תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

סיכום

אימות תפוקה גבוהה של סמנים ביולוגיים מועמדים מרובים יכולה להתבצע על ידי ELISA הרציף במטרה למזער מחזורי הקפאה / פשרה ושימוש בדגימות פלזמה יקרות. הנה, אנחנו מדגימים איך לבצע רצף ELISAs במשך שישה סמני פלזמת תוקף שונים ^1-3 למחלת שתל נגד מארח (GVHD) ⁴ באותו מדגם הפלזמה.

תקציר

אסטרטגיות proteomics גילוי משוחדות יש פוטנציאל לזהות מספר גדול של סמנים ביולוגיים חדשניים שיכול לשפר את בדיקות אבחון ופרוגנוזה בסביבה קלינית ועשויים לעזור התערבויות מדריך טיפוליות. כאשר מספר גדול של חלבוני מועמד מזוהה, זה עלול להיות קשה כדי לאמת סמנים ביולוגיים מועמדים באופנה בזמן ויעיל מדגימות מטופל פלזמה המונעות אירוע, נפח סופי ואין לו תחליף, כגון בתחילה חריף שתל נגד מחל מארח (GVHD), סיבוך מסכן חיים של השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT).

כאן אנו מתארים תהליך של ביצוע ELISAs הזמין מסחרי במשך שישה חלבונים GVHD תקף: IL-2Rα ^5, TNFR1 ^{6, 7} HGF, ^IL-8 8, elafin ^2, וREG3α ³ (הידוע גם בPAP1), באופן רציף כדי למזער מחזורי הקפאת הפשרה, מופשר זמן פלזמה ושימוש בפלזמה. לביצוע הליך זה אנו מבצעים את ELISAs בסדר רציף, כפי שנקבעו על ידי גורם דילול מדגם כפי שנקבע במעבדה שלנו באמצעות ערכות ופרוטוקולי יצרן ELISA עם התאמות קלות כדי להקל על ביצועי ELISA רציפים אופטימליים. ריכוזי פלזמת הסמן הביולוגיים הנובעים אז ניתן להדר ונותחו לממצאים משמעותיים בתוך קבוצת מטופל. בעוד סמנים אלה הם כיום למטרות מחקר בלבד, שילובם בטיפול קליני כרגע נחקר בניסויים קליניים.

טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים.

מבוא

מחלה אקוטית שתל נגד מארח (GVHD), גורם מוביל לתמותה שאינה הישנות (NRM) לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT), נמדדת על ידי חוסר תפקוד בשלוש מערכות איברים: העור, בכבד ובמערכת עיכול (GI) מערכה ^4. GVHD האקוטי מתרחש בדרך כלל בין שניים לשמונה שבועות לאחר השתלה, אך עלול להתרחש מאוחר יותר, ולעתים קרובות הוא קליני נבדל מסיבוכים שלאחר HSCT אחרים כגון רעילות מיזוג משטר, זיהום או תופעות לוואי של תרופות. באמצעות השימוש באסטרטגיות proteomic ואימות תפוקה גבוהה באמצעות ELISA הרציף, זיהו 6 חלבונים שריכוזים הם גבוהים בתחילת ביטויים קליניים של GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF ו IL-8, כאשר הוא משולב לתוך לוח 4-סמן ביולוגי יכול לאבחן GVHD בהופעת תסמינים קליניים ויכול לחזות הישרדות לאחר HSCT עצמאי של חומרת GVHD ^1. Elafin, סמן ביולוגי לGVHD של skב, יכול להפלות בין הפריחה והפריחה GVHD מגורמים אחרים כגון התפרצויות סמים ויכול לחזות הישרדות השתלה ^2. אנו זיהינו לאחרונה REG3α כמו סמן של GVHD של מערכת העיכול התחתונה, איבר המטרה הכי קשור NRM. ריכוז REG3α פלזמה אמין ניתן לזהות GVHD כסיבה לשלשולים לאחר HSCT ולתאם את החומרה היסטולוגית של GVHD בביופסיות מעי אבחון. ריכוזי REG3α בתחילת GVHD עיכול יכולים גם לחזות את ההיענות לטיפול וGVHD NRM ^3. שילוב של הסמנים ביולוגיים GVHD האלה תקפים לטיפול קליני כעת נחקר בניסויים קליניים.

