניתוח שונה, מבחן t של הסטודנט, *** p <0.001. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-protocol-5
איור 5. השוואה בין הזרקת intratracheal ותוך שפיר בעקבות מסירת גן התיווך בrAAV2/6.2 ריאות העוברות. אות BLI בשבוע 1 לאחר הזרקה של rAAV2/6.2 (3 × 10 10 / עובר GC-CBA fLuc) עם כימות מקבילות שטף פוטון סך . כל החיות נסרקו, מופרד על ידי מחיצות שחורות, כדי למנוע פיזור של פוטונים לחיות שכנות. היקף pseudocolor מתאר את שטף הפוטונים לשניים, לסנטימטר מרובע לsteradian (P / S / 2 סנטימטר / SR). מדידות התקבלו באזור 4.3 סנטימטרים 2 מלבני של עניין. ממוצע ± סטיית תקן, ניתוח שונה, השוואות לכל זוג סטודנטים באמצעות מבחן t של, * p <0.05. איור מותאם Carlon et al., 2010. נדפס על ידי רשות מהוצאת מקמילן בע"מ: [טיפול מולקולרי] (doi: 10.1038/mt.2010.153), זכויות יוצרים (2010). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

figure-protocol-6
איור 6. הבחנה בין נכון וזריקת intratracheal עוברית שגויה בעקבות מסירת גן התיווך בrAAV2/6.2 ריאות העוברות. שילוב תמונות BL-MR נרכשו בכמה בעלים חיים הזריקו אותו עם rAAV2/6.2 CBA-fLuc וCBA-LacZnls (3x10 10 GC / עובר לכל vector) בשבוע אחד של גיל. BL ההדמיה חשפה אות שיוצאת מהצוואר ואזור בית החזה. שיתוף רישום של MRI עם ביטוי BLI ממוקם לוציפראז גן באזור הריאות בעקבות הזרקה נכונה (א), אבל בצוואר ובאזור בטן לאחר הזרקה שגויה (ב). ניתוח היסטולוגית אשר בשיתוף רישום vivo. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. איור מותאם Carlon et al., 2010. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

חומר הזרקה שיטת הזרקה הישרדות למסירה שיעור הישרדות של טיפוח ב הישרדות ילוד מוקדם שיעור ג
fluospheres זה 100 (8/8) נה נה
IA 100 (5/5) נה נה
rAAV2/6.2 זה 85,3 (64/75) 62,5 53,3 (40/75)
IA 86,3 (44/51) 86,4 74,5 (38/51)

טבלת 1. הישרדות לאחר הזרקת intratracheal ותוך שפיר של עובר. הישרדות למסירה, כלומר לאחר ניתוח ועובר בניתוח קיסרי, לפני הטיפוח. Pups b טופח רק אם הם היו ורודים, נע ונושם באופן נורמלי. ג שיעור הישרדות הילוד מוקדם מתבטאת כפונקציה של המספר ההתחלתי של גורים המוזרקים. קיצורים: IT הזרקת Intratracheal; הזרקת IA תוך מי שפירה; na אינו ישימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים

  • עכבר הזן שבחרנו לעבוד עם עכברים הוא NMRI כי יש להם מספר שופע של גורים (גודל ממוצע המלטה 14.4 ± 1.8, נתונים שלו), תסבול התערבויות היטב ויש להם מאפיינים אימהיים טובים.
  • הצבת מחרוזת הארנק דרך דופן הרחם והקרומים העובריים היא שלב קריטי כמו שאתה רק רוצה לחשוף את ראש העובר ולא את הכתפיים, אחרת מיצוב מחדש הוא כמעט בלתי אפשרי מבלי לגרום לט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

MC וAVdP הם דוקטורנטים נתמכים על ידי מענקים מהמכון לקידום החדשנות באמצעות מדע וטכנולוגיה בפלנדריה (IWT פלנדריה). JT מחזיק מלגה חלקית מחקר קלינית (כור) מUZ לובן. DV הוא דוקטורט בחור נתמך על ידי מענק מKU לובן, DBOF/10/062. MMdC הוא דוקטורט בחור נתמך על ידי מענק מConselho Nacional de Pesquisa הדואר Desenvolvimento (CNPq) וארסמוס מונדוס. מחקר מומן על ידי IWT פלנדריה, על ידי המענק מהקהילה האירופית דימי (LSHB-CT-2005-512146) ועל ידי בחי מולקולרי הדמית מחקר קבוצה (IMIR) מKU הלובן. ברצוננו להודות Core הווקטור UPenn נוסד על ידי ג'יימס מ 'וילסון למתנת סוגם של AAV6.2 אריזת פלסמיד לייצור וקטור rAAV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
עכברי NMRI ז'אנווייר, Le Genest סנט Isle, צרפת
Isoflurane Isoba, Intervet / Schering-Plough לבריאות בעלי חיים, מילטון קיינס, אנגליה
Prolene 6-0 Ethicon, גרוט Bijgaarden, בלגיה
Vicryl 5-0 Ethicon, גרוט Bijgaarden, בלגיה
מזרק 50 μl המילטון זכוכית, הדגם 1710.5 TLLX SYR המילטון, רינו, NV, ארצות הברית 5495-20
מחט 30G חדה המילטון, רינו, NV, ארצות הברית 7762-03
2% xylocaine חברת AstraZeneca, Zoetermeer, הולנד

מקורות

  1. Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
  2. Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
  3. Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
  4. Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
  5. Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
  6. Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
  7. Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
  8. Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
  9. Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
  10. Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
  11. Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
  12. Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
  13. Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
  14. Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
  15. Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
  16. Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
  17. Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
  18. Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
  19. Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
  20. Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.