ניסויים אלה בוצעו על aliquots פלזמה הקטנה שנאסף מהחולים שקבלו HSCT בין שנתי 2000 ו 2010 בזמן הופעת GVHD שהם חסרי תחליף וכמות מוגבלת. בשל האופי היקר של דגימות אלה, פתחו נפגשהוד של מדידת ריכוזי חלבוני פלזמה מרובים בצורה יעילה, לשעתק לחסל מחזורים עודפים הקפאת הפשרה, בזמן הפשרה ושימוש בפלזמה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים. כתב יד זה מתמקד בהיבטים הטכנולוגיים של מדידת סמנים ביולוגיים GVHD.

פרוטוקול

1. יום הניסוי 0: לדוגמא הכנה וציפוי פלייט מבחן ELISA עם נוגדן ללכידת IL-2Rα, REG3α וHGF

1. דגימות aliquot פלזמה כדי להיות מנותח תהיינה משכה מופשרים, והסתובב במהירות 12,000 סיבובים לדקה למשך 10 דקות כדי להפריד את הקרישים בתחתית והשומנים על גבי מהפלזמה. 150 μl של פלזמה לא מדוללת יהיה מצופה מכל דגימה לצלחת גם 96-V-תחתונה (צלחת מקור) על ידי pipetting הידני על פי מפות מוגדרות מראש. את aliquots יהיה עטוף בparafilm ושמר בתא לח ב 4 מעלות צלזיוס במשך כל התהליך; לא יותר מ 72 שעות.
2. הנוגדנים ללכוד HGF IL-2Rα ויהיה מחדש ודילול לפי מפרט יצרן ו 50 μl יהיו מצופה בכל באר של צלחות 96-כן גבוה מחייב בהתאמה גם חצי אז שנאטמו ודגרו הלילה ב 4 ° C. לחלופין, צלחות רבות ניתן לייבש על 37 מעלות צלזיוס ומאוחסנות ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר, תלויing על יציבותו של החלבון.
3. נוגדן ללכוד REG3α ידולל על פי פרוטוקול יצרן באמצעות חיץ ציפוי יצרן ו25 μl יהיה מצופה בכל אחד גם מצלחת 384 גם Nunc מקסי Sorp אשר לאחר מכן נאטם ודגר הלילה ב 4 ° C.

2. יום ניסוי 1: IL-2Rα ELISA (איור 1)

1. צלחת מבחן IL-2Rα היא שטפה, נחסמה במשתגע בכפות, וההתקן מחדש ועקומת סטנדרט 8-נקודה מוכנה לפרוטוקול יצרן.
2. לאחר שטיפת הצלחת בעקבות צעד החסימה, 50 μl של פלזמה חייה הוא מצופה בשני עותקים מצלחת המקור לצלחת מבחן ELISA, ו 50 μl של כל התקן מצופה בשני עותקים. הצלחת היא חתומה ודגרה על 2 שעות בטמפרטורת חדר במסובב צלחת להגדיר ב 300 סל"ד.
3. הפלזמה היא קולחת מצלחת מבחן ELISA IL-2Rα והניחה חזרה באו"םדילול צלחת מקור פלזמה. ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה ל450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו.

3. יום ניסוי 1: REG3α ELISA (איור 1)

1. 10 μl של פלזמה חייה יועבר לצלחת מקור נפרדת V-תחתונה. 90 μl של חיץ דילול יצרן בתנאי שמתווסף לכל גם ליצור צלחת מקור דילול 1:10.
2. REG3α ELISA מתבצעת לפי פרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות 384 גם) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-620 ננומטר, והנתונים יישמרו ונותחו.

4. יום הניסוי 1: Elafin וציפוי פלייט מבחן TNFR1 עם נוגדן לכיד

1. נוגדנים ללכוד TNFR1 Elafin ויהיו משוחזרים ודילuted לפי מפרט יצרן ו 50 μl יהיה מצופה בכל באר של צלחות 96-כן גבוה מחייב בהתאמה גם חצי אז שנאטמו וטופחו במשך הלילה בטמפרטורת חדר למשך Elafin, ועל 4 מעלות צלזיוס במשך TNFR1.

5. ניסוי יום 1-2: HGF ELISA (איור 1)

1. לאחר שסיימתי את IL-2Rα ELISA ומבטיח בדיקה לא יהיה צורך לחזור, 60 μl של פלזמה לא מדוללת יהיה מועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 60 μl של BSA 1% בx PBS 1 נוסף לכל גם לעשות צלחת 1:02 מדוללת פלזמת מקור.
2. צלחת מבחן HGF היא שטפה, נחסמה במשתגע בכפות, וההתקן מחדש ועקומת סטנדרט 8-נקודה מוכנה לפרוטוקול יצרן.
3. לאחר שטיפת הצלחת בעקבות צעד החסימה, 50 μl של פלזמה מדוללת 01:02 הוא מצופה בשני עותקים על צלחת מבחן ELISA, ו 50 μl של כל התקן מצופה בשני עותקים. הצלחת היא חתומה ודגר לילה בטמפרטורת חדר במסובב צלחת להגדיר ב 300 סל"ד.
4. הפלזמה המדוללת 1:02 היא קולח מצלחת מבחן ELISA HGF והניחה חזרה בצלחת מקור הפלזמה המדוללת 1:2. ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה ל450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו.

6. יום הניסוי 2: Elafin ELISA

1. 10 μl של פלזמה חייה יועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 190 μl של BSA 1% בx PBS 1 יתווסף לכל אחד גם לעשות 200 μl של 1:20 dluted פלזמה.
2. Elafin ELISA כפי שמתבצע על פי פרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן), והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו.

7. הניסוי דאy 2: TNFR1 ELISA

1. 25 μl של BSA 1% בPBS יתווסף לצלחת המקור 01:20 (כרגע מכיל 100 μl של 1:20 פלזמה) כדי לקבל 125 μl של פלזמה מדוללת 1:25.
2. TNFR1 ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו.

8. יום הניסוי 2: IL-8 ELISA

1. 60 μl של פלזמה מדוללת 01:02 יהיה מועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 180 μl של IL-8 diluent נוסף לכל גם להפוך את צלחת מקור פלזמה מדוללת 01:06.
2. IL-8 ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו.

ברגע שכל ELISAs כבר הושלם, unuseד מניית פלזמה תוחלף לaliquots הפשיר והוקפאה לשימוש עתידי.

תוצאות

עבודת הסמנים הביולוגיות וציר הזמן מפורטת בטבלת 1 וטבלה 2, בהתאמה. לאחר השלים, ריכוזים של 6 חלבונים שונים יש כעת לכמת באותו מדגם הפלזמה באמצעות סך של 150 μL של פלזמה. ציפוי הדגימות בכפילות למבחן מאפשר להבטחת איכות הפנימית, עם פחות מ 10% של קורות החיים למצב אופטימליים. אם ביצוע ELISA הרציף על צלחות מרובות, צפיפות אופטית עקבית של הרמה הגבוהה והם העדיפו לאפשר לאמינות משופרת בין צלחת של מדידות, עקומת מכנסי הש"כ סטנדרטיים ניתן להשוות בין הצלחות להסתכל להעריך לחוסר עקביות בביצועי ELISA (איור 2). זמני פיתוח באמצעות מצע colorimetric tetramethylbenzidine וריכוז מכנסי הש"כ גבוהים נצפו עבור כל סמן ביולוגי במעבדה שלנו מופיעים בלוח 3.

tp_upload/4247/4247fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
איור 1. זרימת עבודה לIL-2Rα, REG3α וHGF ELISAs. לאחר שדגימות הפלזמה היו מצופית על צלחות בדיקת ELISA IL-2Rα הוא קולח לעשות צלחות מקור לדילול ELISAs אחר. לHGF ELISA, הפלזמה היא קולח להכין צלחת הדילול 01:06 לIL-8. לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.

איור 2. צפיפות אופטית לעקומה הסטנדרטית של 7 צלחות שונות ELISA מדידת ריכוזים מתאימים ל1084 החולים שנבדקו לדו"ח הראשוני REG3α GI GVHD סמן ³ REG3α. מכנסי הש"כ עקביים בין הצלחות להבטיח מדידות ריכוז חלבון עקביות בין צלחות. ריכוזים של חלבוניםבפלזמת דגימות מחושבות על ידי השוואה לדוגמה צפיפויות אופטיות לצפיפות האופטית עקומת הסטנדרט.

יום הניסוי 0	1. הכן את הדגימות
	2. IL-2Rα, HGF וREG3α הלכידה Ab
יום ניסוי 1	1. IL-2RαELISA
	2. REG3αELISA
	3. HGF ELISA (באמצעות ציפוי מדגם)
	4. Elafin וTNFR הלכידה Ab
יום הניסוי 2	1. השלמת HGF ELISA
	2. Elafin ELISA
	3. TNFR1 ELISA
	4. IL-8 ELISA
	5. Refreeze שאינו בשימושפלזמה

טבלת 1. סקירת זרימת סמנים ביולוגי GVHD

יום 0		הכנת דוגמאות ודגירת גוף לכידת הלילה
ELISA		IL-2Rα	REG3α	HGF	Elafin	TNFR1	IL-8
זמן (שעות)	0.0	חסימה
	1.0	דגימות המצופות
	3.0	טיב דגימות פלזמה; האיתור Ab	דוגמאות כן (1:10 דילול); חסימה
	4.0		דגימות מצופות (1:10)
	5.0	Streptavidin-HRP	האיתור Ab
	5.5	TMB	Streptavidin-HRP
	6.0	קריאת פלייט	TMB	דגימות כן (1:2 דילול); חסימה
	6.5		קריאת פלייט
	7.0			דגימות מצופות (1:2)	צלם Ab (דגירת הלילה)	צלם Ab (דגירת הלילה)
יום 2
זמן (שעות)	0.0			טיב פלזמה, האיתור Ab	דגימות כן (1:20); חסימה
	1.0				ציפוי לדוגמה (1:2)	חסימה; דילול נוסף של 1:20 דגימות לדילול 1:25
	2.0			HRP		ציפוי לדוגמה (1:25)
	2.5			TMB
	3.0			קריאת פלייט	האיתור Ab
	3.5						הכן דגימות (01:06 דילול)
	4.0					האיתור Ab	ציפוי לדוגמה (1:06)
	5.0				HRP
	5.5				TMB
	6.0				קריאת פלייט	האיתור Ab
						TMB
	7.0					קריאת פלייט	TMB
	7.5						קריאת פלייט
לאחר השלים		החלף פלזמת מקור לaliquots ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר

HRP

טבלת 2. ציר זמן לביצוע ELISAs.

	גורם דילול פלזמה	ריכוז גבוה סטנדרטי	זמן פיתוח תשתית (דקות)	הגבוה OD	עקומה
IL-2Rα	01:01	2000 pg / ml	5	1	קווים
HGF	01:02	4000 pg / ml	22	2.1	4-פרמטר
IL-8	01:06	200 pg / ml	12	2.7	4-פרמטר
REG3α	1:10	100 ng / ml	12	1.7	4-פרמטר
Elafin	1:20	2000 pg / ml	20	1.9	4-פרמטר
TNFR1	1:25	800 pg / ml	8	2.7	קווים

לוח 3. פרטי ELISA ל6 סמני GVHD.

דיון

שיטת ELISA הרציפה מוצגת כאן מאפשרת מדידה של חלבוני פלזמה מרובות בנפחים קטנים של פלזמה שעשויה להיות קשה להשגה ו / או תחליף כגון דגימות מבני אדם עם מחל נדירות או דגימות פלזמה שהתקבלו בעכברי ^9,10. את ELISAs הרציף מבוצעים בדרך כלל בצו של גורם דילול פלזמה גוברת, עם ELISAs דורש פלזמה מדוללת ≥ 1:10 בדרך כלל לא זקוק לשם תיקח, למרות שזה יכול להיעשות אם רוצה. היכולת לבצע ELISA סדרתית מוגבלת על ידי ערכות ELISA / פרוטוקולים שבפלזמה היא מעורבת עם חומרים כימיים אחרים או למאגרי שדילול שונים נדרשות לפלזמה, זה מונע ablility לדגימה מחדש להשתמש בשל חששות שאינם תואמים חיץ / מגיב יפריע לביצועים של בדיקה מסוימת. עם תכנון קפדני, 10 או יותר ELISAs יכול להיות מבוצע באותה דגימת פלזמה.

ent "> מעבדות בודדות הנדרשות להסתגל דילולי פלזמה על מנת שתהיינה תוצאות לפירוש המבוססות על ריכוזי פלזמה צפויות של החלבון של עניין בדגימות מהנבדקים. הבדלים בציוד מעבדה עלולה לגרום לצורך לייעל את הדגירה והתפתחות colorimetric פעמים, מספר הכביסות ו / או לשטוף לספוג פעמים על מנת לייעל את כל ELISA נתון.

כדי להגדיל את כושר תפוקה גבוהה ודיוק ולבצע ניתוחים באופן יעיל וחסכוני, השימוש בפלטפורמה רובוטית טיפול נוזל מסוגלת לבצע ניתוחים על 384 גם צלחות ומכונת כביסת צלחת אוטומטית עם יחידה לערום מומלץ. ציוד זה יכול להגביר את הדיוק והדיוק של ניתוח שבוצע על ידי משתמשים מרובים, ויעזור לספק עקביות של ניתוח כדי להפחית ובין שונות התוך assay.

אנחנו השתמשנו ELISA הרציף על גבי פלטפורמות זמינות זמנית משתי סיבות: 1) רובזוגות נוגדנים לחלבונים חדשים לא יכולים בקלות להיות מצומדת בחרוזים או חומר אחר, כמו גם זמן רב ויקרים: 2) מבחני ELISA בודדים הם מדויקים יותר מאשר microarray זמנית או חרוזים, משני להעדר תגובה צולבת ^11. אם שיטה אמינה הוא הוקם כדי לבצע microarrays multiplexed, חרוז מבוסס, זה עשוי להיות מסוגל להחליף את תהליך ELISA הרציף, אך הוא עשוי להיות מוגבל על ידי היכולת להטות את הנוגדנים לחרוזים ו / או במספר החלבונים הרצויים להיות מנותח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
אדם IL-2 R אלפא Duoset	מו"פ מערכות	DY223
האדם HGF Duoset	מו"פ מערכות	DY294
IL-8 אדם OptEIA KIT השני	הקיטון דיקינסון	550999
Ab-התאמת ההרכבה האנושית PAP1 (REG3α) ערכה	MBL הבינלאומי	5323
Ab-התאמת UNIVERSAL קיט	MBL הבינלאומי	5310
אדם sTNFRI/TNFRSF1A Duoset	מו"פ מערכות	DY225
אדם Trappin-2/Elafin Duoset	מו"פ סאיםנובע	DY1747
96-גם צלחות תחתונות חרוטי קלקר	Thermo Scientific	249570	משמש לצלחות מקור פלזמה
כוכב משנה חצי גם גבוהה מחייבות צלחות 96-כן	קורנינג	3690	לIL-2Rα, HGF, TNFR1 וelafin ELISAs
Nunc צלחות MaxiSorp 384 גם	Nunc	464718	לREG3α אליסה
HyClone נאגר מלוח פוספט, 1x	Thermo Scientific	SH30256.02
שור סרום אלבומין, Fraction V, הלם טיפול בחום	הפישר סיינטיפיק	BP1600-100
החוסם משתגע בTBS	Thermo Scientific	37530	סוכן חסימה לIL-2Rα HGF וTNFR1 ELISAs
Dulbecco שלפוספט נאגר מלוח	Gibco	21600-069	לשטוף חיץ לIL-2Rα, HGF, Elafin וTNFR1 ELISAs
Susbtrate החמצן TMB	Kirkegaard ומעבדות פרי	50-76-00
20 Tween	אורגניקס acros	233362500	לשטוף חיץ לIL-2Rα, HGF, Elafin וTNFR1 ELISAs
חומצה גופרתית	סיגמה אולדריץ	84720	(דילול ל2N) ללהפסיק פתרון